KR20210153071A

KR20210153071A - 생장성이 개량된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파(Brassica rapa) 식물

Info

Publication number: KR20210153071A
Application number: KR1020217035651A
Authority: KR
Inventors: 신고 호리우치; 다카오 스즈키; 아츠시 이즈미다; 가즈히로 니시카와
Original assignee: 가부시키가이샤 사카타노타네
Priority date: 2019-04-17
Filing date: 2020-04-17
Publication date: 2021-12-16
Also published as: CN113993373A; EP3957167A4; JPWO2020213728A1; AU2020258736A1; WO2020213728A1; EP3957167A1; US20220322627A1; CN113993373B

Abstract

본 명세서는 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물과 동등한 생장성을 갖는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물, 또는 그의 후대를 개시한다. 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물은 핵 게놈과 미토콘드리아 게놈의 친화성이 불충분하기 때문에, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물과 비교하여 생장성이 저하되는 문제점이 있었다. 본 발명의 양태에 따르면, 종래의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물에 보이는 생장성이 저하되는 점을 개선하여, 생장성이 개선된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물을 제공할 수 있다.

Description

생장성이 개량된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파(Brassica rapa) 식물

<관련 출원의 참조>

본원은, 선행하는 일본 특허 출원인 일본 특허 출원 제2019-78906호(출원일: 2019년 4월 17일)에 기초하는 것으로서, 그의 우선권의 이익을 주장하는 것이며, 그 개시 내용 전체는 참조함으로써 여기에 원용된다.

<기술분야>

본 발명은 생장성이 개량된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파(Brassica rapa) 식물에 관한 것이다.

브라시카 라파는 유채과 유채속에 속하며, 지중해 지방이 기원으로 되어 있다. 자연 교잡에 의해 다양한 형태적 특징을 갖는 아종으로 분화되어, 배추나 순무, 소송채, 바이차이 등 수많은 야채류로 계승되고 있다(비특허문헌 1).

일반적으로, 식물 품종에는 고정종과 잡종 제1대(이하, 「F1」이라고 기재함) 품종이 있으며, 주요 작물에 있어서는 F1 품종이 보급되고 있다. F1 품종은 잡종 강세(헤테로시스)에 의해 생육이 왕성하고, 생육이 빠르며, 수량성이 높아지는 등 큰 이점이 있다. 또한 F1 품종은 생육이 왕성해짐으로써 병해충에 대한 내성이나, 내한ㆍ내서성 등의 환경 적응성의 향상도 기대할 수 있다. 또한 F1 품종의 유전자형은 헤테로성이면서 동일한 유전자형이기 때문에, 표현형은 매우 높은 균일성을 나타낸다. 이 때문에, 생산물의 시장성이 높아진다. 또한 F1 품종의 양친에 우성 유전자로 지배되어 있는 유용 형질을 집적할 수 있기 때문에, 신속한 육종이 가능하게 된다.

이상과 같은 우위성이 있는 점에서, F1 품종은 주요 작물에 있어서 재배 품종의 주류를 차지하게 되었다.

F1 품종의 채종을 행하는 경우, 일반적으로 양친은 자식(自殖)(근교) 계통이 사용되며, 잡종 강세의 효과가 큰 조합 등 중에서 종자친과 화분친이 선정된다. 종자친은 자가 수정을 방지하기 위해 제웅을 행할 필요가 있는데, 사람 손에 의한 제웅은 매우 엄청난 노동력이 필요하게 된다. 그래서, 유전적인 웅성 불임성인 세포질 웅성 불임(Cytoplasmic Male Sterility(이하에 있어서, 「CMS」라고 기재함)) 계통을 종자친에 사용하면, 사람 손에 의한 제웅의 작업이 불필요하게 되며, F1 종자를 경제적이고 또한 대량으로 생산할 수 있다. CMS를 이용한 F1 종자의 생산은 해바라기, 사탕무, 감자, 소맥, 당근, 양파, 파, 양배추, 브로콜리, 콜리플라워, 무 및 배추 등에서 상업적인 생산 시스템이 확립되어 있다.

유채과 작물 중에서 가장 이용되고 있는 CMS는 오구라(Ogura) CMS이며, 라파누스 사티부스(Raphanus sativus), 브라시카 올레라세아(Brassica oleracea), 브라시카 준세아(Brassica juncea), 브라시카 나푸스(Brassica napus) 등에서 이용되고 있다. 오구라 CMS는 품종명 불명의 일본형 무로부터 발견되어, 오늘까지 무에 있어서의 F1 품종의 개발에 널리 이용되고 있다. 또한, 오구라 CMS는 속간 교잡과 연속 여교잡에 의해 유채(Brassica napus)에 도입되어 웅성 불임 계통이 얻어졌지만, 당초에는 저온에서 클로로시스를 나타내는 결점을 갖고 있어 실용화할 수 없었다. 이 클로로시스를 극복하기 위해, 오구라 CMS 브라시카 나푸스(B. napus)와 정상적인 세포질을 갖는 브라시카 나푸스 사이에서 세포 융합이 행해졌다. 얻어진 재생 식물은, 무 유래의 엽록체가 브라시카 나푸스 유래의 엽록체로 치환되어 있고, 저온 하에서도 정상적으로 생육하였다. 브라시카 나푸스에서는 세포 융합을 사용함으로써, 실용적인 CMS 계통이 작출되고 있다(비특허문헌 2).

그 후, 브라시카 올레라세아(B. oleracea)와 라파누스 사티부스(R. sativus) 사이에서도 마찬가지로 세포 융합이 행해져, 클로로시스를 야기하지 않는 오구라 CMS 브라시카 올레라세아 식물이 작출되고, 브로콜리, 양배추 등의 F1 품종의 개발에 있어서 실용화되어 있다(특허문헌 1).

브라시카 라파(B. rapa) 식물에 있어서도, 특허문헌 1의 오구라 CMS 브라시카 올레라세아 식물을 종자친으로 하고, 브라시카 라파 식물을 화분친으로 하여 연속 여교잡을 행하여, 클로로시스를 야기하지 않는 오구라 CMS 브라시카 라파 식물이 개발되어 가부시키가이샤 사카타노타네로부터 품종화되어 있다.

그러나 육종 과정에서는, 많은 친계통이나 F1 계통에 있어서 생장성의 저하가 확인되고 있었다. 그 때문에, 자가 불화합성(Self Incompatibility(이하에 있어서, 「SI」라고 기재함)) 이용 F1과 비교하여, 기존의 CMS을 이용한 F1에서는 일반적으로 그 생장성이 저하되는 것이 현저하였다. 따라서, 브라시카 라파 식물에서는 CMS 이용의 F1화가 진행되고 있지 않았다.

예를 들어 소송채, 청경채 등의 연약 야채에서는 종자를 단계적으로 뿌려 계획적으로 재배하고, 일제히 수확하는 점에서 파종부터 수확까지의 숙기의 균일성은 매우 중요하며, 농가의 수익에 직결되는 특성이다. 여기서의 생장성의 저하의 문제는, 수확기가 3일 지연됨으로써 시장성이 현저하게 저하되고, 품종으로서의 가치를 잃어 버릴 만큼 심각하다. 또한, 수확까지의 생육이 비교적 긴 배추 등에 있어서도, 마찬가지로 수확기가 5일 정도 어긋남으로써 다른 품종으로 간주될 정도로 생장성은 중요한 특성이라고 할 수 있다.

이와 같이, 유묘부터 청과에 이르기까지 생장성이 저하되지 않는 것은 브라시카 라파에서의 CMS 이용 F1에 있어서는 매우 큰 과제이며, 이 때문에 CMS 이용 F1의 보편적 보급이 늦어져 왔다. 이 과제가 극복되면, 전술한 CMS 이용 F1의 장점을 최대한 향수 가능하게 된다. 사용하는 계통에 따라서는, 생장성의 저하가 경미하였기 때문에 F1의 잡종 강세를 이용하면서 품종화에 성공한 예가 있지만, 사용할 수 있는 친계통이나 조합이 한정되고, 적지 않게 육종적 제한이 존재하는 점에서, 보편적으로 사용할 수 있는 오구라 CMS 브라시카 라파 식물의 개발이 강하게 요구되어 왔다.

그 밖에도 브라시카 라파 식물에서는, 속간 교잡과 연속 여교잡에 의해 오구라 CMS 라파누스 사티부스 식물로부터 브라시카 라파에 CMS가 도입되고, 유성 교잡에 의해 핵 치환된 오구라 CMS 브라시카 라파 식물이 얻어졌지만, 유채와 마찬가지로 저온에서 클로로시스를 나타내는 결점을 갖고 있었다. 이 클로로시스의 문제점을 극복하기 위해, 유성 교잡에 의해 핵 치환된 오구라 CMS 브라시카 라파 식물과 정상 세포질의 브라시카 라파 사이에서 비대칭 세포 융합이 행해져, 새로운 오구라 CMS 브라시카 라파 식물인 「new OguCMS」가 작출되었다. 「new OguCMS」는 저온에서의 클로로시스를 야기하지 않고, 발달된 꿀샘을 갖고 있으며, 그의 종자 생산성은 유지 계통과 동등하다는 등의 특성이 나타났다(특허문헌 2, 비특허문헌 3).

그러나, 특허문헌 2 및 비특허문헌 3에서는 「new OguCMS」의 생장성에 관한 정량적인 평가는 행해져 있지 않고, 당해 CMS 식물의 종자도 기탁되어 있지 않기 때문에, 「new OguCMS」의 생장성을 확인하는 것은 매우 곤란하였다. 이 점에 관하여, 비특허문헌 3의 도 1의 사진에서 「new OguCMS」는 「parental CMS」보다 식물체가 명확하게 작게 보이므로, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물보다 생장성이 낮다고 추정되었다. 또한, 본 발명자들이 「new OguCMS」가 아닐까라고 추측하는 품종 「보라배추」(주1)나 「니 하오 펑」은 모두 미니 청경채의 품종인 점에서, 이 점으로부터도 「new OguCMS」는 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물보다 생장성이 낮다고 생각되었다.

(주1) 여기서 중국 표기의 품종명

는 「보라배추」로 표기한다.

CMS를 이용하는 F1 품종의 개발에 있어서, 웅성 불임성을 발현시키는 세포질은 웅성 불임성 이외의 형질에 가능한 한 영향을 미치지 않는 것이 중요하게 된다. 예를 들어, 옥수수에서는 T형 웅성 불임 세포질을 도입한 F1 품종이 육성되었지만, 1970년에 호마엽고병균의 T 레이스가 출현하고, T형 웅성 불임 세포질은 이 병원균에 특이적으로 이병성이었기 때문에 큰 타격을 받았다. 이 때문에, T형 웅성 불임 세포질의 이용은 즉시 중지되고, 종래의 인공 제웅법으로 다시 돌아오지 않을 수 없었다(비특허문헌 4).

또한, 피튜니아에 있어서의 CMS는 오래전부터 알려져 있으며, 그의 원인 유전자인 S-pcf가 연구 재료로서 수없이 이용되고 있다. 그러나, 이 CMS를 이용한 F1 품종은 개화 지연이나 꽃봉오리의 발달 정지 등을 일으키기 때문에, 현재는 거의 이용되고 있지 않다(비특허문헌 4).

이들 예와 같이 CMS가 발견되어도, 그 CMS가 불량 형질을 수반하는 경우에는 CMS의 이용이 곤란 혹은 이용이 한정되는 경우가 있어, 한층 더한 CMS의 개량법의 개발과, 개량 CMS의 제공이 여전히 요구되고 있다고 할 수 있다.

일본 특허 공개 평7-31307호 공보 CN1232608A 일본 특허 제3964368호 일본 특허 제5089764호

스와베 게이타 (2012) 육종학 연구 14: 114-120 Hiroshi Yamagishi and Shripad R. Bhat (2014) Breeding Science 64: 38-47 "Cytoplasmic male sterility in Brassicaceae crops" Xi-Lin Hou, Shou-Chun Cao, Yu-Ke He (2004) ISHS Acta Horticulturae 637: 75-81 "Creation of a New Germplasm of CMS Non-Heading Chinese Cabbage" 세포질 웅성 불임과 육종 기술 1985년 가부시키가이샤 CMC 출판 발행

기존의 오구라 CMS 브라시카 라파 식물은 핵 게놈과 미토콘드리아 게놈의 친화성이 불충분하기 때문에, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물과 비교하여 생장성이 저하되는 문제점이 있었다.

본 발명은 상기한 바와 같은 기존의 오구라 CMS 브라시카 라파 식물에 있어서의 생장성이 저하되는 문제점을 감안하여, 생장성이 저하되지 않는 오구라 CMS 브라시카 라파 식물의 제공, 및 당해 오구라 CMS 브라시카 라파 식물을 이용한 생장성이 저하되지 않는 브라시카 라파 식물의 F1 종자의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 금번 예의 검토를 행한 결과, 기존의 오구라 CMS 브라시카 라파 식물을 세포질 공여친으로 하고, 높은 재분화능을 갖고, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 종간 잡종 식물을 세포질 수용친으로 하여 비대칭 세포 융합을 행함으로써, 미토콘드리아 게놈의 개량이 가능하게 되어, 생장성이 저하되지 않는 오구라 CMS 브라시카 라파 식물을 작출하고, 당해 오구라 CMS 브라시카 라파 식물을 이용하여 생장성이 개량된 오구라 CMS 브라시카 라파 식물이 얻어지는 것을 발견하였다.

본 발명은 이들 지견에 기초하는 것이다. 즉, 본 발명에 따르면, 이하의 발명이 제공된다.

<1> 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물과 동등한 생장성을 갖는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<2> 라파누스 사티부스 식물, 브라시카 올레라세아 식물 및 브라시카 라파 식물의 미토콘드리아 게놈에서 유래하는 DNA를 미토콘드리아 게놈 내에 갖는, 상기 <1>의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<3> 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 종간 잡종 식물을 세포질 수용친으로서 사용하는 비대칭 세포 융합을 행함으로써 얻어지는, 상기 <1> 또는 <2>의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<4> 라파누스 사티부스 식물에서 유래하는 세포질 웅성 불임 유전자를 갖는 세포질 웅성 불임 브라시카속 식물을 세포질 공여친으로서 사용하는 비대칭 세포 융합을 행함으로써 얻어지는, 상기 <1> 내지 <3> 중 어느 것의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<5> 세포질 웅성 불임 브라시카 올레라세아 식물에서 유래하는 세포질 웅성 불임 브라시카속 식물을 세포질 공여친으로서 사용하는 비대칭 세포 융합을 행함으로써 얻어지는, 상기 <1> 내지 <3> 중 어느 것의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<6> 세포질 웅성 불임 브라시카 올레라세아 식물에서 유래하는 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물을 세포질 공여친으로서 사용하는 비대칭 세포 융합을 행함으로써 얻어지는, 상기 <1> 내지 <3> 중 어느 것의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<7> 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카속 식물을 세포질 공여친으로서 사용하고, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 종간 잡종 식물을 세포질 수용친으로서 사용하는 비대칭 세포 융합을 행함으로써 얻어지는, 상기 <1> 내지 <4> 중 어느 것의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<8> 종간 잡종 식물이 브라시카 올레라세아 식물 및 브라시카 라파 식물에서 유래하는 것인, 상기 <3> 내지 <7> 중 어느 것의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<9> 종간 잡종 식물이 높은 재분화능을 갖는 것인, 상기 <3> 내지 <8> 중 어느 것의 종간 잡종 식물.

<10> 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카속 식물이 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물인, 상기 <7>의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<11> 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카속 식물이 세포질 웅성 불임 브라시카 올레라세아 식물에서 유래하는 것인, 상기 <7>의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<12> 세포질 공여친이 세포질 웅성 불임 유전자 orf138을 갖는 것인, 상기 <4> 내지 <11> 중 어느 것의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<13> 라파누스 사티부스 식물, 브라시카 올레라세아 식물 및 브라시카 라파 식물의 미토콘드리아 게놈에서 유래하는 DNA를 미토콘드리아 게놈 내에 갖는 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대이며,

정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 종간 잡종 식물을 세포질 수용친으로서 사용하는 비대칭 세포 융합을 행함으로써 얻어지는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<14> 수탁 번호 FERM BP-22371 또는 수탁 번호 FERM BP-22372로 특정되는 식물 유래의 미토콘드리아 게놈을 포함하는, 상기 <1> 내지 <13> 중 어느 것의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<15> 미토콘드리아 게놈 마커 BrMt-13K, BrMt-23K, BrMt-74K, BrMt-120K, BrMt-149K, BrMt-185K에 의해 특정되는 미토콘드리아 DNA 중 적어도 어느 하나가 브라시카 라파형인, 상기 <1> 내지 <14> 중 어느 것의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<16> 미토콘드리아 게놈 마커 BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K, BrMt-208K에 의해 특정되는 미토콘드리아 DNA 중 적어도 어느 하나가 브라시카 올레라세아형인, 상기 <1> 내지 <14> 중 어느 것의 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<17> 미토콘드리아 게놈 마커 BrMt-13K, BrMt-16K, BrMt-23K, BrMt-28K, BrMt-43K, BrMt-58K, BrMt-63K, BrMt-70K, BrMt-74K, BrMt-88K, BrMt-100K, BrMt-111K, BrMt-120K, BrMt-141K, BrMt-149K, BrMt-157K, BrMt-161K, BrMt-185K, BrMt-199K, BrMt-213K 및 BrMt-215K에 의해 특정되는 미토콘드리아 DNA가 브라시카 라파형이며, 또한 미토콘드리아 게놈 마커 BrMt-3K, BrMt-4K, BrMt-36K, BrMt-65K, BrMt-80K, BrMt-94K, BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K 및 BrMt-208K에 의해 특정되는 미토콘드리아 DNA가 브라시카 올레라세아형인, 상기 <1> 내지 <14> 중 어느 것의 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<18> 수탁 번호 FERM BP-22371 또는 수탁 번호 FERM BP-22372로 특정되는 식물의 미토콘드리아 게놈을 갖는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<19> 수탁 번호 FERM BP-22371 또는 수탁 번호 FERM BP-22372로 특정되는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<20> 수탁 번호 FERM BP-22371 또는 수탁 번호 FERM BP-22372로 특정되는 식물의 미토콘드리아 게놈을 갖는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물을 세포질 공여친으로서 사용하고, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 종간 잡종 식물을 세포질 수용친으로서 사용하는 비대칭 세포 융합을 행함으로써 얻어지는, 상기 <1> 내지 <19> 중 어느 것의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.

<21> 상기 <1> 내지 <20> 중 어느 것의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대의 식물체의 일부.

<22> 상기 <1> 내지 <20> 중 어느 것의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대의 종자.

<23> 상기 <1> 내지 <20> 중 어느 것의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대, 상기 <21>의 식물체의 일부, 또는 상기 <22>의 종자에 포함되는, 미토콘드리아 게놈.

<24> 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물을 세포질 공여친으로서 사용하고, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물을 세포질 수용친으로서 사용하는 비대칭 세포 융합을 행하는 것을 포함하는, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물과 동등한 생장성을 갖는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대의 제조 방법.

<25> 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물이 브라시카 라파 식물의 종간 잡종 식물 또는 그것에서 유래하는 것인, 상기 <24>의 제조 방법.

<26> 상기 <1> 내지 <20> 중 어느 것의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대을 종자친으로 하고, 해당 식물과 교배 가능한 브라시카 라파 식물을 화분친으로 하여 교배하고, 교배 후의 종자친으로부터 잡종 제1대 종자를 채종하는 것을 포함하는, 잡종 제1대 종자의 제조 방법.

<27> 상기 <26>의 방법에 의해 제조된 잡종 제1대 종자, 또는 해당 종자로부터 생육시킨 잡종 제1대 식물, 그의 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.

<28> 상기 <1> 내지 <20> 중 어느 것의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대에, 임의의 브라시카 라파 식물을 연속 여교잡하여 세포질 치환하는 것을 포함하는, 세포질 웅성 불임성을 발현하는 브라시카 라파 식물의 제조 방법.

본 발명에 따르면, 생장성이 개량된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물, 그 중에서도 생장성이 개량된 오구라 CMS 브라시카 라파 식물을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 생장성이 개량된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물을 종자친, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물을 화분친으로 하여 브라시카 라파 식물의 F1 종자의 채종에 이용함으로써, 생장성이 저하되지 않는 브라시카 라파 식물의 F1 종자를 효율적으로 채종하는 것이 가능하게 된다.

이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.

생장성이 개선된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 및 그의 후대

본 발명은 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물에 비하여 생장성이 개량된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대에 관한 것이다. 이것은 상기한 바와 같이, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물과 동등한 생장성을 갖는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대로 표현할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 전형적으로 「정상 세포질」은 웅성 불임성을 나타내는 식물의 세포질, 즉 웅성 불임 세포질에 대하여 불임성을 나타내지 않고 정상이라는 의미로 사용된다.

또한 「정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물과 동등한 생장성」이라는 경우에 있어서의 「동등」이란, 생장성을 식물체의 지상부의 중량으로 계량한 경우에, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물의 값에 비하여, 대상으로 하는 식물에 있어서의 계량값이 25％ 이내(바람직하게는 20％ 이내, 보다 바람직하게는 15％ 이내, 더욱 바람직하게는 10％ 이내)에서 변동될 수 있는 범위에 들어가는 경우를 말한다. 따라서, 예를 들어 「정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물」의 지상부 중량의 값에 대하여, 대상으로 하는 식물의 계량값이 정상적인 식물의 값의 90％의 값인 경우에는, 상기 변동이 10％인 것에 상당한다. 동등은, 「정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물」의 생장성을 초과하는 경우를 배제하지 않는다.

본 명세서에 있어서 「후대」란, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물을 사용한 후대를 포함하는 것 외에, 본 발명에 따른 생장성이 개량된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물과, 해당 식물과 교배 가능한 브라시카 라파 식물을 교배시켜 얻어지는 교잡종도 포함된다. 따라서 「후대」에는, 예를 들어 본 발명에 따른 생장성이 개량된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물을 종자친(자친)으로 하고, 해당 식물과 교배 가능한 브라시카 라파 식물을 화분친(웅친)으로 하여 교배함으로써 얻어지는 것도 포함된다. 또한 「후대」에는, 예를 들어 본 발명에 따른 생장성이 개량된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물과, 해당 브라시카 라파 식물과 융합 가능한 식물의 세포 융합에 의한 식물이나, 종속간 교잡 식물도 포함된다.

여기서 「브라시카 라파 식물」은 청경채(브라시카 라파 바. 치넨시스(B. rapa var. chinensis)), 순무(브라시카 라파 바. 라파(B. rapa var. rapa)), 미즈나(브라시카 라파 바. 라시니이폴리아(B. rapa var. laciniifolia)), 배추(브라시카 라파 바. 페키넨시스(B. rapa var. pekinensis)), 소송채(브라시카 라파 바. 페르비리디스(B. rapa var. perviridis)), 타차이(브라시카 라파 바. 나리노사(B. rapa var. narinosa)) 또는 이들과 근연종의 종속간 잡종 식물인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명의 생장성이 개량된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대는, 라파누스 사티부스 식물에서 유래하는 세포질 웅성 불임 유전자인 orf138 유전자를 미토콘드리아 게놈 내에 갖고, 보다 바람직하게는 라파누스 사티부스 식물, 브라시카 올레라세아 식물 및 브라시카 라파 식물의 미토콘드리아 게놈에서 유래하는 DNA를 미토콘드리아 게놈 내에 갖고, 더욱 바람직하게는 라파누스 사티부스 식물에서 유래하는 orf138 유전자와 브라시카 올레라세아 식물 및 브라시카 라파 식물의 재조합 미토콘드리아 게놈을 갖는다.

본 명세서에 있어서 비대칭 세포 융합이란, 세포 융합에 사용하는 단리된 프로토플래스트의 한쪽의 핵 게놈을 융합시키기 전에 미리 파괴시킨 후, 그것을 사용하여 세포 융합을 행하는 것을 말한다. 이 비대칭 세포 융합에 있어서, 융합 시에 핵 게놈을 파괴하고, 세포 융합에 의해 그 세포질을 융합 세포에 공여하는 것을 세포질 공여친이라고 한다. 또한, 융합 시에, 핵 게놈을 파괴시키지 않고 유지하고, 상기 세포질 공여친으로부터의 세포질을 받아들이는 것을 세포질 수용친이라고 한다.

본 발명의 생장성이 개량된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물을 얻는 경우에는, 비대칭 세포 융합에 있어서 세포질 수용친으로서, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 종간 잡종 식물을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명의 생장성이 개량된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물은 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물을 세포질 공여친으로서 사용하고, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 종간 잡종 식물을 세포질 수용친으로서 사용하는 비대칭 세포 융합을 행함으로써 얻을 수 있다.

여기서 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물이란, 본 발명에 의해 생장성이 개량되기 전의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물을 의미한다. 본 발명에서는 바람직하게는, 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물은 생장성을 개량할 여지가 있는 것, 즉 생장성이 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물과 비교하여 저하되어 있는 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물은 세포질 웅성 불임 브라시카 올레라세아 식물에서 유래하는 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물이다. 여기서 말하는 세포질 웅성 불임 브라시카 올레라세아 식물로서는, 일본 특허 공개 평07-031307호 공보를 참고로 작출할 수 있으며, 전형적인 예로서는 가부시키가이샤 사카타노타네에서 개발되어, 브라시카 올레라세아 작물에서 사용되고 있는 CMS 계통 "양배추 MS-2"(일본 특허 공개 평07-031307호 공보)를 들 수 있다. 또한, "양배추 MS-2"의 세포질은 시판 중인 브로콜리 품종 "그랜돔", "픽셀" 등에서 사용되고 있으며, 용이하게 입수할 수 있다.

라파누스 사티부스에서 유래하는 세포질 웅성 불임 유전자를 갖는 세포질 웅성 불임 브라시카속 식물이란, 상기한 바와 같이 전형적으로는 오구라 CMS 유전자를 갖는 것을 말한다.

본 발명의 하나의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명의 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대에 있어서, 미토콘드리아 게놈 마커 BrMt-13K, BrMt-23K, BrMt-74K, BrMt-120K, BrMt-149K, BrMt-185K에 의해 특정되는 미토콘드리아 DNA 중 적어도 어느 하나는 브라시카 라파형이다. 또한 여기서 상기 「적어도 어느 하나」는 보다 바람직하게는 「적어도 어느 둘」, 더욱 바람직하게는 「적어도 어느 셋」, 보다 더 바람직하게는 「적어도 어느 넷」이다. 더욱 바람직한 양태에 따르면, 본 발명의 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대에 있어서, 미토콘드리아 게놈 마커 BrMt-13K, BrMt-23K, BrMt-74K, BrMt-120K, BrMt-149K, BrMt-185K에 의해 특정되는 미토콘드리아 DNA는 브라시카 라파형이다

본 발명의 하나의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명의 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대에 있어서, 미토콘드리아 게놈 마커 BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K, BrMt-208K에 의해 특정되는 미토콘드리아 DNA 중 적어도 어느 하나가 브라시카 올레라세아형이다. 또한 여기서 상기 「적어도 어느 하나」는 보다 바람직하게는 「적어도 어느 둘」, 더욱 바람직하게는 「적어도 어느 셋」, 보다 더 바람직하게는 「적어도 어느 넷」이다. 더욱 바람직한 양태에 따르면, 본 발명의 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대에 있어서, 미토콘드리아 게놈 마커 BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K, BrMt-208K에 의해 특정되는 미토콘드리아 DNA는 브라시카 올레라세아형이다.

본 발명의 하나의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명의 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대에 있어서, 미토콘드리아 게놈 마커 BrMt-13K, BrMt-16K, BrMt-23K, BrMt-28K, BrMt-43K, BrMt-58K, BrMt-63K, BrMt-70K, BrMt-74K, BrMt-88K, BrMt-100K, BrMt-111K, BrMt-120K, BrMt-141K, BrMt-149K, BrMt-157K, BrMt-161K, BrMt-185K, BrMt-199K, BrMt-213K 및 BrMt-215K에 의해 특정되는 미토콘드리아 DNA 중 적어도 어느 하나는 브라시카 라파형이고, 또한 미토콘드리아 게놈 마커 BrMt-3K, BrMt-4K, BrMt-36K, BrMt-65K, BrMt-80K, BrMt-94K, BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K 및 BrMt-208K에 의해 특정되는 미토콘드리아 DNA 중 적어도 어느 하나는 브라시카 올레라세아형이다. 또한 여기서 상기 「적어도 어느 하나」는 보다 바람직하게는 「적어도 어느 둘」, 더욱 바람직하게는 「적어도 어느 셋」, 보다 더 바람직하게는 「적어도 어느 넷」이다.

본 발명의 하나의 더욱 바람직한 양태에 따르면, 본 발명의 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대에 있어서, 미토콘드리아 게놈 마커 BrMt-13K, BrMt-16K, BrMt-23K, BrMt-28K, BrMt-43K, BrMt-58K, BrMt-63K, BrMt-70K, BrMt-74K, BrMt-88K, BrMt-100K, BrMt-111K, BrMt-120K, BrMt-141K, BrMt-149K, BrMt-157K, BrMt-161K, BrMt-185K, BrMt-199K, BrMt-213K 및 BrMt-215K에 의해 특정되는 미토콘드리아 DNA는 브라시카 라파형이고, 또한 미토콘드리아 게놈 마커 BrMt-3K, BrMt-4K, BrMt-36K, BrMt-65K, BrMt-80K, BrMt-94K, BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K 및 BrMt-208K에 의해 특정되는 미토콘드리아 DNA는 브라시카 올레라세아형이다.

본 발명의 보다 바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따른 생장성이 개량된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대는, 수탁 번호 FERM BP-22371 또는 FERM BP-22372(후술)와 동일한 식물의 미토콘드리아 게놈을 갖는 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대이고, 더욱 바람직하게는 수탁 번호 FERM BP-22371 또는 FERM BP-22372와 동일한 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대이다.

본 명세서에 있어서, 생장성이 개량된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대의 「식물체의 일부」란, 당해 식물체의 1개 이상의 세포 또는 1개 이상의 세포로부터의 세포질을 포함하는 것이며, 구체적으로는 꽃, 잎, 줄기, 뿌리 등의 기관 또는 조직, 혹은 이들 기관 또는 조직으로부터의 세포(세포로부터 조제된 프로토플래스트를 포함함) 혹은 세포질, 혹은 상기 세포 혹은 세포질의 집합체를 의미한다.

생장성이 개량된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물의 작출 방법

본 발명에 따른 생장성이 개량된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물은, 예를 들어 이하의 수순에 따라 작출할 수 있다.

(1) 높은 재분화능을 갖고, 정상 세포질을 갖는 세포질 수용친의 작출

(2) 프로토플래스트의 조제

(i) 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 종간 잡종 식물의 프로토플래스트의 단리

(ii) 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물의 프로토플래스트의 단리

(3) 프로토플래스트의 융합 처리

(4) 융합 잡종 세포의 배양

(5) 세포질 웅성 불임성을 갖는 세포질 잡종 식물의 선발

(6) 캘러스로부터의 식물체의 재생

(7) 후대의 획득과 우량 계통의 선발

또한 본 명세서에 있어서 「제조 방법」은 「작출 방법」이라고도 바꾸어 말할 수 있다. 즉, 여기서 말하는 「작출」과 「제조」라는 용어는 동등한 의미로 사용된다.

이들 각 공정은, 보다 구체적으로는 이하와 같다.

전술한 바와 같이, CMS를 이용하는 F1 품종의 개발에 있어서 웅성 불임성을 발현시키는 세포질은, 웅성 불임성 이외의 형질에 가능한 한 영향을 미치지 않는 것이 중요하게 된다. 비대칭 세포 융합 기술을 사용하여 세포질 잡종을 작출하는 경우, 미토콘드리아 게놈의 재조합은 랜덤(random)하게 생기기 때문에, 불량 형질을 수반하지 않고, 웅성 불임성을 유지하는 재조합 미토콘드리아가 얻어질 확률은 낮기 때문에, 수많은 세포질 잡종을 작출하여 우량 개체를 선발할 필요가 있다.

그러나, 브라시카 라파 식물은 동일한 브라시카속 식물의 브라시카 올레라세아 식물이나 브라시카 나푸스 식물에 비하여, 비대칭 세포 융합에 의해 얻어진 융합 세포로부터의 식물체의 재생이 곤란하기 때문에, 브라시카 라파 식물의 효율적인 세포질 잡종 식물의 작출 방법은 보고되어 있지 않다. 그 때문에, 수많은 세포질 잡종을 효율적으로 작출하는 방법의 개발이 필요 불가결하다.

또한 여기서 세포질 잡종 식물이란, 세포질이 잡종 상태로 되어 있는 식물을 말하며, 예를 들어 세포 융합(여기서 적합하게는 비대칭 세포 융합)을 행함으로써 얻어지는 것을 말한다.

또한, 연X선 등 방사선을 이용한 비대칭 세포 융합을 실시한 경우, 유채과 식물에서는 세포질 공여친의 단편화된 핵 게놈의 일부가 도입되는 경우가 많고, 융합 세포의 분열이나 융합 세포로부터의 식물체의 재생이 곤란하게 되는 경우가 있다. 따라서, 세포질 수용친의 재분화능을 가능한 한 높여 두는 것은 세포질 잡종을 효율적으로 작출하기 위해 매우 중요하게 된다.

유채과 식물 중에서 브라시카 올레라세아 식물은 배양 세포로부터의 재분화능이 높은 것이 알려져 있다. 그에 비해 브라시카 라파 식물의 재분화능은 낮고, 배양 세포로부터 식물체의 재생에 성공한 예는 특정 품종에 한정되어 있다. 그 때문에, 세포질 잡종의 작출 효율을 높이기 위해서는, 우선 정상 세포질의 브라시카 라파 식물을 종자친, 브라시카 올레라세아 식물을 화분친으로 하여 종간 잡종 식물을 작출하고, 높은 재분화능을 갖는 브라시카 라파 식물과 브라시카 올레라세아 식물의 종간 잡종 식물을 작출하여, 세포질 수용친으로 하는 것이 바람직하다.

이하에 있어서 「높은 재분화능을 갖는 브라시카 라파와 브라시카 올레라세아의 종간 잡종 식물」은, 「브라시카 라파 종간 잡종 식물」이라고 표기하는 경우가 있다. 얻어진 브라시카 라파 종간 잡종 식물은 정상 세포질의 브라시카 라파 식물을 종자친으로 하고 있고, 세포질이 모성 유전됨으로써 정상 세포질의 브라시카 라파와 동일한 세포질을 가지며, 또한 재분화능이 향상되어 있기 때문에, 세포질 수용친의 성질로서 바람직하다.

여기서 「높은 재분화능」이란, 캘러스화된 세포로부터 식물체로의 재분화되는 능력이 높은 것을 말하며, 캘러스를 재분화 배지에 플레이팅한 후 1개월 후의 재분화율(재분화된 캘러스수/재분화 배지에 플레이팅한 캘러스수)이 30％ 이상, 보다 바람직하게는 50％ 이상인 경우를 말한다.

더욱 바람직하게는, 상기 브라시카 라파 종간 잡종 식물을 인위적으로 배가시켜 작출한 복이배체를 종자친, 정상 세포질의 브라시카 라파 식물을 화분친으로 하여 여교잡하고, 얻어진 후대를 조직 배양하여 높은 재분화능을 갖는 개체를 선발하면, 높은 재분화능을 갖는 삼배체의 브라시카 라파 종간 잡종 식물이 얻어진다. 이와 같이, 정상 세포질의 브라시카 라파 식물을 화분친으로 하여 연속 여교잡과, 조직 배양에 의한 높은 재분화능을 갖는 개체의 선발을 반복하면, 최종적으로는 높은 재분화능을 갖고, 핵 게놈이 브라시카 라파에 가까운 이배체의 브라시카 라파 종간 잡종 식물이 얻어진다. 이배체에 근접함에 따라 자성 임성이 높아지기 때문에, 이들 브라시카 라파 종간 잡종 식물을 세포질 수용친으로 하는 것이 바람직하다.

(2) 프로토플래스트의 조제

본 발명에 있어서, 세포질 수용친으로서 사용하는 브라시카 라파 식물은 상기 (1)의 브라시카 라파 종간 잡종 식물, 보다 바람직하게는 더 브라시카 라파를 여교잡하여 육성한 브라시카 라파 종간 잡종 식물을 사용하는 것이 바람직하다.

프로토플래스트를 얻기 위해 사용하는 세포 조직으로서는, 수량성이 높고, 분열 활성이 높은 엽육 조직을 공시(供試)하는 것이 바람직하지만, 배축이나 줄기, 캘러스 등의 다른 조직도 재료로서 사용해도 된다.

프로토플래스트를 단리하는 방법은 당해 기술 분야에 있어서 공지인 통상 사용되는 방법(예를 들어, Matsumoto, E, Plant cell reports, 1991. vol9(10) 등에 기재된 방법)이어도 되며, 특별히 제한되지 않는다. 이하는 구체예로서의 수순을 나타내지만, 본 발명은 반드시 그것에 구속되는 것은 아니다.

우선, 브라시카 라파 식물의 세포 조직을 세절하고, 프로토플래스트 단리용 효소 용액을 사용하여 효소 처리함으로써 프로토플래스트를 단리한다. 이 용액은 주로 세포벽 분해 효소, 침투압 조정제를 포함하는 무기염 완충액이다. 세포벽 분해 효소로서는, 식물의 세포벽의 분해에 사용할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제 등을 들 수 있다. 본 발명에서는 셀룰라아제 Y-C와 마세로자임 R-10의 조합이 바람직하다.

침투압 조정제로서는 일반적인 당알코올류, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 글루코오스 등을 사용할 수 있으며, 만니톨이 바람직하고, 0.3M 내지 0.7M의 농도의 만니톨이 특히 바람직하다. 또한, 효소 용액에는, 프로토플래스트의 막의 안정화를 위해 무기염을 첨가하는 것이 바람직하며, 예를 들어 하기 표 1에 기재된 조성의 CPW염(Cocking and Peberdy, 1974)을 첨가하면 적합하다. 효소 처리는 25 내지 30℃에서 8 내지 20시간 정치 처리하면 적합하다.

[표 1]

효소 처리에 의해 단리한 프로토플래스트를 30 내지 100㎛의 공경의 나일론 메쉬로 여과하고, 원심 분리하여 프로토플래스트를 모아 효소액을 제거한다. 다음에 프로토플래스트를 세정액에 현탁하고, 프로토플래스트를 세정한다. 세정액으로서는, 일반적으로 사용되는 CPW염 용액에 침투압 조정제로서 당알코올류를 첨가한 것을 사용할 수 있다.

다음에, 브라시카 라파 종간 잡종 식물 프로토플래스트의 단독으로의 분열을 방지하기 위해 불활성화 처리를 행하는 것이 바람직하다. 불활성화 처리는 요오도아세트산, 요오도아세트아미드 등의 요오드 화합물을 용해한 CPW염 용액 등에 프로토플래스트를 현탁시킴으로써 행할 수 있다. 본 발명에서는 요오도아세트아미드를 5mM 내지 30mM의 농도로 조정한 CPW 용액에 현탁하여 5 내지 20분간 처리를 행하면 적합하다.

다음에 원심 분리기를 이용하여 CPW염 용액에서의 세정 조작을 1 내지 3회 반복하는 것이 바람직하다. 프로토플래스트의 현탁액에는 도관이나 세포의 단편도 혼입되기 때문에, 밀도 구배 원심 분리법 등에 의해 프로토플래스트를 더 정제하는 것이 바람직하다.

정제에 사용하는 시약에는 당류, 합성 콜로이드 등을 들 수 있지만, 본 발명에서는 자당액의 이용이 적합하며, 15％ 내지 20％의 자당액의 이용이 특히 적합하다. 프로토플래스트의 정제 후, 혈구 계산판에 의해 세포 밀도를 계측하고, 세포 융합에 적합한 세포 밀도가 되도록 CPW염 용액에 의해 액량을 조정한다. 프로토플래스트의 세포 밀도는 1×10⁵ 내지 1×10⁷세포/ml가 바람직하며, 액량의 조정에는 CPW염 용액의 이용이 바람직하다.

세포질 공여친으로서 사용하는 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물은 특별히 제한되지 않지만, 가부시키가이샤 사카타노타네에서 개발되고, 브라시카 올레라세아 작물에서 사용되고 있는 CMS 계통 "양배추 MS-2"(일본 특허 공개 평07-031307호 공보)의 사용이 바람직하다. "양배추 MS-2"의 세포질은 시판 중인 브로콜리 품종 "그랜돔", "픽셀" 등에서 사용되고 있으며, 용이하게 입수할 수 있다. "양배추 MS-2"의 세포질은 직접 이용하는 것도 가능하지만, 추가로 관용의 브라시카 라파 식물의 연속 여교잡에 의한 핵 치환을 행하여, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물을 작출하여 사용하는 것이 보다 바람직하다.

기존의 세포질 웅성 불임 식물의 프로토플래스트의 단리는, 예를 들어 상술한 브라시카 라파 종간 잡종 식물의 프로토플래스트의 단리와 마찬가지의 방법에 따라 행할 수 있다.

단리한 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물의 프로토플래스트는, 방사선 처리에 의해 핵을 불활성화한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 방사선 처리를 위해 조사하는 방사선으로서는 X선, γ선, 자외선 등을 들 수 있지만, 핵을 파괴할 수 있으면 특별히 한정되는 것은 아니다. 조사선량은 핵을 파괴할 수 있는 범위에서, 가능한 한 저조사량으로 행하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명에서의 연X선의 조사인 경우 100Gy 내지 900Gy의 조사량이 바람직하다.

(3) 프로토플래스트의 융합 처리

다음에, 상기에서 얻어진 양종(兩種)의 프로토플래스트를 혼합하여 세포 융합을 행한다.

융합 방법으로서는 관용의 방법, 예를 들어 공지된 전기 융합법(Planta, 151, 26-32, 1981), PEG(폴리에틸렌글리콜)법(Planta, 120, 215-227, 1974), 덱스트란법(Jap. J. Genet., 50, 235, 1975) 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에서 바람직하게는 PEG법을 사용한다.

(4) 융합 잡종 세포의 배양

융합 처리하여 얻어진 세포는 브라시카 라파 종간 잡종 식물 유래의 프로토플래스트의 배양에 적합한 배지에서 배양하는 것이 바람직하다. 높은 재분화능을 갖는 브라시카 라파와 브라시카 올레라세아의 종간 잡종 식물 유래의 프로토플래스트의 배양 방법으로서는, 브라시카류의 프로토플래스트의 배양법에 기초하여 적절하게 개변을 행하면 특별히 한정되지 않지만, 본 발명에서는 NH₄NO₃을 200mg/l로 저감시킨 1/2 농도의 MS 배지를 기본 배지로 하여, 적절하게 식물 생장 조정 물질, 각종 첨가물 등을 첨가하여 사용하는 것이 바람직하다.

(5) 세포질 웅성 불임성을 갖는 세포질 잡종 식물의 선발

융합 세포의 배양을 행하고, 세포 분열이 개시되어, 캘러스가 눈으로 보아 확인할 수 있게 된 단계에서, 캘러스를 캘러스 증식 배지에 이식한다. 캘러스 증식 배지는 관용의 것을 사용할 수 있으며, 재료로 하는 식물의 유전자형이나 캘러스의 상태에 따라 반응의 차는 있지만, 예를 들어 1.0 내지 5.0mg/l NAA 및 0.1 내지 3.0mg/l 4-CPPU를 포함하는 MS 배지 등을 사용하면 적합하다.

오구라 CMS의 세포질 웅성 불임성의 원인 유전자는 미토콘드리아 게놈에 있는 orf138로 특정되어 있다. 따라서, 얻어진 캘러스로부터 세포질 웅성 불임성을 갖는 개체를 선발하기 위해서는, 상기 수순으로 증식한 캘러스로부터 DNA를 추출하고, orf138을 특이적으로 증폭할 수 있는 마커를 사용하여, PCR법에 의해 검출하는 것이 바람직하다.

(6) 캘러스로부터의 식물체의 재생

얻어진 orf138을 갖는 캘러스를 재분화 배지에 이식하고 재분화시킨다.

재분화 배지는 관용의 것을 사용할 수 있으며, 재료로 하는 식물의 유전자형이나 캘러스의 상태에 따라 반응의 차는 있지만, 예를 들어 0.1 내지 1.0mg/l의 NAA 및 0.1 내지 1.0mg/l의 4-CPPU를 포함하는 MS 배지 등을 사용하면 적합하다.

재생된 싹은 3％ 자당, 0.8％ 한천을 첨가한 MS 배지 등에 이식하여 발근시키고, 식물체를 재생시킨다. 재생된 식물체는 순화하여 온실 내에서 육성한다.

유채과 식물의 비대칭 세포 융합에 있어서는 일반적으로 방사선 처리에 의해 세포질 공여친의 핵을 파괴시키는데, 핵 게놈의 파괴는 완전하지 않고, 게놈의 일부가 세포질 수용친에 도입되는 경우가 많다. 또한, 비대칭 세포 융합 시에, 세포질 공여친 유래의 프로토플래스트 또는 세포질 수용친의 프로토플래스트가 복수 융합되는 경우도 있기 때문에, 이수체나 고차 배수체가 발생하는 경우가 많다. 팔배체 이상의 고차 배수체는 재분화가 곤란할 가능성이 높고, 또한 자성 임성의 저하에 의해 후대를 얻기가 곤란하기 때문에, 플로 사이토메트리로 DNA 함량을 측정하고, 팔배체 이상의 고차 배수체를 배제해 두는 것이 바람직하다.

비대칭 세포 융합에 의한 미토콘드리아 게놈의 재조합은 고빈도이며 랜덤(random)으로 생기기 때문에, 50개체 이상의 세포질 잡종 식물을 작출하는 것이 바람직하다.

(7) 후대의 획득과 우량 계통의 선발

얻어진 세포질 잡종 식물을 육성하고 개화시키고, 웅성 불임 형질을 갖는 개체를 선발하고, 정상 세포질을 갖는 임의의 브라시카 라파 식물을 화분친으로 하여 교배한다.

세포질 잡종 식물은 이수체나 고차 배수체인 경우가 많고 후대의 획득이 어렵기 때문에, 화분친은 유전적으로 다양한 복수의 정상 세포질을 갖는 임의의 브라시카 라파 식물을 사용하는 것이 바람직하다. 얻어진 세포질 잡종 식물로부터 후대를 획득하기 위해서는 배배양을 필요로 하는 경우가 많다.

배배양은 수분(受粉) 후의 배의 생장이 불충분하고, 그 상태로는 고사하는 경우에 배를 적출하여 적절한 배지 상에서 배를 생장시키는 기술이다. 배배양의 방법은 관용의 방법으로 행할 수 있지만, 본 발명에서는 교배 후 7일 내지 10일째의 배주로부터 배를 적출하고, 3％ 자당, 10％ 코코넛 물(Sigma-Aldrich), 0.8％ 한천을 첨가한 1/2 농도의 MS 배지 상에서 배양하는 것이 바람직하다. 재생된 싹은 3％ 자당, 0.8％ 한천을 첨가한 MS 배지 등에 이식하여 발근시키고, 식물체를 재생시킨다. 재생된 식물체는 순화하여 온실 내에서 육성한다. 재생된 식물체가 개화되었으면, 웅성 불임성의 개체를 선발한다.

이 정상 세포질을 갖는 임의의 브라시카 라파 식물을 화분친으로 하는 교배와 그 후의 배배양은, 웅성 불임성의 개체로부터 후대 종자가 얻어질 때까지 계속한다. 후대 종자가 얻어지게 된 개체는 특정의 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물을 화분친으로 하여 연속 여교잡을 행한다. 여기서, 특정의 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물은, 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물에 연속 여교잡을 행한 경우에, 생장성이 현저하게 저하되는 유전적으로 고정된 계통을 미리 선정해 두는 것이 바람직하다.

특정의 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물을 화분친으로 하여 반복 교배함으로써, 핵 게놈이 특정의 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물과 동일하게 되므로, 세포질의 특성을 비교하여 선발하는 것이 가능하게 된다. 연속 여교잡은 충분한 핵 치환을 행하기 위해 7회 이상 행하는 것이 바람직하다. 연속 여교잡이 완료된 계통은, 특정의 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물과의 비교를 행하여, 세포질 웅성 불임성의 형질을 갖고, 그 밖의 불량 형질을 수반하고 있지 않는 것을 확인한다.

실시예

이하의 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 생장성이 개선된 오구라 CMS 브라시카 라파 식물의 작출 방법

브라시카 라파에서는 일반적으로 재분화능이 낮기 때문에, 높은 재분화능을 부여할 목적으로, 브라시카 라파 "SH"를 종자친, 콜리플라워 "WC"를 화분친으로 하여 교배를 행하였다. 교배 후 10일째의 배주로부터 무균 환경 하에서 배를 적출하고, 3％ 자당, 10％ 코코넛 물(Sigma-Aldrich), 0.8％ 한천을 첨가한 1/2 농도의 MS 배지에 플레이팅하고, 배배양을 행하였다. 2주간 후, 생장한 유식물을 3％ 자당, 0.8％ 한천을 첨가한 MS 배지에 이식하였다. 배배양에 의해 6개체의 종간 잡종(F1)을 획득하였다.

"SH" 및 각 종간 잡종의 잎꼭지를 5mm의 길이로 절단하고, 1mg/l 2,4-D, 3％ 자당, 0.8％ 한천을 첨가한 MS 배지에 플레이팅하고, 3주간 배양하였다. 1㎝ 정도의 크기로 생육한 캘러스를 1mm의 크기로 잘라 나누고, 0.3mg/l 4-CPPU, 0.3mg/l NAA, 3％ 자당, 0.8％ 한천을 첨가한 MS 배지에 플레이팅하고, 1개월간 배양하고, 재분화율을 조사하였다.

결과는 표 2에 나타낸 바와 같았다.

[표 2]

표 2에서 "SH" 유래의 캘러스는 재분화되지 않았지만, 종간 잡종에서는 높은 재분화능을 갖는 개체가 얻어졌다. 가장 재분화율이 높았던 계통 "SH-WC4"를 콜히친 처리에 의해 인위적으로 배가시키고 복이배체화하였다. 이후, 복이배체화한 "SH-WC4"를 "SH-WC4D"라고 표기한다. "SH-WC4D"를 종자친, 브라시카 라파의 "S"를 화분친으로 하여 교배하였다. 교배 후 10일째의 배주로부터 무균 환경 하에서 배를 적출하고, 3％ 자당, 10％ 코코넛 물(Sigma-Aldrich), 0.8％ 한천을 첨가한 1/2 농도의 MS 배지에 플레이팅하고, 배배양을 행하였다. 2주간 후, 생장한 유식물을 자당 30g/l를 첨가한 MS 배지에 이식하였다. 배배양에 의해 7개체의 종간 잡종(F1BC1)을 획득하였다.

각 종간 잡종(F1BC1)의 잎꼭지를 마찬가지로 5mm의 길이로 절단하고, 1mg/l 2,4-D, 3％ 자당, 0.8％ 한천을 첨가한 MS 배지에 플레이팅하고, 3주간 배양하였다. 1㎝ 정도의 크기로 생육한 캘러스를 1mm의 크기로 잘라 나누고, 0.3mg/l 4-CPPU, 0.3mg/l NAA, 3％ 자당, 0.8％ 한천을 첨가한 MS 배지에 플레이팅하고, 1개월간 배양하여 재분화율을 조사하였다.

결과는 표 3에 나타낸 바와 같았다.

[표 3]

표 3의 결과로부터, F1BC1에 있어서도 계통간에 따라 차는 있지만, 높은 재분화율을 나타내는 계통이 얻어졌다. SH-WC4D-S1, SH-WC4D-S3, SH-WC4D-S5, SH-WC4D-S7은 재분화율이 61％로 동일하였지만, 가장 자성 임성이 높은 "SH-WC4D-S5"를 종자친으로서 선정하였다. "SH-WC4D-S5"를 종자친으로 하고, 또한 브라시카 라파 식물의 여교잡을 행하는 것이 바람직하지만, "SH-WC4D-S5"는 복이배체의 이배체를 교배하였기 때문에 이질 삼배체로 되어 있어, 후대를 얻기 어려울 것으로 예상되었다.

따라서 후대를 얻기 위해서는, 여러 가지 유전자형의 브라시카 라파 식물을 화분친에 사용하는 것이 필요하다고 생각되었기 때문에, "SH", "OS", "S", "W"의 4계통을 화분친으로서 준비하여 교배를 행하였다. 그러나, 수교배에서는 전혀 후대가 얻어지지 않았기 때문에, 폐쇄계 온실 내에 "SH-WC4D-S5"를 종자친으로서 배치하고, 그 옆에 상기 4계통의 브라시카 라파 식물을 배치하여 충매에 의한 교배를 행하였다. 종간 잡종의 후대는 일반적으로 고온 하에서 얻어지기 쉽기 때문에, 온실의 온도는 낮 온도 32℃, 밤 온도 15℃로 제어하였다. 충매에 의한 교배 결과 약 100알의 종자가 얻어졌지만, 사이즈가 작은 종자가 많았다. 통상의 브라시카 라파 식물의 종자의 크기에 가까운 종자를 37알 선택하고, 시험관 내(in vitro)에서 무균 파종을 행한 바, F1BC2가 되는 36개체의 브라시카 라파 종간 잡종 식물이 발아되었다. 발아된 개체의 계통명을 각각 "SH-WC4D-S5-X1 내지 36"으로 하였다.

각 종간 잡종(F1BC2)의 개체의 잎꼭지를 5mm의 길이로 절단하고, 1mg/l 2,4-D, 3％ 자당, 0.8％ 한천을 첨가한 MS 배지에 플레이팅하고, 3주간 배양하였다. 1㎝ 정도의 크기로 생육된 캘러스를 1mm의 크기로 잘라 나누고, 0.3mg/l 4-CPPU, 0.3mg/l NAA, 3％ 자당, 0.8％ 한천을 첨가한 MS 배지에 플레이팅하고, 1개월간 배양하여 재분화율을 조사하였다.

결과는 표 4에 나타낸 바와 같았다.

[표 4]

표 4의 결과로부터 F1BC2는 계통간에 따라 차가 크지만, "SH-WC4D-S5-X12"가 재분화율 83％, "SH-WC4D-S5-X32"가 재분화율 89％로 높은 재분화율을 나타내었다. "SH-WC4D-S5-X12"는 자성 임성이 낮기 때문에, 자성 임성이 높은 "SH-WC4D-S5-X32"를 세포질 수용친으로서 공시하는 것으로 하였다.

(2) 프로토플래스트의 조제

정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 종간 잡종 식물로서 "SH-WC4D-S5-X32"를 사용하였다. "SH-WC4D-S5-X32"는 3％ 자당, 0.8％ 한천을 첨가한 MS 배지에 이식하고, 1개월간 육성하였다. 전개한 본엽을 약 1g 채취하고, 약 2mm의 크기로 세절한 후에, 0.3％ 셀룰라아제 Y-C, 0.3％ 마세로자임 R-10, 0.5M 만니톨을 포함하는 CPW염 용액 10ml에 침지하고, 25℃, 16시간 정치하였다.

잎 조직을 포함하는 효소액을 92㎛의 나일론 메쉬로 여과하여, 세포 잔사를 제거하였다. 얻어진 프로토플래스트 현탁액을 원침관에 옮기고, 800rpm으로 5분간의 원심 분리를 행하였다. 상청을 제거하여 얻어진 프로토플래스트를 15mM의 요오도아세트아미드를 포함하는 CPW염 용액 5ml에 현탁하고, 4℃에서 15분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 요오도아세트아미드 처리한 프로토플래스트 현탁액을 800rpm으로 5분간의 원심 분리를 행한 후, 상청을 제거하였다. 프로토플래스트 현탁액에 CPW염 용액 10ml를 첨가하고, 800rpm으로 5분간의 원심 분리를 행하여 상청을 제거하는 조작을 3회 반복하고, 프로토플래스트를 세정하였다.

세정된 프로토플래스트 현탁액을 800rpm으로 5분간의 원심 분리를 행하고, 상청을 제거하고 2ml의 CPW염 용액을 첨가하여 프로토플래스트를 현탁시켰다. 새로운 원침관에 20％ 자당을 첨가한 CPW염 용액 5ml를 첨가하고, 그 위에 상기 프로토플래스트의 현탁액을 중층(重層)시키고, 800rpm으로 5분간의 원심 분리를 행하였다. 세포 잔사는 원침관의 바닥에 가라앉고, 정제된 프로토플래스트가 상층의 CPW염 용액층 중에 부상하므로 파스퇴르 피펫으로 새로운 원침관에 옮겼다. 현탁액을 소량 취하고 혈구 계산판을 사용하여 프로토플래스트의 세포 밀도를 구하고, CPW액을 첨가하여 1×10⁶개/ml로 조제하였다.

(ii) 기존의 오구라 CMS 브라시카 라파 식물의 프로토플래스트의 단리

기존의 오구라 CMS 브라시카 라파 식물로서, 교배에 의해 브라시카 올레라세아로부터 브라시카 라파로 핵 치환시킨 "양배추 MS-2" 유래의 CMS 계통 "HA280"을 사용하였다.

우선, 멸균한 종자를 3％ 자당, 0.8％ 한천을 첨가한 MS 배지에 플레이팅하고, 20℃, 16시간 조명 하에서 약 1개월간 육성하였다. 전개한 본엽 약 1g을 채취하고, 약 2mm의 크기로 세절한 후에, 0.3％ 셀룰라아제 Y-C, 0.3％ 마세로자임 R-10, 만니톨을 포함하는 CPW염 용액 10ml에 침지하고, 25℃, 16시간 정치하였다.

잎 조직을 포함하는 효소액을 92㎛의 나일론 메쉬로 여과하여, 세포 잔사를 제거하였다. 파스퇴르 피펫으로 프로토플래스트를 플라스틱 샤알레에 옮기고, 연X선을 900Gy 조사하였다.

얻어진 프로토플래스트 현탁액을 원침관에 옮기고, 800rpm으로 5분간의 원심 분리를 행하고, 상청을 제거하고 2ml의 CPW염 용액을 첨가하여 프로토플래스트를 현탁시켰다. 새로운 원침관에 20％의 자당을 첨가한 CPW염 용액 5ml를 첨가하고, 그 위에 상기 프로토플래스트의 현탁액을 중층시키고, 800rpm으로 5분간의 원심 분리를 행하였다. 세포 잔사는 원침관의 바닥에 가라앉고, 정제된 프로토플래스트가 상층의 CPW염 용액층 중에 부상하므로 파스퇴르 피펫으로 새로운 원침관에 옮겼다. 현탁액을 소량 취하고 혈구 계산판을 사용하여 프로토플래스트의 세포 밀도를 구하고, CPW염 용액을 첨가하여 1×10⁶개/ml로 조제하였다.

(3) 프로토플래스트의 융합 처리

요오도아세트아미드 처리한 브라시카 라파 종간 잡종 식물 프로토플래스트 현탁액과, 연X선 조사한 기존의 오구라 CMS 브라시카 라파 식물 프로토플래스트 현탁액을 1:3의 비율로 혼합하고, 9㎝ 샤알레의 저면 중앙에 혼합액을 2ml 적하하였다. 30분간 정치 후, 500g/l PEG 용액(폴리에틸렌글리콜 #6000(nacalai tesque Inc.), 1,500mg/l CaCl₂ㆍ2H₂O, 100mg/l KH₂PO₄, pH5.5) 3ml를 프로토플래스트 혼합액의 주변에 적하하였다.

1분 후 CPW염 용액 3.5ml를 프로토플래스트 혼합액의 주변에 적하하였다. 또한 2분 후 CPW염 용액 3.5ml를 프로토플래스트 혼합액의 주변에 적하하였다. 5분 후 샤알레의 에지로부터, 적하한 액을 조심히 빨아 올려 제거하고, CPW염 용액 20ml를 샤알레의 에지로부터 첨가하였다. 이 CPW염 용액에서의 세정 조작을 5분 간격으로 3회 반복하였다.

(4) 융합 잡종 세포의 배양

세정액을 제거 후, 0.5M 만니톨, 150mg/l 카사미노산, 100mg/l L-글루타민, 0.03mg/l NAA, 0.03mg/l 2,4-D, 0.1mg/l BA 및 1％ 자당을 포함하고, NH₄NO₃을 200mg/l로 저감시킨 1/2 농도의 MS 배지 10ml(pH5.8)를 첨가하고, 25℃ 암소에 있어서 배양하였다.

배양 개시로부터 5일 후, 150mg/l 카사미노산, 100mg/l L-글루타민, 0.03mg/l NAA, 0.03mg/l 2,4-D, 0.1mg/l BA 및 1％ 자당을 포함하고, NH₄NO₃을 200mg/l로 저감시킨 1/2 농도의 MS 배지 5ml(pH5.8)를 첨가하고, 만니톨 농도를 저하시켜 배양을 계속하였다.

배양 개시로부터 10일 후, 샤알레 바닥에 부착된 세포를 핀셋 끝으로 문지르듯이 하여 벗기고, 0.2M 만니톨, 4％ 자당, 0.6％ 젤란 검을 포함하는 용액 7.5ml를 첨가하고, 혼합함으로써 반고체화 상태의 겔 배지를 형성시키고 배양을 계속하였다.

배양 개시 약 1개월에서 캘러스를 육안으로 확인할 수 있게 되었기 때문에, 캘러스를 캘러스 증식 배지(1mg/l 4-CPPU, 3mg/l NAA, 3.0％ 자당, 0.8％ 한천을 포함하는 MS 배지, pH5.8)에 이식하였다. 캘러스는 13회의 융합 처리 실험으로부터 464개체가 얻어졌다.

(5) 세포질 웅성 불임성을 갖는 세포질 잡종 식물의 선발

오구라 CMS의 세포질 웅성 불임성의 원인 유전자는 미토콘드리아 게놈에 있는 orf138로 특정되어 있다. PCR법에 의해 오구라 CMS에 특이적인 DNA를 검출하기 위해, 공지된 염기 서열 정보(Gene Bank 등록번호 AB055435.1)로부터 orf138 유전자에 특이적인 프라이머를 설계하였다(표 5).

[표 5]

캘러스가 5mm 이상의 크기로 생육된 단계에서, 캘러스의 일부를 샘플링하여 DNA를 추출하였다. 추출한 전체 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 orf138-1F와 orf138-2R의 각 조합을 사용하여 PCR을 행하였다. PCR은 열변성 94℃ 1분, 어닐링 60℃ 2분, 신장 반응 72℃ 2분을 35사이클 반복하였다.

PCR 산물은 1.8％ 아가로오스 겔에서 전기 영동하고, 에티듐브로마이드 용액에 침지 후, UV 조사 하에서 사진 촬영을 행하여 예상되는 사이즈(376bp)의 밴드를 갖는 개체를 선발하였다. (4)에서 얻어진 464개의 캘러스를 상기 PCR법에 의해 orf138 유전자의 유무를 조사한 바, 154개의 캘러스가 orf138 유전자를 갖고 있고, 세포질 잡종 세포라고 생각되었다.

(6) 캘러스로부터의 식물체의 재생

캘러스가 1㎝ 정도의 크기로 되었을 때, 캘러스를 2mm 정도의 사이즈로 잘라 나누고, 재분화 배지(0.3mg/l 4-CPPU, 0.3mg/l NAA, 3.0％ 자당, 0.8％ 한천을 포함하는 MS 배지, pH5.8)에 이식하였다.

캘러스는 재분화 배지에 이식 후 2주간에서 싹의 분화를 개시하였다. 분화된 싹을 3.0％ 자당, 0.8％ 한천을 포함하는 MS 배지(pH5.8)에 이식함으로써 발근시켰다. (5)에서 orf138 유전자를 갖고 있었던 154개의 캘러스를 재분화 배지에 이식하고, 계대시킴으로써 68계통의 재분화 식물이 얻어졌다. 세포질 잡종 식물은 50 구멍 셀 트레이에 이식하여 순화를 행하고, 순화 후에는 유리 온실 내에서 육묘를 행하였다.

세포질 잡종 식물의 배수성을 플로 사이토미터에 의해 검정한 바, 이수성을 포함하는 이배체 내지 팔배체였다.

세포질 수용친인 브라시카 라파 종간 잡종 식물 "SH-WC4D-S5-X32"는 이배체인데, 세포질 잡종 식물이 고차 배수성이 된 것은, 비대칭 세포 융합 시에 복수의 브라시카 라파 종간 잡종 식물 유래 프로토플래스트가 융합되었기 때문이라고 생각되었다. 또한, 이수성이 된 것은, 연X선을 조사한 세포질 제공친의 게놈의 일부가 도입되었기 때문이라고 생각되었다. 배수성이 팔배체 이내인 식물은 후대가 얻어질 가능성이 있기 때문에, 본 실험에서는 전체 개체의 육묘를 계속하였다.

세포질 잡종 식물은 유리 온실에서 1개월간 육묘한 후, 4℃ 설정의 냉장고(8시간 조명)에 입고하고, 2개월간 춘화 처리를 행하였다. 춘화 처리 후, 세포질 잡종 식물은 15㎝ 포트에 이식하였다.

춘화 처리 후 1 내지 2개월 동안에 68계통의 세포질 잡종 식물 중 49계통이 개화에 이르렀지만, 11계통은 형태 이상으로 인해 개화에 이르지 못하고, 8계통은 유전적 약세로 인해 고사되었다. 개화된 49계통 중, 웅성 불임성을 발현한 계통은 29계통이고, 남은 20계통은 웅성 가임이었다. 웅성 가임이었던 20계통 중 1계통은 orf138 유전자가 소실되었지만, 19계통은 orf138 유전자를 유지하고 있음에도 불구하고, 완전 혹은 부분적인 웅성 가임을 나타내었다.

일반적으로, 비대칭 세포 융합에 의해 작출된 세포질 잡종 식물은 미토콘드리아 게놈이 재조합되어, 헤테로플라스미 상태가 5세대 이상 계속된다고 생각되고 있다. 따라서, orf138 유전자는 미토콘드리아가 헤테로플라스미 상태로부터 호모플라스미 상태를 향하는 과정에서 완전히 소실되었다고 생각되었다. 또한, orf138 유전자가 도입되어 있어도, 그의 양적 부족 등으로 웅성 불임성이 불안정해지는 케이스도 고려되었다.

웅성 불임성을 발현한 29계통을 종자친으로 하고, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물 "OS"를 화분친으로 하여 온실에 넣고 충매에 의한 교배를 행하였다.

그 결과, 웅성 불임 계통 17계통으로부터 후대 종자 BC1을 얻을 수 있었다. BC1 계통을 육성한 바, 17계통 중 10계통은 웅성 임성이 부분적으로 회복되었기 때문에 폐기하였다. 웅성 불임성을 유지하고 있었던 7계통은, 정상 세포질을 갖는 4계통의 브라시카 라파 식물 "SH", "OS", "S", "W"를 화분친으로 하여 충매에 의한 교배를 더 행하였다. 그 결과, 모든 7계통으로부터 후대 종자 BC2를 얻을 수 있었다.

BC2 세대에서는 종자가 용이하게 얻어지게 되었기 때문에, BC3 이후는 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물 "SH"를 사용하는 것으로 하였다. "SH"는 이전의 시험에 있어서 기존의 오구라 CMS 브라시카 라파 식물에 연속 여교잡한 경우에, 현저하게 생장성의 저하를 나타내는 것을 알 수 있었다. 즉, 굳이 생장성이 저하되기 쉬운 "SH"를 연속 여교잡의 화분친으로서 사용함으로써, 세포질의 영향에 의한 생장성의 저하가 검출되기 쉬워지기 때문에, 생장성이 저하되지 않는 CMS 계통의 선발이 가능하게 된다.

상기 웅성 불임성을 나타내는 세포질 잡종 7계통을 종자친으로 하고, "SH"를 화분친으로 하여 연속 여교잡을 진행시켰다. 각 세대에서 "SH"와 동등 이상의 생장성을 나타내는 개체를 선발하고, "SH"를 7회 교배한 BC7(브라시카 라파의 여교배로서는 BC9)까지 반복하였다.

각 세포질 잡종의 계통은, 연속 여교잡의 과정에서 헤테로플라스미에 의한다고 생각되는 특성의 차이로부터 많은 분계로 나누거나 하였지만, 생장성, 웅성 불임성의 안정성, 채종성, 꽃 모양으로부터 선발을 반복하여, 최종적으로 형질이 가장 우수한 "J1"을 선발하였다. "J1"은 연속 여교잡의 각 세대에서 계분되어 있었는데, 생장성의 차이로부터 "J1-3" 및 "J1-7"의 2계통을 최종적으로 선발하였다. 즉, "J1"의 분계인 "J1-3" 및 "J1-7"은 동일한 융합 세포로부터 생긴 계통이지만, 세포 융합 후의 미토콘드리아가 헤테로플라스미 상태로부터 호모플라스미 상태를 향하는 과정의 BC4 세대에서 분계가 되었다. "J1-3"은 생장성이 정상 세포질 계통을 상회하고, "J1-7"은 정상 세포질 계통과 동등하거나 약간 상회하는 생장성을 나타내었다.

"J1-3" 및 "J1-7"의 2계통의 BC7의 종자는 각각 2018년 12월 12일자로 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 생물 기탁 센터(지바켄 기사라즈시 가즈사 가마타리 2-5-8 120호실)에 국제 기탁(원기탁)되어 있다. 이들 계통의 기탁자가 붙인 식별을 위한 표시 및 수탁 번호는 이하와 같다:

<J1-3>

기탁자가 붙인 식별을 위한 표시: SSC-GCC-18-001

수탁 번호: FERM BP-22371,

<J1-7>

기탁자가 붙인 식별을 위한 표시: SSC-GCC-18-002

수탁 번호: FERM BP-22372.

실시예 2: "J1-3" 및 "J1-7"의 생장성의 평가

실시예 1에 의해 작출된 개량 CMS 계통의 유용성을 확인하기 위해, 정상 세포질, CMS 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물의 생장성의 비교 시험을 행하였다.

실시예 1에서도 기재한 바와 같이, "SH"는 기존의 오구라 CMS 브라시카 라파 식물에 연속 여교잡한 경우에 현저하게 생장성이 저하되는 것을 알 수 있었다. 따라서, 이 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물 "SH"를 각 세포질 웅성 불임 계통에 연속 여교잡하는 핵 치환에 의해, 각 세포질 웅성 불임 계통의 핵 게놈이 "SH"와 동일하게 됨과 함께 생장성의 저하를 검출하기 쉬워진다. 따라서, 각 세포질 웅성 불임 계통을 동일 조건에서 재배함으로써, 세포질의 차이에 따른 생장성을 평가할 수 있다.

오구라 CMS를 사용하고 있는 브라시카 라파 식물로서는, 중국의 호티 종쯔 요셴공쓰가 육성하고, 중국에서 종자가 판매되고 있는 "보라배추"가 알려져 있다. 또한, 일본에서도 와타나베 노지 가부시키가이샤로부터 "니 하오 펑"의 종자가 판매되고 있으며, 모두 청경채의 품종으로 되어 있다.

또한, 가부시키가이샤 사카타노타네에서는 브라시카 올레라세아, 브라시카 라파 식물에 있어서 클로로시스를 일으키지 않는 오구라 CMS인 "양배추 MS-2"가 개발되어 있다.

이들 시판되고 있는 2품종의 CMS 계통과, 사카타노타네가 보유하는 1계통의 CMS 계통, 및 본 발명에서 작출한 개량 CMS 계통 "J1-3" 및 "J1-7"에 대하여 "SH"의 연속 여교잡을 행하였다.

각 CMS 계통의 생장성을 정확하게 평가하기 위해, "SH"와 상기 5계통의 CMS 계통으로부터 동일 환경 하에서 충매에 의한 채종을 행하였다.

채종한 "SH" 및 각 CMS 계통의 종자를 50 구멍 셀 트레이에 파종하고, 낮 온도 20℃, 밤 온도 10℃, 16시간 조명으로 설정한 인공 기상실 내에서 재배를 행하였다. 유묘의 생장성을 정량적으로 평가하기 위해, 파종 2주간 후에 각 계통의 유묘의 지상부를 밑둥 쪽에서 잘라내고, 그루당의 중량을 계량하여 표 6에 나타내었다. 표 중의 세대는 "SH"를 연속 여교잡한 횟수를 나타내고 있고, 예를 들어 BC7은 "SH"를 화분친으로 하여 7회의 연속 여교배를 행한 것을 의미한다.

[표 6]

표 6에 기재된 바와 같이, "보라배추", "니 하오 펑", "양배추 MS-2" 유래의 기존의 오구라 CMS 계통은 "SH"에 대한 지상부 중량의 상대값이 각각 60.7, 76.0, 63.4가 되어 낮은 생장성을 나타내었다. 그에 비해, 개량 CMS 계통 "J1-3"은 "SH"에 대한 지상부 중량의 상대값이 130.0이 되어 매우 높은 생장성을 나타내었다. 또한, 개량 CMS 계통 "J1-7"은 "SH"에 대한 지상부 중량의 상대값이 105.5가 되어, "SH"와 동등한 생장성을 나타내었다.

다음에, 농작물로서 수확하는 스테이지에 있어서의 생장성을 평가하기 위해, "SH" 및 각 CMS 계통의 종자를 9㎝ 경질 포트에 파종하고, 낮 온도 25℃, 밤 온도 15℃로 설정한 유리 온실에서 재배를 행하였다.

모종의 생장성을 정량적으로 평가하기 위해, 파종 46일 후에 각 계통의 모종의 지상부를 밑둥 쪽에서 잘라내고, 그루당의 중량을 계량하여 표 7에 나타내었다. 표 6의 유묘에서의 생장성의 평가 시험에서는, "니 하오 펑" 유래의 기존의 오구라 CMS 계통을 시험에 포함시키고 있었다. 그러나, 후술하는 실시예 3의 미토콘드리아 게놈의 분석으로부터, "보라배추"와 "니 하오 펑" 유래의 기존의 오구라 CMS 계통은 동일한 세포질을 갖고 있다고 생각되었기 때문에, "니 하오 펑" 유래의 기존의 오구라 CMS 계통의 수확 스테이지에 있어서의 생장성 시험을 생략하였다.

[표 7]

표 7에 기재된 바와 같이, "보라배추" 유래 CMS 계통은 "SH"에 대한 지상부 중량의 상대값이 77.8이 되고, "양배추 MS-2" 유래 CMS 계통은 "SH"에 대한 지상부 중량의 상대값이 85.3이 되어 생장성의 저하가 확인되었다.

유묘에서의 시험에 비하여 전체적으로 생장성의 저하는 작게 되어 있지만, 이것은 비교적 장기의 포트 재배에 의해 용토 내의 비료 성분의 제한된 영향이 고려되었다. 표 6과 표 7의 결과를 비교하면, 각 CMS 계통의 생장성 저하의 순위에는 상관이 있었다. 따라서, "보라배추", "니 하오 펑", "양배추 MS-2" 유래의 기존의 오구라 CMS 계통은 "SH"의 핵 게놈의 배경에 있어서 생장성이 저하되는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 개량 CMS 계통 "J1-3"은 "SH"에 대한 지상부 중량의 상대값이 130.0이 되어 유묘 시의 시험과 마찬가지로 매우 높은 생장성을 나타내었다. 개량 CMS 계통 "J1-7"은 "SH"에 대한 지상부 중량의 상대값이 104.4가 되어, "SH"와 동등한 생장성을 나타내었다.

이상과 같이, 기존의 오구라 CMS 브라시카 라파 식물 유래의 CMS 계통이 정상 세포질의 브라시카 라파 식물보다 낮은 생장성을 나타내는 것에 비해, 본 발명의 개량 CMS 계통은 정상 세포질의 브라시카 라파 식물보다 동등 이상의 높은 생장성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3

실시예 1에서 작출된 개량 CMS 계통 "J1-3" 및 "J1-7"의 미토콘드리아 게놈을 분석하기 위해, 공지된 브라시카 라파 미토콘드리아 게놈의 염기 서열 정보(Gene Bank 등록번호 AP017997), 공지된 브라시카 올레라세아 미토콘드리아 게놈의 염기 서열 정보(Gene Bank 등록번호 AP012988), 공지된 라파누스 사티부스 미토콘드리아 게놈의 염기 서열 정보(Gene Bank 등록번호 AB694744)를 비교하고, 동정한 SNPs(1염기 다형)나 in-del(삽입/결실)의 다형 정보에 기초하여 35의 영역을 타깃으로 한 마커를 설계하였다(표 8, 서열 번호 1 내지 88(seq ID-1 내지 ID-88)). 또한, 라파누스 사티부스 식물에서 유래하는 세포질 웅성 불임 유전자인 orf138 유전자를 검출하기 위한 마커를 공지된 염기 서열 정보(Gene Bank 등록번호 AB055435.1)에 기초하여 설계하였다(표 8, 서열 번호 89, 서열 번호 90(seq ID-89, ID-90)).

또한, 엽록체 게놈을 분석하기 위해, 공지된 브라시카 라파 엽록체 게놈의 염기 서열 정보(Gene Bank 등록번호 DQ231548)에 기초하여, 표 9에 나타내는 바와 같은 프라이머를 설계하였다(표 9, 서열 번호 91 내지 92(seq ID-91 내지 ID-92)).

[표 8-1]

[표 8-2]

[표 8-3]

[표 9]

공시 재료로서는, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물 "SH", 정상 세포질을 갖는 브라시카 올레라세아 식물 "G", 오구라 CMS 세포질을 갖는 라파누스 사티부스 식물 "KN", 기존의 CMS 계통인 "보라배추", "니 하오 펑", "양배추 MS-2", 개량 CMS 계통인 "J1-3", "J1-7"을 사용하였다.

각 공시 재료로부터, 전체 게놈 DNA를 추출하여 주형으로 하고, 표 8, 표 9에 기재된 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 행하였다. PCR 조건은 열변성을 94℃에서 1분, 어닐링을 65℃, 60℃ 혹은 55℃에서 1분, 신장 반응을 72℃에서 2분으로 하여, 30사이클 혹은 35사이클 반응시켰다(표 10).

[표 10-1]

[표 10-2]

브라시카 라파 식물, 브라시카 올레라세아 식물, 라파누스 사티부스 식물 사이에서 다형을 검출하는 PCR-RFLP 분석을 행하기 위해, PCR 산물을 표 10에 기재된 제한 효소에 의해 처리하였다. 그들 PCR 산물은 1.8％ 아가로오스 겔에서 전기 영동 후, 에티듐브로마이드 용액에 침지하고, UV 조사 하에서 사진 촬영을 행하여 다형을 조사하였다.

PCR-RFLP법을 사용한 미토콘드리아 게놈의 분석 결과를 표 11에, 엽록체 게놈의 분석 결과를 표 12에 나타내었다. 표 11, 표 12 중의 "Br"은 브라시카 라파형, "Bo"는 브라시카 올레라세아형, "Rs"는 라파누스 사티부스형인 것을 나타낸다. "0"은 당해 마커에서의 검출이 없는 것을, "1"은 당해 마커에서의 검출이 있는 것을 나타낸다. 또한, 미토콘드리아 게놈의 분석 결과를 표 13에 정리하였다. 표 13의 괄호 안의 숫자는, 사용한 전체 마커수에 대한 각 미토콘드리아 게놈의 형의 비율을 나타낸다. 여기서의 전체 마커수는 표 11의 마커 중 orf138을 제외한, 미토콘드리아 게놈의 분석에 사용한 표 11의 No.1 내지 35의 35마커를 가리킨다.

[표 11-1]

[표 11-2]

[표 12]

[표 13]

"보라배추" 및 "니 하오 펑" 유래의 CMS 계통은 브라시카 라파 유래의 엽록체를 갖고, 브라시카 라파와 라파누스 사티부스의 재조합 미토콘드리아 게놈을 갖고 있었다. 그 재조합의 패턴은 35마커에서 완전 동일하였기 때문에, 동일 유래의 CMS 세포질이라고 생각되었다. 또한, orf138 유전자, 브라시카 라파 유래의 엽록체를 갖고, 브라시카 라파와 라파누스 사티부스의 재조합 미토콘드리아 게놈을 갖고 있는 점에서, 오구라 CMS 세포질을 갖는 라파누스 사티부스 식물과, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물의 세포질을 갖는 식물 사이에서의 비대칭 세포 융합에 의해 작출되었다고 생각되었다. 이러한 세포질의 구성은 특허문헌 2의 "new OguCMS" 이외의 보고가 알려져 있지 않기 때문에, "보라배추" 및 "니 하오 펑"의 세포질은 특허문헌 2의 방법으로 작출되었을 가능성이 높다고 생각되었다.

표 13의 결과에서는, "보라배추" 및 "니 하오 펑" 유래 CMS 계통의 재조합 미토콘드리아 게놈은 브라시카 라파형의 미토콘드리아 DNA를 63％ 갖고, 라파누스 사티부스형의 미토콘드리아 DNA를 37％ 갖고 있었다. 표 6 및 표 7에서 나타낸 생장성의 저하는, 브라시카 라파 식물에 orf138과 함께 많은 라파누스 사티부스형의 미토콘드리아 게놈이 도입되었기 때문에, 브라시카 라파 식물의 핵 게놈과 라파누스 사티부스 유래의 미토콘드리아 게놈 사이에서의 불친화성이 원인이라고 생각되었다.

"양배추 MS-2"는 브라시카 올레라세아형의 미토콘드리아 DNA를 77％ 갖고, 라파누스 사티부스형의 미토콘드리아 DNA를 23％ 갖고 있으며, 그의 엽록체는 브라시카 올레라세아 유래였다. 표 6 및 표 7에서 나타낸 생장성의 저하는, 엽록체가 브라시카 올레라세아 유래인 것 및 브라시카 올레라세아와 라파누스 사티부스 유래의 미토콘드리아 게놈을 갖고 있는 것이, 브라시카 라파 식물의 핵 게놈과의 불친화성을 유발하여 생장성이 저하되었다고 생각되었다. 그러나, 그 생장성의 저하 정도는 "보라배추" 및 "니 하오 펑"의 중간이며, 클로로시스 등의 명확한 생육 이상을 일으키지 않는 점에서, 브라시카 올레라세아형의 미토콘드리아 게놈과 브라시카 라파형의 미토콘드리아 게놈은 브라시카 라파 식물에 부여하는 생장성에 대한 영향이 큰 차가 없다고 추정되었다. 본 발명에 따라 작출한 "J1-3" 및 "J1-7"의 미토콘드리아 게놈은 브라시카 라파형의 미토콘드리아 DNA를 60％, 브라시카 올레라세아형의 미토콘드리아 DNA를 31％ 가지며, 라파누스 사티부스형의 미토콘드리아 DNA의 비율은 불과 9％였다.

이상의 결과로부터, 본 발명의 방법은 비대칭 세포 융합에 의한 브라시카 라파 식물의 세포질 잡종 식물의 작출 효율을 높임으로써, 세포질 웅성 불임 유전자 orf138을 도입하면서, 생장성 저하의 원인이 되는 라파누스 사티부스의 미토콘드리아 게놈의 도입을 최소한으로 억제한 CMS 계통을 선발할 수 있었다고 생각되었다. 그 결과, 얻어진 CMS 계통은 세포질 웅성 불임성을 유지하면서도, 브라시카 라파 식물과 미토콘드리아 게놈의 친화성이 높아지고, 생장성이 개량되었다고 생각되었다.

이상과 같이 "J1-3" 및 "J1-7"의 생장성의 향상 이유는 명확하게 되어 있지 않지만, CMS 식물의 개발에 있어서는 실용적인 CMS 식물이 1계통 얻어지면, 당해 CMS 식물을 종자친으로 하고, 임의의 브라시카 라파 식물을 화분친으로 하여 연속 여교잡하여 핵 치환을 행함으로써, 임의의 브라시카 라파 식물을 자유롭게 CMS화할 수 있기 때문에 실용상 전혀 문제가 되지 않는다. 즉, 본원 발명에서 기탁하고 있는 생장성이 개량된 오구라 CMS 브라시카 라파 식물을 사용하면, 임의의 브라시카 라파 식물을 자유롭게 CMS화하는 것이 가능하게 된다.

또한, 표 11의 결과는 세포질 웅성 불임성을 발현하는 개체의 분석 결과의 일례를 나타낸 것이며, 생장성이 개량된 오구라 CMS 브라시카 라파 식물이 반드시 이러한 밴드 패턴을 나타낸다고는 할 수 없다.

실시예 4

CMS 계통의 종자의 생산성은 종자친과 상품 종자의 생산성에 직결되기 때문에, 각 CMS 계통의 채종성의 비교를 행하였다. 공시 재료로서, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물 "SH", 기존의 CMS 계통인 "보라배추", "니 하오 펑", "양배추 MS-2", 개량 CMS 계통인 "J1-3" 및 "J1-7"을 사용하였다.

50 구멍의 셀 트레이에 각 계통 10알을 파종하고, 낮 온도 23℃, 밤 온도 15℃의 유리 온실에서 1개월간 육묘한 후, 4℃ 설정의 냉장고(8시간 조명)에 2개월간 넣어 춘화 처리를 행하였다. 춘화 처리 종료 후, 각 계통 2그루를 10호 화분에 정식하고, 낮 온도 23℃, 밤 온도 15℃의 유리 온실에서 재배를 행하였다. 교배는 충매에 의해 행하고, 결실 후 정밀하게 선별하여 1그루당의 채종량을 조사하였다.

표 14에, 각 계통의 1그루당의 평균 채종량의 결과를 나타내었다.

[표 14]

정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물 "SH"의 채종량을 100으로 하면, "보라배추", "니 하오 펑" 유래 CMS 계통의 채종량의 상대값은 70 전후가 되었다. 이들 CMS 계통은 생장성의 저하에 의해 "SH"에 비하여 식물체의 사이즈가 작기 때문에, 채종량의 저하에 영향을 미쳤다고 생각되었다. "양배추 MS-2"의 채종량의 상대값은 19.3이 되어 극단적으로 낮아졌다. "양배추 MS-2"의 CMS 계통은 춘화 처리 전의 생육은 "보라배추", "니 하오 펑" 유래 CMS 계통과 동일 정도였지만, 춘화 처리 후의 생육은 일시적으로 매우 생육 불량이 되어, 저온에 의한 장해를 받기 쉽다고 생각되었다. 개량 CMS 계통인 "J1-3" 및 "J1-7"은 전체 기간을 통하여 "SH"보다 식물체의 사이즈가 동등 이상으로 커졌으며, 그 결과 채종량의 상대값은 각각 149.2, 146.7이 되어, 채종성이 높고, 자성 임성에 문제가 없는 것을 확인할 수 있었다.

SEQUENCE LISTING <110> Sakata Seed Corporation <120> CMS Brassica rapa Plant modified in growth <130> 800661PX01 <160> 92 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtcataatct cactcctact g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctcggtccat tttccacctc 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atggctggtt ggggttaga 19 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 acgcctatgc aatcacagct gagtaatgga ctggcgaatt 40 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcttagccga acttctcacc t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gctgtccact agccgaaaat c 21 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tttcagccag ttctagtcct tttcttatac gcttattcgc 40 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ccgtcgaagg taaggacaga 20 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tttttttttt tttttctctt tcttattgga tggagtcgtt 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tttttttttt tttttctctt tcttattgga tcgagttgtg 40 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tgcattgaga agggtaggag a 21 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 agtagttcaa atagataatc cacctaaaat ggaacatgcg 40 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tcccctctgt ccctatgttg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gaggtgttgc ctatccaggt 20 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gagcatttct tgtttactcg aacag 25 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gcaatgtatc ggactgcaaa t 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cctagtcctg agtgcgctgt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gcccattccc agttctttct 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cttcctctct ctgttcggat g 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 catgcttttc ttcgtcgtca 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gcctcatacg gctcctctaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 aggatctgga gcgaatccat 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 cgctttgagg ttccctatga 20 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 acaagtggga gaggcagga 19 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gagatccaac ggtgaacagc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 aggctgctat cccaataggc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 agtcgagtta ttccggcttg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ttgtcaccac ggagcataac 20 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 tcaggtaaag aaaggccaac a 21 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gctatgcagt ggaagggaag 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gcaacaggaa gaggcagttg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 tctgggacga gttggaagag 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gcgaggatgg cttcataaac 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 ggcgtgagag tatccagtcc 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gatgcagaat tcaatgccaa g 21 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ggcataccga aaggatacca 20 <210> 37 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 acaatgaaag cggctgccca agtcaggctc aactccctaa 40 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 tagagccggt aaccctcgtt 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 ttcagagcat tgtccgagtg 20 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 ccacttgttg gtattcgttg g 21 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 tggcgaaaga atcctcgtat 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 ttagagtgca gcagggacac 20 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 cattcgacgt tagagggact g 21 <210> 44 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 aaaaaaaaaa aaaaaatagt ccccgaaaat gcccgttgat 40 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 aatttcgagt gtgatcagaa acct 24 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 cgaaaacctt ctgttctgtg g 21 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 cggagcgtaa ccactttctt 20 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 ttcgttcgtt cacttcgttc t 21 <210> 49 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 aggcagtgga ttgtgaatcc accatgcgcg ggttcaagtc 40 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 aggcctttcc ttaagcttcc t 21 <210> 51 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 ccagctggaa ctattgactt tacaccctct accgcaggtt 40 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 gataactcca gtgggcaaga ac 22 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 agtggacttc cttcctttcc a 21 <210> 54 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 tttttttttt ttttgggaac tttgtaatta agccgaaaga 40 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 attccccacc caaccaatac 20 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 aagagcagct ttctccgttc t 21 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 gggctcgaca aaacagaaag 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 gcccacttct tcacatccac 20 <210> 59 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 ttcagtgtct caaaagagaa ttgcttctat caagataggc 40 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 agaaggagaa ggctgagaac g 21 <210> 61 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 cggttctttc gggtttgat 19 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 ccagggatgg acgtaaactc 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 actgacccgt ctcgtatcgt 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 gacgagtgga atgagggaga 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 ttcgttagtt ccgcagctct 20 <210> 66 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 aaaaaaaaaa aaaagcaggt agcttgaccg ccttacgagt 40 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 aagccgacgt taatagcagg t 21 <210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 gtggaattcc tactctcatc tcttt 25 <210> 69 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 atgagttctc accttctctc atggagtagg tagatgagtc 40 <210> 70 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 tttttttttt tttttttaca cgggaatgag aacaaaagga 40 <210> 71 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 atgagttctc accttctctc atggagtagg tagatgagac 40 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 tgagcctgat gagttgacca 20 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 gctcgcttcg aaagaaagaa c 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 ggaaggatcg aaccatagga a 21 <210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 ttgatgagcc tttacgagtt ga 22 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 acttggccgg aaagtgttct 20 <210> 77 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 tttttttttt ttttggcatt ttcggggact agcccggtac 40 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 tagaaaggga ggacaggttg g 21 <210> 79 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 aaaaaaaagg aaagaacaat gtacatggac caggtgacta 40 <210> 80 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 gtactgacca caccgagggg caggccctga agcgaacgac 40 <210> 81 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 gcagggatac atgcataaac ag 22 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 gttcgattca tgatcgcatc t 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 tttcaggcag tggccgttta g 21 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 ttgctgtatc ggaaagtcca 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 gcatgtcgta agcgagtcaa 20 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 taggcccatc cacctcacta t 21 <210> 87 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 tttttttttt cccatgttaa caatctcaat gttgctaaag 40 <210> 88 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 gggtttccta cgacattcca cttgcggaat ggaataaaag 40 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 89 gcaaagcggg aaatccttac 20 <210> 90 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 aaaaaaaaaa aaaaacgaga gactggcgtt ccacgaggac 40 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 91 ggcagtcaga ccaactctca 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 atcggtccac acagttgtcc 20

Claims

정상 세포질을 갖는 브라시카 라파(Brassica rapa) 식물과 동등한 생장성을 갖는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
제1항에 있어서, 라파누스 사티부스(Raphanus sativus) 식물, 브라시카 올레라세아(Brassica oleracea) 식물 및 브라시카 라파 식물의 미토콘드리아 게놈에서 유래하는 DNA를 미토콘드리아 게놈 내에 갖는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
제1항 또는 제2항에 있어서, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 종간 잡종 식물을 세포질 수용친으로서 사용하는 비대칭 세포 융합을 행함으로써 얻어지는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 라파누스 사티부스 식물에서 유래하는 세포질 웅성 불임 유전자를 갖는 세포질 웅성 불임 브라시카(Brassica)속 식물을 세포질 공여친으로서 사용하는 비대칭 세포 융합을 행함으로써 얻어지는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포질 웅성 불임 브라시카 올레라세아 식물에서 유래하는 세포질 웅성 불임 브라시카속 식물을 세포질 공여친으로서 사용하는 비대칭 세포 융합을 행함으로써 얻어지는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포질 웅성 불임 브라시카 올레라세아 식물에서 유래하는 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물을 세포질 공여친으로서 사용하는 비대칭 세포 융합을 행함으로써 얻어지는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카속 식물을 세포질 공여친으로서 사용하고, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 종간 잡종 식물을 세포질 수용친으로서 사용하는 비대칭 세포 융합을 행함으로써 얻어지는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 종간 잡종 식물이 브라시카 올레라세아 식물 및 브라시카 라파 식물에서 유래하는 것인, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 종간 잡종 식물이 높은 재분화능을 갖는 것인, 종간 잡종 식물.
제7항에 있어서, 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카속 식물이 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물인, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
제7항에 있어서, 기존의 세포질 웅성 불임 브라시카속 식물이 세포질 웅성 불임 브라시카 올레라세아 식물에서 유래하는 것인, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포질 공여친이 세포질 웅성 불임 유전자 orf138을 갖는 것인, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
라파누스 사티부스 식물, 브라시카 올레라세아 식물 및 브라시카 라파 식물의 미토콘드리아 게놈에서 유래하는 DNA를 미토콘드리아 게놈 내에 갖는 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대이며,
정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 종간 잡종 식물을 세포질 수용친으로서 사용하는 비대칭 세포 융합을 행함으로써 얻어지는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 수탁 번호 FERM BP-22371 또는 수탁 번호 FERM BP-22372로 특정되는 식물 유래의 미토콘드리아 게놈을 포함하는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 미토콘드리아 게놈 마커 BrMt-13K, BrMt-23K, BrMt-74K, BrMt-120K, BrMt-149K, BrMt-185K에 의해 특정되는 미토콘드리아 DNA 중 적어도 어느 하나가 브라시카 라파형인, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 미토콘드리아 게놈 마커 BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K, BrMt-208K에 의해 특정되는 미토콘드리아 DNA 중 적어도 어느 하나가 브라시카 올레라세아형인, 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 미토콘드리아 게놈 마커 BrMt-13K, BrMt-16K, BrMt-23K, BrMt-28K, BrMt-43K, BrMt-58K, BrMt-63K, BrMt-70K, BrMt-74K, BrMt-88K, BrMt-100K, BrMt-111K, BrMt-120K, BrMt-141K, BrMt-149K, BrMt-157K, BrMt-161K, BrMt-185K, BrMt-199K, BrMt-213K 및 BrMt-215K에 의해 특정되는 미토콘드리아 DNA가 브라시카 라파형이며, 또한 미토콘드리아 게놈 마커 BrMt-3K, BrMt-4K, BrMt-36K, BrMt-65K, BrMt-80K, BrMt-94K, BrMt-119K, BrMt-133K, BrMt-139K, BrMt-171K 및 BrMt-208K에 의해 특정되는 미토콘드리아 DNA가 브라시카 올레라세아형인, 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
수탁 번호 FERM BP-22371 또는 수탁 번호 FERM BP-22372로 특정되는 식물의 미토콘드리아 게놈을 갖는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
수탁 번호 FERM BP-22371 또는 수탁 번호 FERM BP-22372로 특정되는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 수탁 번호 FERM BP-22371 또는 수탁 번호 FERM BP-22372로 특정되는 식물의 미토콘드리아 게놈을 갖는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물을 세포질 공여친으로서 사용하고, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 종간 잡종 식물을 세포질 수용친으로서 사용하는 비대칭 세포 융합을 행함으로써 얻어지는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대의 식물체의 일부.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대의 종자.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대, 제21항에 기재된 식물체의 일부, 또는 제22항에 기재된 종자에 포함되는, 미토콘드리아 게놈.
기존의 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물을 세포질 공여친으로서 사용하고, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물을 세포질 수용친으로서 사용하는 비대칭 세포 융합을 행하는 것을 포함하는, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물과 동등한 생장성을 갖는, 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대의 제조 방법.
제24항에 있어서, 정상 세포질을 갖는 브라시카 라파 식물이 브라시카 라파 식물의 종간 잡종 식물 또는 그것에서 유래하는 것인, 제조 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대을 종자친으로 하고, 해당 식물과 교배 가능한 브라시카 라파 식물을 화분친으로 하여 교배하고, 교배 후의 종자친으로부터 잡종 제1대 종자를 채종하는 것을 포함하는, 잡종 제1대 종자의 제조 방법.
제26항에 기재된 방법에 의해 제조된 잡종 제1대 종자, 또는 해당 종자로부터 생육시킨 잡종 제1대 식물, 그의 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 세포질 웅성 불임 브라시카 라파 식물 또는 그의 후대에, 임의의 브라시카 라파 식물을 연속 여교잡하여 세포질 치환하는 것을 포함하는, 세포질 웅성 불임성을 발현하는 브라시카 라파 식물의 제조 방법.