JP3964368B2 - 新しい遺伝子型のｃｍｓダイコン系統のカルス及び植物体並びにこれから生産された雑種種子 - Google Patents
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Description
本発明は、新しい遺伝子型の細胞質雄性不稔（cytoplasmic male sterility：以下、単に「ＣＭＳ」と記載する場合もある）ダイコン系統のカルス及び植物体並びにこれから製造された雑種種子及びＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統の植物体選抜用ＤＮＡ標識因子に関するものである。より詳しくは、配列番号５または６の塩基配列を含有するＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統のカルスと、前記カルスから誘導され、組織培養により無性繁殖されるダイコン系統植物体と、前記植物体を雄性不稔を導入しようとする植物体と交配して製造された雑種種子と、配列番号５または６で表される塩基配列を有するＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統の植物体選抜用ＤＮＡ標識因子に関するものである。
雄性不稔（male sterility）は、花粉、葯、雄蕊などの雄性器官に異常が生じて不稔が起こる現象である。雄性不稔には、遺伝的原因によるものと、環境の影響によるものがあるが、雄性器官のうち花粉の不稔により起こる場合が最も多い。花粉の不稔が起こる遺伝的原因には、染色体に異常が生じて花粉母細胞の減数分裂に混乱が起こる場合と、核内遺伝子や細胞質因子（cytoplasmic factor）の突然変異により花粉母細胞を取り囲むタペート細胞（tapetal cell）に異常が生じて、花粉が成熟途中に破壊される場合がある。
前者では雌蕊などの雌性器官にも異常が生じるが、後者では花粉のみが不稔になり、雌性器官は受精能力を有する。従って、雌性器官は正常的に受精能力を有し、花粉のみが不稔になる後者の雄性不稔を、交配母本に導入すると、人工交配で花粉を除去する除雄（castration）を行う必要がないため、雑種種子を改良・育成する雑種強勢育種法におけるＦ１採種（seed-gathering）に利用することができる。
核内遺伝子による雄性不稔は、「核遺伝子雄性不稔（genic male sterility）」と言われるが、これは、主に劣性遺伝をし、劣性同型（homozygously recessive）である場合に不稔性を有する。従って、これを用いてＦ１雑種種子を生産する場合、約５０％のみの不稔株を得ることができるので、Ｆ１個体の稔性を確認するためには、必ず各個体を開花させて花粉の生成有無を確認する過程が必要である。また、雄性不稔系の維持及び増殖にも多くの努力が必要であり、作物によっては花が小さくて稔性の判別が難しく、花が咲くまで長時間がかかる作物には適用し難い。
一方、細胞質因子による雄性不稔は、「細胞質雄性不稔（cytoplasmic male sterility：ＣＭＳ」と言われるが、これは、細胞質要因によりミトコンドリアが正常的な機能を果たせず、非正常的な花粉を生成することによって、自家受精能力を有しない現象をいう。ＣＭＳは、母系遺伝（maternal inheritance）であって、いずれの可稔系を交配しても１００％不稔株が得られるので、雄性不稔系の維持が非常に容易であり、葉、幹など栄養器官を利用する作物に適用するのが非常に便利である。
このような理由で、雑種種子生産にＣＭＳを利用しようとする試みが続いており、このために多くの植物体のＣＭＳに対する分子水準の研究が進んで来た。その結果、ＣＭＳを起こす多くの細胞質要因が明らかになった。現在、アブラナ科（Cruciferae family）作物のうちＣＭＳを有する系統として、アブラナ属（Brassica sp.）では、ポリマ（Polima）、オグラ（Ogura）、ナプス（Napus）、アナンド（Anand）などが知られており、ダイコン属（Raphanus sp.）ではオグラ（Ogura）、コセナ（Kosena）などが知られている。これらの系統は、いずれも細胞質内のミトコンドリア遺伝子の構造的変形または新しいORF(open reading frame)の生成により、ＣＭＳを起こすと報告されている（非特許文献１〜３）。
現在まで知られたＣＭＳダイコン系統のうちオグラ−ＣＭＳ系統が、雄性不稔の導入率及び安定性の面において、最も優秀であると知られている。従って、ダイコンのＦ１雑種種子生産に、オグラ−ＣＭＳ系統を主に使用している。しかし、オグラ−ＣＭＳ系統の雄性不稔は、完全な細胞質要因により起こるものでなく、核内要因によっても影響を受けるものと明らかになった。また、オグラ−ＣＭＳ系統を、雑種種子生産のための交配母本として利用した場合、育種系によってＣＭＳの導入可否が顕著に異なると知られている。このような問題点により、オグラ−ＣＭＳ系統を用いたＦ１雑種種子生産は、限界があると指摘されて来た。
従って、Ｆ１雑種種子に対して高い雄性不稔導入率を有する新しいＣＭＳダイコン系統に関する開発の必要性が切実に要求されている。しかし、微生物の分離・同定過程とは異なり、植物のＣＭＳ特性を確認する過程は多くの時間と努力を必要とするため、これに対する開発が活発に進んでいない実情である。
一方、植物育種では、特定形質を有する系統を選抜するために、前記形質と関連した特性を標識因子として利用する。過去には、形態的特性（例：花色）の変移による標識因子を利用したが（非特許文献４）、殆どの形態的標識因子は、環境によって変化する可能性があるだけでなく（例：キュウリの遺伝子de（determinate habit gene of cucumber））、標識因子の数が非常に制限されているという短所がある。
これにより、最近、ＤＮＡ塩基配列水準で現れる変移を利用する分子標識因子（ＤＮＡ標識因子）を開発しようとする研究が進んでいる。ＤＮＡ標識因子は、形態的標識因子に比較できない程度、植物体にたくさん存在しており、植物体の機能や生理に障害を与えないため、標識因子として利用するのに有利である（非特許文献５）。ダイコン属のＣＭＳ系統において、オグラ−ＣＭＳ系統及びコセナ−ＣＭＳ系統に対するＤＮＡ標識因子は、既に開発されている。前記標識因子を増幅するためのプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、各系統に特異的な標識因子（ＰＣＲ産物）の検出によって各ＣＭＳ系統を選抜することができる。従って、Ｆ１雑種種子に対して高い雄性不稔導入率を有する新しいＣＭＳダイコン系統の開発と共に、これを選抜するための標識因子の開発も要求されている。
Cardi, T. et al., Theor. Appl. Genet., 94:204-212,1997 Grelon, M. et al., Mol. Gen. Genet., 243(5):540-547,1994 Iwabuchi, M. et al. Plant Mol. Biol., 39(1):183-188,1997 Staub, J.E. et al., HortScience, 31(5):729-741,1996 ones, N. et al., New Phytol., 137:165-177,1997
Cardi, T. et al., Theor. Appl. Genet., 94:204-212,1997 Grelon, M. et al., Mol. Gen. Genet., 243(5):540-547,1994 Iwabuchi, M. et al. Plant Mol. Biol., 39(1):183-188,1997 Staub, J.E. et al., HortScience, 31(5):729-741,1996 ones, N. et al., New Phytol., 137:165-177,1997
本発明の目的は、新しい遺伝子型の細胞質雄性不稔特性を有するＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統のカルスと、前記カルスから誘導され、組織培養により無性繁殖されるＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統植物体及びその製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統植物体を、雄性不稔を導入しようとする雄性可稔ダイコン系統植物体と交配して製造された、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統の雑種種子及びその製造方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統植物体選抜用ＤＮＡ標識因子、及び、前記ＤＮＡ標識因子を増幅するためのプライマーを提供することにある。
これにより、本発明者は、新しいＣＭＳダイコン系統を開発するために研究を重ねた結果、従来知られたオグラ−及びコセナ−ＣＭＳダイコン系統とは異なる遺伝子型のＣＭＳを有するＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統を分離・同定し、前記ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統のＦ１植物体に対する雄性不稔導入率が、従来Ｆ１雑種種子生産に利用されるオグラ−ＣＭＳダイコン系統より高いことを確認すると共に、前記ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統に特異的なＤＮＡ標識因子を開発することによって本発明を完成した。
本発明によるＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統の植物体は、Ｆ１植物体に対する雄性不稔導入率が高いため、ＣＭＳ系統の雑種種子の生産に非常に有用に利用され得る。
本発明において「ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統」とは、本発明で分離・同定したダイコン系統であって、従来ＣＭＳとは異なる新しい遺伝子型のＣＭＳを有するダイコン系統を意味する。
本発明は、新しい遺伝子型の細胞質雄性不稔特性を有し、配列番号５及び配列番号６の塩基配列を含有することを特徴とするＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統のカルス（寄託番号：ＫＣＴＣ １０３３９ＢＰ）を提供する。
また、本発明は、前記カルスから誘導され、組織培養により無性繁殖されるＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統植物体を提供する。
また、本発明は、（ａ）請求項１のカルスから新梢（shoot）を誘導する段階と、（ｂ）前記新梢が形成されたカルスから抜根を誘導する段階と、（ｃ）前記抜根が形成されたカルスを土壌改良及び再分化過程を経て、植物体を形成する段階と、を備えることを特徴とするＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統植物体の製造方法を提供する。
また、本発明は、前記ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統植物体を、雄性不稔を導入しようとする雄性可稔ダイコン系統植物体と交配して製造された、ＣＭＳダイコン系統雑種種子及びその製造方法を提供する。
また、本発明は、配列番号５及び配列番号６で表される塩基配列を有するＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統植物体選抜用ＤＮＡ標識因子と、前記標識因子を増幅するためのプライマーと、前記プライマー及びＰＣＲ反応混合物を含むＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統植物体の選抜キットとを提供する。
前記プライマーは、配列番号１及び２、または配列番号３及び４のプライマー対であることを特徴とする。
本発明者は、新しい遺伝子型のＣＭＳを有するダイコン系統を開発するために、中国吉林省地域の野生青皮ダイコン約１００余種を対象にし、ＣＭＳ特性を保有しているダイコンを選抜した。野生青皮ダイコンを交配母本にし、雄性可稔個体と交配を実施した。ＣＭＳの確認は、前記野生青皮ダイコンを雄性可稔系統と交配して生産されたＦ１個体を、さらに雄性可稔系統と戻し交雑（back cross）を実施してＦ２個体を生産した後、生産されたＦ２個体の花粉生成有無を調べることによって行った。
この時、Ｆ２個体から雄性可稔と雄性不稔が両方とも検出されると、交配母本の雄性不稔は、核内因子と細胞質因子により起こったものである。また、雄性不稔個体のみが検出されると、純粋な細胞質因子により雄性不稔が起こったものである。数回の検査により最終的にＣＭＳ特性を安定的に保有していると確認されたダイコンを選抜した。
次に、選抜されたダイコンのＦ１個体に対する雄性不稔導入率を調べるために、前記選抜されたダイコンを交配母本とし、Ｆ１雑種種子を生産した。その結果、他の系統との交配による前記ダイコンの雄性不稔導入率が、従来Ｆ１採種に利用されるオグラ−ＣＭＳダイコン系統に比べて、顕著に高いということを確認した（表１参照）。
次に、本発明者は、前記ダイコンが従来知られたＣＭＳダイコン系統であるか否かを確認するために、オグラ−及びコセナ−ＣＭＳダイコン系統に特異的なＤＮＡ標識因子を増幅するためのプライマーを用いてＰＣＲを行った。その結果、本発明で選抜されたダイコンでは、オグラ−及びコセナ−ＣＭＳダイコン系統に特異的なＤＮＡ標識因子が検出されなかった（図１参照）。これにより、本発明で選抜されたダイコンが従来知られたＣＭＳダイコン系統と異なる系統であることを確認し、「ＮＷＢ−ＣＭＳ」と命名した。
本発明によるＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統の植物体は、当業界で公知である一般の組織培養方法により無性繁殖することができる。例えば、アブラナ系野菜、ダイコンなどのアブラナ科植物の組織培養に容易な器官発生による微細増殖法（形成された器官のない葉、葉袋、幹節、子葉、子葉軸などの組織を培養し、新しい芽を前記組織の表面に誘導する方法）またはカルス誘導による再分化方法などで無性繁殖することができる。
具体的に、本発明では、系統の種子を１／２ＭＳ培地に置床して培養した後、４日目僅かの葉柄を含む子葉を剥がし、これをＭＳ培地で分化させてカルスを誘導した。その後、前記カルスから新梢を誘導し、新梢が形成されたカルスを根誘導培地に移し、抜根を誘導した。次に、土壌改良及び再分化過程を経て完全な植物体に成長させた。本発明者は、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統のカルスを２００２年９月１８日付で韓国生命工学研究院（Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology：KRIBB）遺伝子銀行に寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ １０３３９ＢＰ）。
本発明によれば、前記ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統の植物体を、雄性不稔を導入しようとする植物体（雄性可稔ダイコン系統）と交配させることによって、Ｆ１雑種種子を生産することができる。
本発明の雑種種子生産方法は、あらゆる雄性可稔系統に適用することができ、その例としては、ソウルボム（seoul spring）１５２３、ソウルボム１９７８、総太１６４２、晋州大坪３４０、時無１４６２、聖護院５２、総太１９６８、総太２０１５、１９３４（義城半青と総太の分離系統）、Ｍｎ００２、Ｍｎ００３、ＹＢ−１、１８２５（青皮と総太の分離系統）、ＡＤ１００２、Ｍｎ００６、三季ボム１６３４、宮重総太ＪＡ０４６、宮重総太ＪＡ０４８、宮重総太ＪＡ０４９、宮重総太ＪＡ０５３、宮重総太１６４２、宮重総太１９２１、宮重総太１９２３、宮重総太１９２９、宮重１７０６、晩抽宮重２００４、晩抽総太１９１６、晩抽総太１９１７、晩抽総太１９１８、美濃２１１３、ソウルボム１８６１、ソウルボム２０６４、聖護院１８７７、聖護院１９４７、龍ケン１７０９、円白分離Ｍｎ００５、円白分離１９３５及び総太１９４６などがある。
一方、図１から、従来知られたオグラ−及びコセナ−ＣＭＳ系統選抜用ＤＮＡ標識因子では、本発明によるＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統を選抜できないと確認されたが、前記オグラ−及びコセナ−ＣＭＳダイコン系統に特異的な標識因子では、本発明のＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統と雄性可稔系統を区分できなかった。従って、本発明者は、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統に特異的なＤＮＡ標識因子を開発するための基礎作業として、アブラナ科内に存在する多様なＣＭＳ系統間のＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）を分析した。
具体的に、本発明では、近縁種間の細胞質区別に非常に有用で、豊富な系統学的資料を提供するミトコンドリアＤＮＡのＲＦＬＰを行った。各系統で抽出した総ＤＮＡを６個の制限酵素（BamH I, Dra I, EcoR I, EcoR V, Hind 3及びXba I）で各々切断して電気泳動した後、サザンブロットを実施してＲＦＬＰパターンを比較した。
この時、プローブとしては、アブラナ科植物の１つであるシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）から明らかになった３２個のミトコンドリア遺伝子を利用した（表２参照）。ＲＦＬＰの結果により多形性のある部位（polymorphic site）を探索することができたが、プローブとして利用した３２個の遺伝子のうち、ａｔｐ６及びａｔｐ９遺伝子の３'部分に変移が起こったことを確認した（図２及び図３参照）。
また、各遺伝子のＲＦＬＰパターンを比較した結果、ｎａｄ３遺伝子をプローブとして使用した場合は、ａｔｐ６遺伝子及びａｔｐ９遺伝子をプローブとして使用した場合と、それぞれ類似したバンドパターンが現れることを確認することができた（図４及び５参照）。この結果から、ミトコンドリアゲノム上において、ａｔｐ６遺伝子及びａｔｐ９遺伝子が、ｎａｄ３遺伝子と隣接した位置に存在すると推定された。
本発明者は、前記ＲＦＬＰ分析結果を参考にして、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統に特異的なＤＮＡ標識因子を選抜した。このために、ａｔｐ６遺伝子及びｎａｄ３遺伝子の塩基配列を参考にして、ａｔｐ６遺伝子の5'部分とｎａｄ３遺伝子の間を増幅するための正方向及び逆方向プライマーを製作した。前記プライマーを各々「ｉａ６ｆ」、「ｒｎ３ｆ」と命名し、これらの塩基配列を配列番号１及び２と記載した。前記プライマーを利用し、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統のＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲを行った結果、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統でのみ約1.8kbサイズのバンドが検出されたことを確認することができた（図６Ａ参照）。
また、ａｔｐ９遺伝子及びｎａｄ３遺伝子の塩基配列を参考にして、ａｔｐ９遺伝子の3'部分とｎａｄ３遺伝子の間を増幅するための正方向及び逆方向プライマーを製作した。前記プライマーを各々「ｉａ９ｆ」、「ｎ３１ｒ」と命名し、これらの塩基配列を配列番号３及び４と記載した。その後、前記プライマーを用いてＰＣＲを行った結果、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統でのみ約2.3kbサイズのバンドが検出されたことを確認することができた（図６Ｂ参照）。
また、本発明者は、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統に特異的なＤＮＡ標識因子の塩基配列を分析した。本発明によるＤＮＡ標識因子の１つである、ｉａ６ｆ及びｒｎ３ｆプライマーにより増幅されるＰＣＲ産物の塩基配列を配列番号５と記載した。本発明によるＤＮＡ標識因子の他の１つである、ｉａ９ｆ及びｎ３１ｒプライマーにより増幅されるＰＣＲ産物の塩基配列を配列番号６と記載した。
本発明の標識因子を提供するためのプライマーには、配列番号５または配列番号６のＤＮＡ標識因子を増幅するために、当業者がデザインできるあらゆるプライマーが含まれる。その一例としては、本発明で製作した配列番号１及び２で表される塩基配列を有するｉａ６ｆ及びｒｎ３ｆプライマー、配列番号３及び４で表される塩基配列を有するｉａ９ｆ及びｎ３１ｒプライマーがある。
本発明のＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統選抜キットに含まれるＰＣＲ反応混合物には、ＰＣＲ反応に必要な一般の物質、例えばＴａｑポリメラーゼ（polymerase）、反応緩衝溶液、ｄＮＴＰ混合物、MgCl2、ＢＳＡ及び適量の水などが含まれる。また、本発明によるキットには、ＰＣＲ産物の検出可否を確認することができるアガロースと電気泳動緩衝溶液がさらに含まれる。
作物育種において、迅速性、正確性及び敏感性の高いＰＣＲ技術を用いてＤＮＡ標識因子を検出すれば、努力と経費が少なくかかるだけでなく、目標形質をより正確に選抜できると知られている。従って、本発明によるプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、前記プライマーにより増幅される本発明によるＤＮＡ標識因子の検出可否を調べることによって、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統をより迅速でかつ正確に選抜できる。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するだけで、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統の開発及びこれを用いたＦ１雑種種子生産
本発明者は、新しい遺伝子型のＣＭＳを有するダイコンを開発するために、中国吉林省地域の野生青皮ダイコン１００余種を対象にし、花器組織（flower organ tissue）の花粉発達及び自家受精程度を調べて、１次的に雄性不稔の特性を保有していると判定されるダイコン２０種を選抜した。その後、選抜されたダイコンを対象にして、さらに２次調査を実施し、最終的にＣＭＳ特性を保有している１つのダイコンを選抜した。この時、ＣＭＳの確認は、雄性可稔系統と交配を実施して生産されたＦ１個体を、さらに雄性可稔系統と戻し交雑をしてＦ２を生産した後、生産されたＦ２個体の花粉生成有無を調べることによって行った。
本発明者は、新しい遺伝子型のＣＭＳを有するダイコンを開発するために、中国吉林省地域の野生青皮ダイコン１００余種を対象にし、花器組織（flower organ tissue）の花粉発達及び自家受精程度を調べて、１次的に雄性不稔の特性を保有していると判定されるダイコン２０種を選抜した。その後、選抜されたダイコンを対象にして、さらに２次調査を実施し、最終的にＣＭＳ特性を保有している１つのダイコンを選抜した。この時、ＣＭＳの確認は、雄性可稔系統と交配を実施して生産されたＦ１個体を、さらに雄性可稔系統と戻し交雑をしてＦ２を生産した後、生産されたＦ２個体の花粉生成有無を調べることによって行った。
次に、本発明者は、選抜されたＣＭＳダイコン系統が、Ｆ１採種のための交配母本として使用できるか否かを確認するために、雄性不稔の導入が必要である育種系統との交配実験を行った。この時、ＣＭＳを導入する育種系統には、下記表１に記載された１６種類の育種系統（（株）農牛バイオ社）を使用し、対照群には、従来雑種種子生産に主に利用されるオグラ−ＣＭＳダイコン系統を使用した。この時、前記オグラ−ＣＭＳダイコン系統には、白光（興農種苗）、献夏（日本サカタ種苗）及び冬みね（日本サカタ種苗）を使用した。生産されたＦ１雑種種子への雄性不稔の導入可否は、花器組織の花粉発達及び自家受粉程度を調べて確認した。オグラ−ＣＭＳダイコン系統を利用した実験（対照群）で、一つのオグラ−ＣＭＳダイコン系統（白光）からＣＭＳが導入されたことと明確に確認された場合には、他のオグラ−ＣＭＳ系統（献夏及び冬みね）との交配実験を行わなかった。
その結果、下記表１に記載された通り、オグラ−ＣＭＳダイコン系統を交配母本として利用した場合には、１６種類の育種系統のうち約５０％程度でのみ雄性不稔系統が検出され、またオグラ−ＣＭＳダイコン系統のＣＭＳ導入可否が系統別に顕著に差異が生じることを確認することができた。
一方、本発明で選抜されたＣＭＳダイコン系統を交配母本として利用した場合には、１６種類のあらゆる育種系統で雄性不稔系統が検出されたことを確認することができた。また、宮重総太ＪＡ０４６、宮重総太ＪＡ０４８、宮重総太ＪＡ０４９、宮重総太ＪＡ０５３、宮重総太１６４２、宮重総太１９２１、宮重総太１９２３、宮重総太１９２９、宮重１７０６、晩抽宮重２００４、晩抽総太１９１６、晩抽総太１９１７、晩抽総太１９１８、美濃２１１３、ソウルボム１８６１、ソウルボム２０６４、聖護院１８７７、聖護院１９４７、龍ケン１７０９、円白分離Ｍｎ００５、円白分離１９３５及び総太１９４６との交配実験でも、１００％雄性不稔系統が検出されたことを確認することができた。
これにより、本発明で選抜されたＣＭＳダイコン系統の雄性不稔導入率が、従来オグラ−ＣＭＳダイコン系統より非常に優秀であることを確認することができた。また、本発明で選抜されたＣＭＳダイコン系統が、Ｆ１雑種種子生産のための交配母本として、一層優秀であることを確認することができた。
本発明で選抜されたＣＭＳダイコン系統のＣＭＳ遺伝子型の確認
他の系統との交配によるＣＭＳ導入能力において、前記実施例１から選抜されたＣＭＳダイコン系統が、従来知られたオグラ−ＣＭＳダイコン系統に比べて顕著に優秀であることを、前記実施例１から確認した。その後、本発明者は、前記ＣＭＳダイコン系統が、従来知られたＣＭＳダイコン系統と同一系統なのか、それとも新しいＣＭＳ系統なのか確認するために、オグラ−及びコセナ−ＣＭＳダイコン系統選抜用プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。
他の系統との交配によるＣＭＳ導入能力において、前記実施例１から選抜されたＣＭＳダイコン系統が、従来知られたオグラ−ＣＭＳダイコン系統に比べて顕著に優秀であることを、前記実施例１から確認した。その後、本発明者は、前記ＣＭＳダイコン系統が、従来知られたＣＭＳダイコン系統と同一系統なのか、それとも新しいＣＭＳ系統なのか確認するために、オグラ−及びコセナ−ＣＭＳダイコン系統選抜用プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。
２−１）オグラ−ＣＭＳダイコン系統選抜用プライマーを用いたＰＣＲ実施
まず、本発明で選抜されたＣＭＳダイコン系統からＤＮＡを分離した後、これを鋳型にして、配列番号７及び８で表される塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、（株）バイオニア社のＰＣＲキット（AccuPower Premix）を用いて行った。
まず、本発明で選抜されたＣＭＳダイコン系統からＤＮＡを分離した後、これを鋳型にして、配列番号７及び８で表される塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、（株）バイオニア社のＰＣＲキット（AccuPower Premix）を用いて行った。
反応条件は、９５℃で５分間、前変性化（pre-denaturation）させた後、９５℃で３０秒；５５℃で３０秒；及び７２℃で１分を１サイクルとし、３０回繰り返した後、７２℃で１０分間最終反応させた。この時、対照群としては、１０種類のオグラ−ＣＭＳダイコン系統、遺伝子型が確認されないＣＭＳ系統（円白）、２種類の雄性可稔系統（ＭＦ１及びＭＦ２）を使用し、これらに対する情報は表４に記載した。その後、１％アガロースゲル電気泳動を行った。
その結果、図１のＡに示したように、既存のオグラ−ＣＭＳダイコン系統では、540bpサイズのバンドが検出されたが、本発明によるＣＭＳダイコン系統では検出されなかった。また、雄性可稔系統であるＭＦ１及びＭＦ２、遺伝子型が明らかでない雄性不稔系統の円白においても、バンドが検出されなかったことを確認することができた。
２−２）コセナ−ＣＭＳダイコン系統選抜用プライマーを用いたＰＣＲ実施
配列番号９及び１０で表される塩基配列を有するプライマーを用いて、前記参考例２−１）と同様な方法によりＰＣＲを行った。この時、対照群としては、前記参考例２−１）と同様なダイコン系統を利用した。前記プライマーを用いてＰＣＲを行うと、コセナ−ＣＭＳダイコン系統の場合、約250bpサイズのバンドが検出され、オグラ−ＣＭＳダイコン系統の場合には、約278bpサイズのバンドが検出されると報告されたことがある（Yamagishi et al., Theor Appl Genet., 93：325-332, 1996）。
配列番号９及び１０で表される塩基配列を有するプライマーを用いて、前記参考例２−１）と同様な方法によりＰＣＲを行った。この時、対照群としては、前記参考例２−１）と同様なダイコン系統を利用した。前記プライマーを用いてＰＣＲを行うと、コセナ−ＣＭＳダイコン系統の場合、約250bpサイズのバンドが検出され、オグラ−ＣＭＳダイコン系統の場合には、約278bpサイズのバンドが検出されると報告されたことがある（Yamagishi et al., Theor Appl Genet., 93：325-332, 1996）。
その結果、図１のＢに示したように、オグラ−ＣＭＳダイコン系統では、約278bpサイズのバンドが検出されたのに対して、本発明によるＣＭＳダイコン系統及び雄性可稔系統では、コセナ−及びオグラ−ＣＭＳ系統に特異的なバンドが検出されなかったことを確認することができた。
前記結果から、本発明によるＣＭＳダイコン系統が、従来知られたオグラ−及びコセナ−ＣＭＳ系統とは異なる系統であることを確認することができ、これを「ＮＷＢ−ＣＭＳ」と命名した。
ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統のカルス誘導及び再分化
本発明によるＮＷＢ−ＣＭＳ系統の種子を１／２ＭＳ培地に置床して培養した後、４日目僅かの葉柄を含む子葉を剥がし、これをＭＳ培地（zeatin 5mg/liter, NAA 0.1mg/literを含む）から分化させ、カルスを誘導した。カルスを新梢誘導培地から新梢を誘導した後、新梢が形成されたカルスを根誘導培地に移し、１週間抜根を誘導した。
本発明によるＮＷＢ−ＣＭＳ系統の種子を１／２ＭＳ培地に置床して培養した後、４日目僅かの葉柄を含む子葉を剥がし、これをＭＳ培地（zeatin 5mg/liter, NAA 0.1mg/literを含む）から分化させ、カルスを誘導した。カルスを新梢誘導培地から新梢を誘導した後、新梢が形成されたカルスを根誘導培地に移し、１週間抜根を誘導した。
次に、抜根が誘導された幼植物体を選別して根の培地をきれいに洗浄した後、殺菌された土が入っている植木鉢に移し植えた。この時、１週間ビニールで植木鉢を覆い、徐々に環境に適応させた。約１週間後には、ビニールを除去して完全な植物体に再分化させた。本発明者は、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統のカルスを２００２年９月１８日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ １０３３９ＢＰ）。
ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統に特異的なＤＮＡ標識因子開発のためのＲＦＬＰ実施
前記実施例１及び２から、本発明者は、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統が従来ＣＭＳ系統とは完全に異なる系統であることを確認し、またオグラ−及びコセナ−ＣＭＳダイコン系統に特異的な標識因子では、雄性可稔系統及びＣＭＳの遺伝子型が明らかでない系統（円白）と、ＮＷＢ−ＣＭＳ系統とを区分できないことを確認した。従って、本発明者は、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統に特異的なＤＮＡ標識因子を開発するためにＲＦＬＰを行った。
前記実施例１及び２から、本発明者は、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統が従来ＣＭＳ系統とは完全に異なる系統であることを確認し、またオグラ−及びコセナ−ＣＭＳダイコン系統に特異的な標識因子では、雄性可稔系統及びＣＭＳの遺伝子型が明らかでない系統（円白）と、ＮＷＢ−ＣＭＳ系統とを区分できないことを確認した。従って、本発明者は、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統に特異的なＤＮＡ標識因子を開発するためにＲＦＬＰを行った。
４−１）ＲＦＬＰのためのプローブ（probe）製造
ＣＭＳは、細胞質内のミトコンドリアが正常的な機能を果たせず、非正常的な花粉を生成することによって、植物が自家受精能力を有しない現象である。これに、本発明者は、シロイヌナズナから明らかになったミトコンドリア遺伝子をＲＦＬＰのプローブとして使用するために、次のような実験によりプローブを製造した。
ＣＭＳは、細胞質内のミトコンドリアが正常的な機能を果たせず、非正常的な花粉を生成することによって、植物が自家受精能力を有しない現象である。これに、本発明者は、シロイヌナズナから明らかになったミトコンドリア遺伝子をＲＦＬＰのプローブとして使用するために、次のような実験によりプローブを製造した。
まず、下記表２に記載された３２個のシロイヌナズナのミトコンドリア遺伝子の塩基配列を参考にして、プライマーを製作し、各プライマーの配列を下記表３に記載した。３２個の遺伝子の塩基配列及びこの遺伝子情報は、ウンゼルト等の論文（Unseld, M. et al., Nature Genetics, 15：57-61, 1997）及びジェンバンク（Genbank）登録番号ＮＣ_００１２８４を参考にした。
次に、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統からＤＮＡを分離した後、これを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、（株）バイオニア社のＰＣＲキット（AccuPower Premix）を用いて行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間前変性化（pre-denaturation）させた後、９４℃で３０秒；５５℃で３０秒；及び７２℃で２分を１サイクルにして、３５回繰り返した後、７２℃で１０分間最終拡張（extension）させて反応を終結させた。その後、ＰＣＲ産物をゲル溶出(gel elution）により分離した。３２個の遺伝子のうち、下記表３のＮｏ．２５のｏｒｆ２４０遺伝子は、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統のＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲでは増幅されないので、シロイヌナズナのＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行うことによって得られた。
４−２）ＲＦＬＰ分析
ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統に特異的なＤＮＡ標識因子を開発するための基礎作業として、アブラナ科内に存在する多様なＣＭＳ系統間のＲＦＬＰを分析した。このために、ＮＷＢ−ＣＭＳ系統を含む下記表４のＮｏ．１〜８及びＮｏ．１５〜１７の雄性不稔及び雄性可稔系統を実験対象として使用した。
ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統に特異的なＤＮＡ標識因子を開発するための基礎作業として、アブラナ科内に存在する多様なＣＭＳ系統間のＲＦＬＰを分析した。このために、ＮＷＢ−ＣＭＳ系統を含む下記表４のＮｏ．１〜８及びＮｏ．１５〜１７の雄性不稔及び雄性可稔系統を実験対象として使用した。
各系統から当業界で公知されたＤＮＡの分離方法によって総ＤＮＡを分離した後、これを６個の制限酵素（BamH I, Dra I, EcoR I, EcoR V, Hind 3及びXba I）で各々切断（digestion）した。切断されたＤＮＡをアガロースゲルで電気泳動した後、これをナイロン膜に移してサザンブロットを実施した。この時、プローブとしては、前記実施例４−１）で得られた３２個のミトコンドリア遺伝子を利用した。このように、ＲＥＬＰを実施して３２個の遺伝子に対するＲＦＬＰパターンを比較した。
その結果、プローブとして使用した３２個の遺伝子のうち、１９個の遺伝子では、多形性（ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統に特異的なバンド）が現れなかった（結果図示せず）。また、残りの１３個の遺伝子のうちでも、ａｔｐ６及びａｔｐ９遺伝子を除外した１１個の遺伝子をプローブとして用いた場合には、６個の制限酵素のうち２個未満の制限酵素でのみ多形性が現れ、これは、単純な点突然変異（point mutation）により現れたと推定された。
しかし、ａｔｐ６遺伝子をプローブとして使用した場合、６個の制限酵素のうち、BamHI, DraI, EcoRI, EcoRV及びXbaIの５個の制限酵素で多形性が現れたことを確認することができ、そのうちEcoRV及びXbaIの結果を図２に示した。
また、ａｔｐ９遺伝子をプローブとして使用した場合には、DraI, EcoRI, EcoRV及びHind3の４個の制限酵素で多形性が現れたことを確認することができ、そのうちEcoRV及びHind3の結果を図３に示した。これにより、ａｔｐ６及びａｔｐ９遺伝子の場合に現れた多形性は、単純な点突然変異によるものでなく、ミトコンドリアゲノム内の遺伝子組み換え、欠失または挿入により現れたものと推定された。
一方、各系統のＤＮＡをEcoRとEcoRVに各々切断した後、ａｔｐ６遺伝子及びｎａｄ３遺伝子をプローブとし、サザンブロットを実施した場合、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統で類似したサイズのバンドが現れることを確認することができた（図４参照）。この結果から、ａｔｐ６遺伝子とｎａｄ３遺伝子が、ミトコンドリアゲノム上で互いに隣接した位置に存在すると推定された。
また、各系統のＤＮＡをDraIとEcoRVに各々切断した後、ａｔｐ９遺伝子とｎａｄ３遺伝子をプローブとし、サザンブロットを実施した結果、Dra1の場合には、あらゆる系統で類似したバンドが現れ（図５Ａ参照）、EcoR5の場合には、オグラ−ＣＭＳダイコン系統で類似したサイズのバンドが現れることを確認した（図５Ｂ）。この結果から、ａｔｐ９遺伝子とｎａｄ３遺伝子も、ミトコンドリアゲノム上で互いに隣接した位置に存在すると推定された。
ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統選抜用プライマー製作
本発明者は、前記実施例４により、ａｔｐ６遺伝子とａｔｐ９遺伝子のPRF（open reading frame）に変移が起こったことを確認した。また、ｎａｄ３遺伝子が、ａｔｐ６遺伝子及びａｔｐ９遺伝子と各々類似したＲＦＬＰパターンを現すことから、ｎａｄ３遺伝子が、ａｔｐ６遺伝子及びａｔｐ９遺伝子とミトコンドリアゲノム上で、隣接した位置に存在すると推定した。従って、本発明者は、前記３個の遺伝子の塩基配列を参考にして、変移が起こったと推定された部分の塩基配列を増幅するためのプライマーを製作した。
本発明者は、前記実施例４により、ａｔｐ６遺伝子とａｔｐ９遺伝子のPRF（open reading frame）に変移が起こったことを確認した。また、ｎａｄ３遺伝子が、ａｔｐ６遺伝子及びａｔｐ９遺伝子と各々類似したＲＦＬＰパターンを現すことから、ｎａｄ３遺伝子が、ａｔｐ６遺伝子及びａｔｐ９遺伝子とミトコンドリアゲノム上で、隣接した位置に存在すると推定した。従って、本発明者は、前記３個の遺伝子の塩基配列を参考にして、変移が起こったと推定された部分の塩基配列を増幅するためのプライマーを製作した。
まず、ａｔｐ６遺伝子の5'部分とｎａｄ３遺伝子の間を増幅するための正方向及び逆方向プライマーを製作した。製作されたプライマーを各々「ｉａ６ｆ」、「ｒｎ３ｆ」と命名し、その塩基配列を配列番号１及び２と記載した。また、ａｔｐ９遺伝子の5'部分とｎａｄ３遺伝子の間を増幅するための正方向及び逆方向プライマーを製作した。製作されたプライマーを各々「ｉａ９ｆ」、「ｎ３１ｒ」と命名し、その塩基配列を配列番号３及び４と記載した。
本発明によるプライマーを用いたアブラナ科作物におけるＰＣＲ分析
本発明者は、前記実施例５で製作したプライマーにより、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統に特異的なＰＣＲ産物が増幅されるか否かを確認するために、次のような実験を行った。このための実験材料としては、前記表４に記載されたダイコンとキャベツの雄性可稔及び雄性不稔系統を用いた。
本発明者は、前記実施例５で製作したプライマーにより、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統に特異的なＰＣＲ産物が増幅されるか否かを確認するために、次のような実験を行った。このための実験材料としては、前記表４に記載されたダイコンとキャベツの雄性可稔及び雄性不稔系統を用いた。
６−１）ｉａ６ｆ及びｒｎ３ｆプライマーを用いたＰＣＲ実施
まず、各系統から分離したＤＮＡを鋳型にし、配列番号１及び２と記載される塩基配列を有するｉａ６ｆ及びｒｎ３ｆプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、(株)バイオニア社のＰＣＲキット（AccuPower Premix）を用いて行った。反応条件は、９５℃で５分間前変性化（pre-denaturation）させた後、９５℃で１分；５５℃で１分；７２℃で２分を１サイクルにし、３０回繰り返した後、７２℃で１０分間最終反応させた。その後、１％アガロースゲル電気泳動を行った。その結果、図６Ａに示したように、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統でのみ約1.8kbサイズの特異的なバンドが検出されたことを確認した。
まず、各系統から分離したＤＮＡを鋳型にし、配列番号１及び２と記載される塩基配列を有するｉａ６ｆ及びｒｎ３ｆプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、(株)バイオニア社のＰＣＲキット（AccuPower Premix）を用いて行った。反応条件は、９５℃で５分間前変性化（pre-denaturation）させた後、９５℃で１分；５５℃で１分；７２℃で２分を１サイクルにし、３０回繰り返した後、７２℃で１０分間最終反応させた。その後、１％アガロースゲル電気泳動を行った。その結果、図６Ａに示したように、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統でのみ約1.8kbサイズの特異的なバンドが検出されたことを確認した。
６−２）ｉａ９ｆ及びｎ３１ｒプライマーを用いたＰＣＲ実施
配列番号３及び４と記載される塩基配列を有するｉａ９ｆ及びｎ３１ｒプライマーを用いたこと以外には、前記実施例６−１）と同様な方法によりＰＣＲを行った。その結果、図６Ｂに示したように、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統でのみ約2.3kbサイズの特異的なＰＣＲ産物が検出されたことを確認することができた。雄性可稔系統である緑風３と秋強でもＰＣＲ産物が検出されたが、このＰＣＲ産物は、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統で現れたＰＣＲ産物とそのサイズが異なり、これにより、雄性可稔系統で増幅されたＰＣＲ産物が、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統で増幅されたＰＣＲ産物と異なることを確認することができた。
配列番号３及び４と記載される塩基配列を有するｉａ９ｆ及びｎ３１ｒプライマーを用いたこと以外には、前記実施例６−１）と同様な方法によりＰＣＲを行った。その結果、図６Ｂに示したように、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統でのみ約2.3kbサイズの特異的なＰＣＲ産物が検出されたことを確認することができた。雄性可稔系統である緑風３と秋強でもＰＣＲ産物が検出されたが、このＰＣＲ産物は、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統で現れたＰＣＲ産物とそのサイズが異なり、これにより、雄性可稔系統で増幅されたＰＣＲ産物が、ＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統で増幅されたＰＣＲ産物と異なることを確認することができた。
本発明によるプライマーにより増幅されたＰＣＲ産物の配列分析
前記実施例６で得られた２個のＰＣＲ産物の塩基配列を（株）バイオネクス社に依頼して分析した。ｉａ６ｆ及びｒｎ３ｆプライマーにより増幅されたＰＣＲ産物の塩基配列を分析した結果、ａｔｐ６遺伝子とｎａｄ３遺伝子とは、約1290bp程度離れて存在すると確認され、前記２つのプライマーは、ａｔｐ６遺伝子とｎａｄ３遺伝子の間を増幅すると確認された（図７参照）。ｉａ６ｆ及びｒｎ３ｆプライマーにより増幅されたＰＣＲ産物の全体塩基配列を配列番号５と記載した。
前記実施例６で得られた２個のＰＣＲ産物の塩基配列を（株）バイオネクス社に依頼して分析した。ｉａ６ｆ及びｒｎ３ｆプライマーにより増幅されたＰＣＲ産物の塩基配列を分析した結果、ａｔｐ６遺伝子とｎａｄ３遺伝子とは、約1290bp程度離れて存在すると確認され、前記２つのプライマーは、ａｔｐ６遺伝子とｎａｄ３遺伝子の間を増幅すると確認された（図７参照）。ｉａ６ｆ及びｒｎ３ｆプライマーにより増幅されたＰＣＲ産物の全体塩基配列を配列番号５と記載した。
また、ｉａ９ｆ及びｎ３１ｒプライマーにより増幅されたＰＣＲ産物の全体塩基配列を分析した結果、前記２つのプライマーは、本発明者の予想とは異なり、ａｔｐ９遺伝子とｎａｄ３遺伝子の間の部分を増幅しないと確認された。ただし、前記ＰＣＲ産物の配列には、ｎ３１ｒプライマーの塩基配列を含むその附近に、ｎａｄ３遺伝子の一部と類似した塩基配列（図８の塩基配列のうち、2596〜2640に該当する配列）が存在すると確認された（図８参照）。ｉａ９ｆ及びｎ３１ｒプライマーにより増幅されたＰＣＲ産物の全体塩基配列を配列番号６と記載した。
以上説明したように、本発明は、新しいＣＭＳダイコン系統であるＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統のカルスと、前記カルスから誘導された植物体及びこれを用いて製造された雑種種子を提供する。本発明によるＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統の植物体は、Ｆ１植物体に対する雄性不稔導入率が高いため、ＣＭＳ系統の雑種種子の生産に非常に有用に利用されることができる。また、特異的なＤＮＡ標識因子を含有していて、検出が容易であるという長所があり、有用である。
Claims (7)
- 細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）特性を有し、配列番号５及び配列番号６の塩基配列を含有することを特徴とするＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統のカルス（寄託番号：ＫＣＴＣ １０３３９ＢＰ）。
- 請求項１に記載のカルスから誘導され、組織培養により無性繁殖されるＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統植物体。
- （ａ）請求項１に記載のカルスから新梢（shoot）を誘導する段階と、
（ｂ）前記新梢が形成されたカルスから抜根を誘導する段階と、
（ｃ）前記抜根が形成されたカルスを土壌改良及び再分化過程を経て植物体を形成する段階と、
を備えることを特徴とするＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統植物体の製造方法。 - 請求項２に記載のＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統植物体を、雄性不稔を導入しようとする雄性可稔ダイコン系統植物体と交配することを特徴とするＣＭＳダイコン系統雑種種子の製造方法。
- 請求項２に記載のＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統植物体を、雄性不稔を導入しようとする雄性可稔ダイコン系統植物体と交配して製造されたＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統の雑種種子。
- 前記雄性可稔ダイコン系統は、ソウルボム（Seoul Bom）１５２３、ソウルボム１９７８、総太１６４２、晋州大坪３４０、時無１４６２、聖護院５２、総太１９６８、総太２０１５、１９３４、Ｍｎ００２、Ｍｎ００３、ＹＢ−１、１８２５、ＡＤ１００２、Ｍｎ００６、三季ボム１６３４、宮重総太ＪＡ０４６、宮重総太ＪＡ０４８、宮重総太ＪＡ０４９、宮重総太ＪＡ０５３、宮重総太１６４２、宮重総太１９２１、宮重総太１９２３、宮重総太１９２９、宮重１７０６、晩抽宮重２００４、晩抽総太１９１６、晩抽総太１９１７、晩抽総太１９１８、美濃２１１３、ソウルボム１８６１、ソウルボム２０６４、聖護院１８７７、聖護院１９４７、龍ケン１７０９、円白分離Ｍｎ００５、円白分離１９３５及び総太１９４６よりなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載のＣＭＳダイコン系統の雑種種子。
- 配列番号５及び配列番号６で表される塩基配列を有するＮＷＢ−ＣＭＳダイコン系統植物体選抜用ＤＮＡ標識因子を増幅するための配列番号１及び２、または配列番号３及び４の一対であるプライマー。
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