CN105230486A - 甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于油菜分子育种技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的选育方法。还涉及原生质体融合技术重组甘蓝型油菜-菘蓝的胞质和核基因组，创建重组胞质的细胞质雄性不育系。育种过程包括通过分离和提取甘蓝型油菜-菘蓝的叶肉原生质体，通过细胞融合方法获得甘蓝型油菜-菘蓝的原生质体融合的体细胞杂种；以所得的甘蓝型油菜-菘蓝的体细胞杂种菘蓝-甘蓝型油菜叶肉原生质体细胞杂种为母本，以甘蓝型油菜为父本进行多代回交，获得因雄蕊心皮化的细胞质雄性不育系；经过线粒体基因PCR扩增证实融合过程中线粒体基因组发生重组，导致核质不协调而表现出不育。
Description
技术领域
本发明属于油菜分子育种技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的选育方法。本发明还涉及原生质体融合技术重组甘蓝型油菜-菘蓝的胞质和核基因组，创建重组胞质的细胞质雄性不育系。本发明与油菜-菘蓝远缘杂交的分子育种技术相关。
背景技术
甘蓝型油菜是是一种重要的油料作物，表现明显的杂种优势。应用细胞质雄性不育系(简称CMS)、保持系和恢复系三系配套生产杂交种是目前国内外油菜杂种优势利用的主要途径。目前，国内外广泛应用于油菜杂交育种的是polCMS和oguCMS,其中oguCMS在国外应用较多，而polCMS不育性不稳定，在低温或高温下容易出现微量花粉，从而降低了杂交种纯度。另外，CMS胞质来源单一在作物生产中存在隐患，如美国T胞质玉米在1970年爆发大面积小斑病。故新型CMS系统的创建及研究对于油菜育种有重要意义。
甘蓝型油菜中已发现很多CMS系统，除了pol和nap两个天然细胞质雄性不育系，其它来自于种间或属间杂交。利用远缘杂交的手段导入野生种或近缘种雄性不育胞质或远缘杂交后核质不协调导致雄性不育类型，容易获得不育彻底的雄性不育类型。许多近缘种的不育胞质通过种间或属间杂交以及原生质体融合转移到芸薹属栽培作物中来，培育出了新的CMS系，主要包括Arabidopsisthaliana、Brassicatournefortii、Diplotaxisberthautii、D.erucoidess、Erucasativa、Moricandiaarvensis、Raphanussativus、Sinapisarvensis等(Yamagishi和Bhat，2014)。但是这些CMS难以应用到油菜育种生产中，主要是在油菜中没有异质CMS的恢复基因，而不能完成三系配套。
十字花科菘蓝族的菘蓝(IsatisindigoticaFort.，2n＝14，II)为我国广泛栽培的药用和染料植物，具有抗烟草花叶病毒和油菜菌核病等特性，为甘蓝型油菜遗传改良的优异资源。本发明的前期研究中，杜雪竹在2008年利用菘蓝和甘蓝型油菜叶肉原生质体进行体细胞融合，在菘蓝+甘蓝型油菜“中油821”、菘蓝+甘蓝型油菜“华双3号”及菘蓝+甘蓝型油菜“Oro”的3个杂交组合中，共获得愈伤数237个，2株对称融合杂种，13株非对称融合杂种，并对杂种进行了形态、细胞学和分子生物学鉴定，申请人将该材料命名为菘蓝-甘蓝型油菜叶肉原生质体细胞杂种(杜雪竹，2008，甘蓝型油菜与Lesquerellafendleri及菘蓝族间杂种的遗传研究，具体参见文献：http://www.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx？dbcode＝CDFD&dbname＝cdfd0911&filename＝2008203617.nh&urlid＝&yx＝&uid＝WEEvREcwSlJHSldTTGJhYlQ1S2twUmkxOFhsbm1ncTJZaGl1andMVVVHblZ5Uy9jazRKUkV3SW0rRWtzeXUzWFZDbz0＝$9A4hF_YAuvQ5obgVAqNKPCYcEjKensW4IQMovwHtwkF4VYPoHbKxJw！！&v＝MDA5MDBWMTI3RnJHNEhkZk5xSkViUElSOGVYMUx1eFlTN0RoMVQzcVRyV00xRnJDVVJMK2ZZT2RzRnkvbVc3L0E＝)。本发明利用甘蓝型油菜(B.napus，2n＝38，AACC)和菘蓝的非对称融合杂种(2n＝52，AACCII)与甘蓝型油菜连续多代回交，获得因雄蕊心皮化而雄性不育的材料。同时，我们在回交后代中通过形态观察、细胞学和分子生物学鉴定获得了全套甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系；7个附加系中仅有附加系Me雄蕊发育正常，推测菘蓝染色体e携带不育胞质的恢复基因，可转移到甘蓝型油菜中培育恢复系(Kang等，2014)。目前，已在附加系Me自交后代中选可育株进行小孢子培养获得育性恢复的双单倍体植株，进一步鉴定优良恢复系来完成三系配套，应用到油菜育种中。
迄今为止尚未见到有关甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系CMS选育成功的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜新型细胞质雄性不育系的选育方法，克服甘蓝型油菜现有细胞质雄性不育系的温敏特性，育成不育彻底、稳定遗传的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系，为油菜杂种优势利用提供新的不育胞质。
本发明通过以下方案实现：
一种甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的选育方法，包括以甘蓝型油菜和菘蓝的叶肉原生质体为材料，通过原生质体融合方法得到甘蓝型油菜-菘蓝的体细胞杂种；以所得的甘蓝型油菜-菘蓝的体细胞杂种为母本，以甘蓝型油菜为父本进行连续五代回交和选择，获得甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系(雄蕊心皮化导致的细胞质雄性不育)；选育方法包括下列步骤：
(1)甘蓝型油菜-菘蓝的叶肉原生质体融合与体细胞杂种的获得：分离和提取甘蓝型油菜-菘蓝的叶肉原生质体，用3mM的碘乙酸处理甘蓝型油菜原生质体15分钟，用紫外光辐照菘蓝原生质体20秒，采用PEG-高Ca2+、高pH融合法进行原生质体融合；将融合后的原生质体用固、液双层培养，待形成小愈伤组织后，转移到增殖培养基PellC上进行光照培养；培养7-10天后，挑选颜色鲜艳、大小合适的愈伤组织转入分化培养基PellE中进行分化培养，待小芽长出后，切下小芽转入附加0.1mg/L萘乙酸的MS培养基上形成完整的再生植株；进而得到甘蓝型油菜-菘蓝的原生质体融合的体细胞杂种；
(2)细胞质雄性不育系的选育：以鉴定过的甘蓝型油菜-菘蓝的体细胞杂种的真杂种与甘蓝型油菜华双3号进行杂交获得回交一代即BC1，观察所得的回交一代植株的雄蕊和花粉特征，选择出4个长雄蕊两两融合为一个，2个短雄蕊上没有花药，有微粉，花粉可染性差即<10％的BC1再与甘蓝型油菜华双3号进行回交，从后代植株中选择雄蕊发育异常、雄蕊转变为心皮结构的不育株为育种材料，将所得的不育株与甘蓝型油菜华双3号进行回交，每代继续选择出不育株继续与甘蓝型油菜华双3号进行回交，经过5代连续回交获得稳定的体细胞染色体数为2n＝38的不育系；
(3)细胞质雄性不育系重组胞质的鉴定：提取上步所得的不育系、甘蓝型油菜-菘蓝的体细胞杂种和甘蓝型油菜华双3号的线粒体总DNA，以已测序的登录号为GenBank:AP006444的甘蓝型油菜Westar线粒体基因组序列作参考，设计扩增线粒体基因的引物，进行PCR扩增，PCR产物回收后连接到pMD18-T载体并转化大肠杆菌，挑选阳性克隆测序，确认所得的不育系的线粒体基因大部分来自菘蓝，在cox2-2处与甘蓝型油菜华双3号发生了重组，重组的胞质与核基因组不协调导致不育；叶绿体基因引物TrnD-TrnT证实不育系中叶绿体来自甘蓝型油菜，申请人将该不育系命名为甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系CMS，BrassicanapusL.CMS，于2015年7月3日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCNO：P201511。
其中扩增线粒体基因的引物序列如下所示(对应序列表的序列编号是1-42)
上述的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的四强雄蕊转变为心皮化结构，其顶端类似柱头、下部附着胚珠，两个短雄蕊仅有花丝，不形成花药，其不育系不育彻底，满足杂交和自由授粉以及结实良好。
申请人将上述不育系命名为甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系CMS，BrassicanapusL.CMS，于2015年7月3日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCNO：P201511。
本发明的方法可以在培育甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系中应用。
与现有技术相比本发明具有以下突出优点：
(1)本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的雄蕊转变为心皮化结构，不育彻底，不育性状稳定遗传，在湖北省武汉市、甘肃省和政县和青海省西宁市各地种植，其不育性状表现稳定。
(2)本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的不育胞质由菘蓝和甘蓝型油菜重组而来，不同于polCMS和oguCMS，是新型不育胞质，拓展了油菜不育胞质资源。
(3)本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系核基因组来自油菜双低品种华双3号，农艺性状优良，杂交和开放授粉结实良好，有利于繁殖不育系种子和生产杂交种。
附图说明
图1：甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的选育。
图2：甘蓝型油菜和菘蓝体细胞杂种与甘蓝型油菜回交一代的花。
图3：甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的染色体数为2n＝38。
图4：甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系和保持系华双3号的花。附图标记说明：图4中的a图是甘蓝型油菜华双3号的完整花；图4中的b图是甘蓝型油菜华双3号除去花萼和花瓣的花；图4中的C图是本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的完整花；图4中的D图是本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的除去花萼和花瓣的花。标尺：a-d，1cm。
图5：甘蓝型油菜保持系华双3号和甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的花蕾横切图。附图标记说明：图5中的a图是保持系华双3号花蕾横切图；图5中的b图是本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的花蕾横切图。
图6：叶绿体基因引物TrnD-TrnT证实本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的叶绿体来自华双3号。附图标记说明：泳道M-是DNAMarkerDL2000，1-是甘蓝型油菜华双3号，2-是菘蓝，3-是甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系。
图7：本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系在分子水平上与oguCMS的鉴定。附图标记说明：OguCMS不育基因orf138引物仅在oguCMS扩增出一条特异带，而甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系中无扩增产物。泳道：M是DNAMarkerDL2000，1-是甘蓝型油菜华双3号，2-是菘蓝，3-是甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系，4-是oguCMS，5-是polCMS。
图8：本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系在分子水平上与polCMS的鉴定。附图标记说明：PolCMS不育基因orf224引物仅在polCMS扩增出一条特异带，而甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系中无扩增产物。泳道：M-是DNAMarkerDL2000，1-是甘蓝型油菜华双3号，2-是菘蓝，3-是甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系，4-是oguCMS，5是polCMS。
具体实施方式
实施例1利用原生质体融合获得甘蓝型油菜和菘蓝体细胞杂种
本发明所用甘蓝型油菜华双3号和菘蓝种子由华中农业大学油菜研究室提供。华双3号系华中农业大学选育的双低油菜品种(吴江生等，甘蓝型双低油菜品种华双3号的选育和研究.华中农业大学学报，1999，18(1)：1-4.)。甘蓝型油菜和菘蓝体细胞杂种及其杂种鉴定方法参考杜雪竹(杜雪竹.甘蓝型油菜与Lesquerellafendleri及菘蓝族间杂种的遗传研究.[博士学位论文].武汉：华中农业大学图书馆，2008，具体参见文献：http://www.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx？dbcode＝CDFD&dbname＝cdfd0911&filename＝2008203617.nh&urlid＝&yx＝&uid＝WEEvREcwSlJHSldTTGJhYlQ1S2twUmkxOFhsbm1ncTJZaGl1andMVVVHblZ5Uy9jazRKUkV3SW0rRWtzeXUzWFZDbz0＝$9A4hF_YAuvQ5obgVAqNKPCYcEjKensW4IQMovwHtwkF4VYPoHbKxJw！！&v＝MDA5MDBWMTI3RnJHNEhkZk5xSkViUElSOGVYMUx1eFlTN0RoMVQzcVRyV00xRnJDVVJMK2ZZT2RzRnkvbVc3L0E＝))报道的方法，本发明给出了其最优体系。
原生质体的分离和纯化
参考现有文献报道原生质体的融合方法(例如：杜雪竹.甘蓝型油菜与Lesquerellafendleri及菘蓝族间杂种的遗传研究.[博士学位论文].武汉：华中农业大学图书馆，2008和中国知网)。
以上述文献为基础，对其中的相关技术细节作下述补充：
(1)原生质体的制备
取甘蓝型油菜(品种为华双3号)和菘蓝的种子先用70％酒精表面消毒1分钟，然后用0.1％HgCl2溶液灭菌15分钟，最后用无菌水冲洗3次，接种到MS培养基(Murashige和Skoog，1962)。经过约30天培养得到无菌的实生苗，取嫩叶用于原生质体的分离。
用于原生质体分离和培养的相关溶液为：酶解液(0.5％纤维素酶、0.3％离析酶、0.2M甘露醇和80mM氯化钙，pH5.6)和用于质壁分离的SCM溶液(0.5M山梨醇、10mM氯化钙和5mMMES，pH5.8，)，使用时以体积比3:7混匀。嫩叶在酶溶液中用消毒好的锋利刀片划成网状，25℃下在摇床上摇16小时。充分酶解的组织在分离操作前用手轻轻摇动使原生质体完全释放，经200目和400目不锈钢滤网滤去渣质，加W5培养基(154mMNaCl、125mMCaCl2、5mMKCl、5mM葡萄糖，pH5.8)混匀，收集滤液至10ml离心管中，600r/min离心5分钟，弃上清液，加入2mlW5培养基重新悬浮原生质体，用胶头滴管吸出，沿管壁轻轻地铺在5ml含0.5M蔗糖和1mM的2-(N-吗啉乙磺酸)【简称：MES，2-(N-morpholino)ethanesulphonicacid】的溶液液面上，600r/min离心10分钟，小心收集两液面间的原生质体至10ml离心管中，再加入W5溶液离心(600r/min)5分钟。
(2)原生质体融合
融合前，甘蓝型油菜原生质体用3mM碘乙酸处理15分钟。菘蓝原生质体通过紫外光照射20秒，紫外线来源为超净工作台SW-CT-1D的紫外灯，盛原生质体的培养皿与光源的距离为10cm。将处理过的甘蓝型油菜和菘蓝原生质体分别调至2×106个/ml后，等体积混匀。原生质体融合采用PEG-高Ca2+、高pH融合法(Hu等，2002)，将PEG融合液(15％PEG、10％DMSO、60mMCaCl2、25mM甘露醇、25mM甘氨酸)以4×2滴成对滴入6cm培养皿中，然后用胶头滴管将两亲本原生质体混合液滴2-3滴到成对的融合液中间，边缘再各加1滴融合液，暗培养10分钟。用W5+MES溶液(154mMNaCl、125mMCaCl2、5mMKCl、5mM葡萄糖、50mMMES，pH5.8)将上述培养皿中的原生质体融合液逐步稀释，用量分别为0.125ml、0.25ml、0.375ml、0.5ml、1.0ml，稀释间隔为l分钟，最后在超净工作台上暗培养1.5小时。
(3)原生质体融合细胞的培养和植株再生
向装有原生质体融合团的培养皿中滴加W5+MES溶液收集原生质体，600r/min离心5min，然后用PellB液体培养基(PellB、PellC和PellE配方参考Pelletier等，1983报道的培养基配方，适当调整了激素比例，见后)调整原生质体密度为5～10×104个/ml。原生质体培养采用固、液双层培养：取1.5ml细胞悬液到直径为4cm、铺满PellB固体培养基(PellB培养基附加1.0mg/L6-BA、1.0mg/LNAA和0.25mg/L2,4-D)的培养皿中，25℃下进行暗培养。约30天后，待形成肉眼可见的小愈伤组织时，移到愈伤组织增殖培养基PellC(PellC培养基附加为2.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA和0.1mg/L2,4-D)上，进行光照培养。继续培养7-10天后，挑选颜色鲜艳、大小合适的愈伤组织转入分化培养基PellE(PellE培养基附加2.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA和0.02mg/L2,4-D)中进行分化培养，待小芽长至lcm左右，切下转入生根培养基(附加0.1mg/LNAA的MS培养基)上形成完整植株。
(4)体细胞杂种的鉴定
本发明最终获得非对称融合植株13株，再生植株移栽到大田后，仅有5株存活，对其进行形态、细胞学和花粉活性观察。经染色体计数和基因组原位杂交鉴定出的1株真杂种(2n＝52＝38+14)，(杜雪竹，2008)。
实施例2甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的选育
甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的选育的技术路线见图1所示。具体方法为：鉴定过的真杂种(鉴定方法为常规方法)与甘蓝型油菜华双3号杂交获得回交一代(BC1)，其4个长雄蕊两两融合为一个，2个短雄蕊上没有花药(图2)，有微粉，花粉可染性差(<10％)。BC1再与华双3号回交，后代植株发现雄蕊发育异常、雄蕊转变为心皮结构的不育株，不育植株与甘蓝型油菜回交，每代选择不育植株继续与甘蓝型油菜回交，经过5代连续回交获得稳定的不育系。不育系体细胞染色体数，经鉴定为2n＝38(图3)。该不育系的四强雄蕊转变为心皮化结构，其顶端类似柱头、下部附着胚珠，两个短雄蕊仅有花丝，不形成花药(图4)。新型不育系不育彻底(无花药)，杂交和自由授粉均结实良好，且在湖北省武汉市、甘肃省和政县和青海省西宁市各地种植时均表现稳定不育。
线粒体基因PCR扩增分析表明，融合植株中线粒体发生重组，并稳定遗传到不育系中；进一步测序表明，不育系线粒体基因组中大部分基因来自菘蓝。该不育系的线粒体基因组由菘蓝和甘蓝型油菜融合重组而来，而叶绿体来自甘蓝型油菜(具体见实施例4)。因此，该不育系命名为甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系(英文简称为inapCMS)。
甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的制种，参考傅廷栋主编的著作：《杂交油菜的育种与利用》(傅廷栋，2000，湖北科学技术出版社报道的方法。
实施例3甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系雄蕊发育观察
取甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系和保持系华双3号的花蕾制作石蜡切片，石蜡切片方法参考(李和平，2009)，李和平主编，《植物显微技术》，科学出版社，2009，北京；第二章石蜡制片法。组织显微观察发现，甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系雄蕊不能正常发育，雄蕊原基分化出来后开始同源转变为心皮(图5)。本发明获得的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系与polCMS和oguCMS败育时期比较见表1。
表1不同CMS败育时期
实施例4甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系胞质组成分析
(1)甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系叶绿体来源
甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的叶绿体来源鉴定，选用叶绿体基因引物TrnD:5’-ACCAATTGAACTACAATCCC-3’，TrnT:5’-CTACCACTGAGTTAAAAGGG-3’(引物参考Demesure等，1995)，对华双3号、菘蓝和不育系进行PCR扩增。PCR反应体系(10μl)包含：100ng基因组DNA，1×Taqbuffer,2mMMgCl2，1UTaqDNApolymerase，5mMdNTPs，5μM正向和反向引物。扩增程序为：94℃变性5min，然后32个循环(94℃30s，57℃30s，72℃90s)，最后72℃延伸10min。结果表明甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系中叶绿体来自华双3号(图6)。
(2)甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系线粒体基因组组成
选用甘蓝型油菜华双3号、菘蓝和甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的黄化幼苗提取线粒体DNA，参考Scotti等(2001)。以已测序的甘蓝型油菜品种Westar线粒体基因组(GenBank:AP006444)序列作参考设计了21对线粒体基因引物，引物序列见表2(除cox2-2和rrn26外，引物参考kang等，2014)。PCR反应体系(10μl)包含：50ngmtDNA，1×Taqbuffer,2mMMgCl2，1UTaqDNApolymerase，5mMdNTPs，5μM正向和反向引物。PCR扩增程序为：94℃变性5min，然后30个循环(94℃1min，54℃1min，72℃2min)，最后72℃延伸10min。PCR产物回收后连接到pMD18-T载体，转化到大肠杆菌中，挑选阳性克隆测序。结果表明，除cox3、rrn26、atp9和rps7在两亲本菘蓝和油菜间无差异外，甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的线粒体基因大部分来自菘蓝(21个基因中有16个来自菘蓝)，仅有cox2-2来自甘蓝型油菜华双3号(表3)。这说明在原生质体融合过程中，菘蓝和甘蓝型油菜的线粒体发生了重组，重组的胞质与核基因组不协调导致不育。
表2线粒体基因引物序列
表3甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系(简称inapCMS)
注：B表示甘蓝型油菜品种华双3号特异片段，I代表菘蓝特异片段，“-”表示未扩增出。
实施例5甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的遗传分类
(1)恢保关系测定：
选取甘蓝型油菜杂交种生产中两个普遍CMS系统，pol和oguCMS的恢复系(pol和oguCMS的恢复系种子由华中农业大学油菜研究室提供，为常用品种材料)与甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系进行测交，F1均不育，仍表现出雄蕊心皮化(表4)。测交结果表明，本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系与油菜pol和oguCMS恢保关系不同。
表4甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系(inapCMS)和其他油菜CMS的恢保关系测定结果
注:表1中的S表示不育，F表示可育。
表1所列测交材料是检验本发明材料的恢复程度和保持程度的对比材料，不是依赖该测交材料完成的发明创造(中国现有的育种资源只要具备上述材料的遗传特征均可作为本发明表1的测交材料，本实施例不限于此)。OguCMS(参见，傅廷栋，杂交油菜的育种与利用，湖北科学技术出版社，2000年版，湖北武汉。)是从引进的OguCMS商品种中通过常规方法获得，由华中农业大学油菜研究室提供。PolCMS(即波里马细胞质雄性不育系)由华中农业大学油菜研究室提供，是华中农业大学中国工程院院士傅廷栋教授从甘蓝型油菜品种波里马中发现的天然雄性不育株转育而成的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系，已经公开发表(傅廷栋，2000)。
(2)分子生物学鉴定：
利用oguCMS不育相关基因orf138(GenBank:AB055443)设计引物，引物序列为orf138F：5’-ATTTGGCTAAGCTGGTTTTCT-3’，orf138R：5’-CTCGGTCCATTTTCCACCTC-3’，进行PCR扩增反应(PCR扩增体系和程序参考实施例4)，在甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系中不能扩增出任何产物(见图7)。
利用polCMS不育相关基因orf224(GenBank:EU254235)设计引物，引物序列为orf224F：5’-ATGCAATGATGGAGATGGAGT-3’，orf224R：5’-CGATCAAGGTGCCGAAAGAT-3’，进行PCR扩增反应，在甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系中不能扩增出任何产物(图8)。
结果表明，本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系在分子水平上与油菜polCMS和oguCMS不同，是一种新型的细胞质雄性不育系，在油菜远缘杂种利用和油菜生产上具有重要的利用价值。
参考文献：
1.杜雪竹.甘蓝型油菜与Lesquerellafendleri及菘蓝族间杂种的遗传研究.[博士学位论文].武汉：华中农业大学图书馆，2008.
http://www.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx？dbcode＝CDFD&dbname＝cdfd0911&filename＝2008203617.nh&urlid＝&yx＝&uid＝WEEvREcwSlJHSldTTGJhYlQ1S2twUmkxOFhsbm1ncTJZaGl1andMVVVHblZ5Uy9jazRKUkV3SW0rRWtzeXUzWFZDbz0＝$9A4hF_YAuvQ5obgVAqNKPCYcEjKensW4IQMovwHtwkF4VYPoHbKxJw！！&v＝MDA5MDBWMTI3RnJHNEhkZk5xSkViUElSOGVYMUx1eFlTN0RoMVQzcVRyV00xRnJDVVJMK2ZZT2RzRnkvbVc3L0E＝)。
2.傅廷栋主编，杂交油菜的育种与利用，湖北科学技术出版社，2000版，武汉.
3.李和平主编，植物显微技术，科学出版社，2009，北京.
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Claims (2)
1.一种甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的选育方法，包括以甘蓝型油菜和菘蓝的叶肉原生质体为材料，通过原生质体融合方法得到甘蓝型油菜-菘蓝的体细胞杂种；以所得的甘蓝型油菜-菘蓝的体细胞杂种为母本，以甘蓝型油菜为父本进行连续五代回交和选择，获得甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系；其特征在于，包括下列步骤：
(1)甘蓝型油菜-菘蓝的叶肉原生质体融合与体细胞杂种的获得：分离和提取甘蓝型油菜-菘蓝的叶肉原生质体，用3mM的碘乙酸处理甘蓝型油菜原生质体15分钟，用紫外光辐照菘蓝原生质体20秒，采用PEG-高Ca2+、高pH融合法进行原生质体融合；将融合后的原生质体用固、液双层培养，待形成小愈伤组织后，转移到增殖培养基PellC上进行光照培养；培养7-10天后，挑选颜色鲜艳、大小合适的愈伤组织转入分化培养基PellE中进行分化培养，待小芽长出后，切下小芽转入附加0.1mg/L萘乙酸的MS培养基上形成完整的再生植株；进而得到甘蓝型油菜-菘蓝的原生质体融合的体细胞杂种；
(2)细胞质雄性不育系的选育：以鉴定过的甘蓝型油菜-菘蓝的体细胞杂种的真杂种与甘蓝型油菜华双3号进行杂交获得回交一代即BC1，观察所得的回交一代植株的雄蕊和花粉特征，选择出4个长雄蕊两两融合为一个，2个短雄蕊上没有花药，有微粉，花粉可染性差即<10％的BC1再与甘蓝型油菜华双3号进行回交，从后代植株中选择雄蕊发育异常、雄蕊转变为心皮结构的不育株为育种材料，将所得的不育株与甘蓝型油菜华双3号进行回交，每代继续选择出不育株继续与甘蓝型油菜华双3号进行回交，经过5代连续回交获得稳定的体细胞染色体数为2n＝38的不育系；
(3)细胞质雄性不育系重组胞质的鉴定：提取上步所得的不育系、甘蓝型油菜-菘蓝的体细胞杂种和甘蓝型油菜华双3号的线粒体总DNA，以已测序的登录号为GenBank:AP006444的甘蓝型油菜Westar线粒体基因组序列作参考，设计扩增线粒体基因的引物，进行PCR扩增，PCR产物回收后连接到pMD18-T载体并转化大肠杆菌，挑选阳性克隆测序，确认所得的不育系的线粒体基因大部分来自菘蓝，在cox2-2处与甘蓝型油菜华双3号发生了重组，重组的胞质与核基因组不协调导致不育；叶绿体基因引物TrnD-TrnT证实不育系中叶绿体来自甘蓝型油菜，将该不育系命名为甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系CMS，其保藏号为CCTCCNO：P201511；
其中扩增线粒体基因的引物序列如下所示
2.权利要求1所述的方法在培育甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系中的应用。
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