CN101044837B

CN101044837B - 利用野芥不育细胞质制备油菜及十字花科蔬菜杂种的方法

Info

Publication number: CN101044837B
Application number: CN2007100520805A
Authority: CN
Inventors: 胡琼; 李云昌; 梅德圣; 李英德; 徐育松
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2007-04-30
Filing date: 2007-04-30
Publication date: 2010-04-07
Anticipated expiration: 2027-04-30
Also published as: CN101044837A

Abstract

本发明公开了一种利用野芥不育细胞质制备油菜及十字花科蔬菜杂种的方法，其主要步骤为：A、属间杂种的获得，首先是叶肉原生质体的分离；其次是原生质体的纯化；第三是原生质前处理及融合；第四是原生质体培养及杂种鉴定繁殖；B、野芥细胞质雄性不育恢复品系的选育；C、野芥细胞质雄性不育及恢复性状向十字花科蔬菜的转育；D、野芥细胞质雄性不育杂交生产，即以油菜或十字花科蔬菜的野芥细胞质雄性不育系为母本，以雄性可育的油菜或十字花科蔬菜品种为父本，进行有性杂交生产F1杂种种子，用于提高油菜F1代的营养体产量或种子产量。本发明方法易行，鉴定和筛选恢复材料快、恢复率高，三系配套容易，成本低，制备的杂交种纯度高。

Description

利用野芥不育细胞质制备油菜及十字花科蔬菜杂种的方法

技术领域

本发明属于植物育种和良种繁育领域，更具体涉及一种利用野芥不育细胞质制备油菜及十字花科蔬菜杂种的方法，该方法适用于异源细胞质雄性不育系高纯度杂交种制备，可降低生产风险，提高杂种产量。

背景技术

十字花科主要作物有用于收籽榨油的油菜(包括甘蓝型油菜、芥菜型油菜、白菜型油菜和埃塞俄比亚芥)及白菜、甘蓝类多种蔬菜。油菜油除了作为优质食用油之外，还是生物柴油的理想原料，因而油菜成为世界范围内的重要大田作物。十字花科蔬菜中白菜和甘蓝类有多种，白菜类包括大白菜、小白菜、红菜薹、菜心等，甘蓝类则有结球甘蓝、青花菜、包心菜、苤蓝等，是人类膳食中的主要蔬菜，其中多种甘蓝类蔬菜还具有保健功能，如抗癌等。随着耕地资源的日趋减少及全球人口的不断增加，提高作物产量成为满足人类对日益增长的作物产品需求的唯一途径。而利用杂种优势提高产量则是作物高产育种的主要方法。杂种优势是指遗传背景不同的亲本杂交产生的F1代，在生活力、生长势、适应性、抗逆性和丰产性等方面比双亲更强的一种普遍的生物学现象。自20世纪30年代在玉米中应用获得高产以来，杂种优势在农作物生产中得到广泛的应用并取得了显著的增产效果。油菜产量性状的杂种优势显著，F1代杂种产量可以超过其中亲值的30％-60％(Sernyk and Stefansson，1983.Heterosis in summer rape(Brassica napusL.)Can J Plant Sci 63，407-413；傅廷栋，1995.杂交油菜的育种与利用，武汉：湖北科学技术出版社)。目前，杂交油菜的推广面积已占油菜生产总面积的60％以上。油菜品种进一步改良的目标就是在优质的基础上，利用杂种优势充分发挥其产量潜力。

细胞质雄性不育是生产油菜杂交种的主要授粉控制系统。目前中国生产上使用的杂油菜有70％左右为细胞质雄性不育杂种，基本上是华中农业大学1972年从引进品种“波里马”中发现的波里马不育细胞质(Pol CMS)配制的Pol CMS的育性易受温度影响，低温下产生微量花粉，不育株可以自我繁殖，导致配制杂交种时一定比例的不育株存在，使杂种纯度下降，其中的不育株结实率低，影响杂交种产量潜力的发挥，增加杂交油菜利用的风险性。其他存在于中国的雄性不育细胞质有陕2A CMS、MI CMS、Nca CMS等，这些不育细胞质均是在芸薹属栽培种中经自然变异或种间杂交鉴定出来的，属于同源雄性不育胞质，均有育性不够稳定的缺点，应用时存在杂种纯度难以保证的问题，且其完全保持系和完全恢复系都不容易筛选，大多数油菜品种都是不恢不保的类型(李殿荣.甘蓝型油菜三系选育初报.陕西农业科学，1980，(1)：26-29；傅寿仲，戚存扣，唐继红.甘蓝型油菜细胞质雄性不育系MI CMS的选育.作物学报，1989，17(2)：151-156.刘贵华，蔡明，盛晓燕.甘蓝型油菜NCa雄性不育材料的选育及其在甘蓝型油菜中的恢保关系.中国农业科学，1997，30(3)：61-65)。十字花科蔬菜中杂种优势的利用也非常广泛，杂交种已占80％以上，但缺乏很好的授粉控制系统，生产杂交种主要利用自交不亲和系，仅少数杂交种利用雄性不育系。国外通过转移萝卜不育细胞质得到的育性较为稳定的萝卜质雄性不育材料(Bannerot H，Boulidard L，Cauderon Y and Tempe J.Transfer of cytoplasmic male sterility from Raphanussativus to Brassica oleracea.Proc.Eucarpia Meeting Cruciferae：1974，52-54)，但在利用过程中出现恢复系难找、恢复基因与不良品质性状连锁的问题，使得该不育系的育种利用进程缓慢(Delourme R.，Foisset N.，Horvais R.，Barret P.，ChampagneG.，Cheung W.Y.，Landry B.S.，Renard M.Characterisation of the radish introgressioncarrying the Rfo restorer gene for the Ogu-INRA cytoplasmic male sterility inrapeseed(Brassica napus L).1998，Theor Appl Genet 97：129-134)。从1974年不育系创建成功，到1999年打破恢复基因与不良品质性状的连锁，直至2000年以后才不断育成双低杂交油菜品种，实际应用进程花了将近30年的时间(Primard-Brisset C，Poupard JP，Horvais R，Eber F，Pelletier G，Renard M，DelourmeR，A new recombined double low restorer line for the Ogu-INRA cms in rapeseed(Brassica napus L).Theor Appl Genet.2005；111(4)：736-46)。生产上大面积应用单一细胞质生产杂交油菜存在流行性病害发生的危险，利用新的细胞质雄性不育系统对保障杂交油菜的可持续性发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用野芥不育细胞质制备油菜及十字花科蔬菜杂种的方法，其特点是方法易行，操作性强，鉴定和筛选恢复材料速度快，恢复率高，三系配套容易，制种成本低，杂种纯度高。

根据本发明提供的方法并使用本发明提供的实验步骤可实现上述目的。

一种利用野芥不育细胞质制备油菜及十字花科蔬菜杂交种的方法，它包括以下步骤：

A、以野芥和油菜栽培种为亲本进行属间杂交，获得可育的含野芥细胞质的属间杂交后代植株F1；再套袋自交获得杂交二代F2，或用双低高产油菜品种为父本，与所获属间杂交后代进行杂交，获得回交一代BC1。

B、对F2及BC1群体的优良单株进行小孢子培养或连续3-5次自交纯合基因型，获得性状较为一致的可育株系。

C、以可育株系为父本，向野芥细胞质雄性不育系授粉测交，获得测交一代杂种，种植杂种鉴定育性，如杂种可育则父本株系为恢复株系，恢复株系自交繁殖形成群体，即获得野芥不育细胞质的恢复品系。

D、以野芥细胞质不育系为细胞质供体，以十字花科蔬菜白菜、甘蓝等为父本，连续4-6次回交获得十字花科蔬菜野芥细胞质雄性不育系及其保持系，以步骤C中选育的野芥不育胞质的恢复品系为恢复基因供体，与十字花科蔬菜进行有性杂交获得十字花科蔬菜野芥不育细胞质恢复品系。

E、以油菜或十字花科蔬菜的野芥细胞质雄性不育系为母本，以任何雄性可育的油菜或十字花科蔬菜品种(或品系)为父本，进行有性杂交生产F1杂种种子，用于提高F1代的营养体产量或种子产量。

在本发明的一个优选方案中，利用野芥不育细胞质制备油菜及十字花科蔬菜杂交种的方法，包括以下步骤：

1、属间可育杂种的获得

1.1叶肉原生质体的分离：甘蓝型油菜及野芥的种子经表面消毒后(置70％的乙醇1分钟，1.5％的次氯酸纳10分钟，无菌水冲洗3次)，接种在MS培养基上培养，置25℃、16小时60-80μmol m-2s-1光照条件下生长。取充分展开的叶片用于原生质体的分离。酶解时在5cm的培养皿中加入3.5ml SCM溶液(0.5M山梨醇，10mM CaCl2，5mM MES，pH5.8)。用解剖刀将叶片划成羽状后加1.5ml酶液(0.2M甘露醇，80mM CaCl2，2％的纤维素酶，1％的Macerozyme，0.5％的Driselase)，25℃避光酶解14-18个小时，轻微晃动。

1.2原生质体的纯化：用孔径为200目或400目的细胞筛过虑，加W5(154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，5mM葡萄糖)混匀至10ml离心管中，600rmp/min离心5分钟，弃上清液收集原生质体，用5ml蔗糖+MES(0.5M蔗糖，1mM MES)溶液重新悬浮，在上层加入W5，形成界面离心(600rmp/min)10分钟，用吸管取两界面之间的原生质体带，再用W5悬浮，离心(600rmp/min)5分钟。

1.3原生质前处理及融合：利用5mM的碘乙酸(IOA)处理近缘种原生质体20-45分钟，甘蓝型原生质体不做任何前处理，密度均调至2×10⁶pp/ml。将PEG融合液(15％PEG，60mM CaCl₂，90mM甘露醇，25mM甘氨酸，10％DMSO)成对滴入培养皿中。将已处理的两亲本原生质体等体积混匀，加2-3滴在成对的PEG融合液中间，两边再各加1滴融合液，共培养10min。随后将共培养后的混和原生质体逐步用W5+MES稀释，剂量分别为0.125ml，0.25ml，0.375ml，0.5ml，1.0ml，时间间隔1min，共滴入W5+MES溶液2.5ml，在超净工作台上静置共培养1.5小时后，收集原生质体于离心管中，用W5洗涤，离心(600ppm/min)5min。再用液体PellB悬浮原生质体，将调整密度为10⁵pp/ml。

1.4原生质体培养及杂种鉴定繁殖：在PellB平板上倒一薄层细胞悬浮液，放上饲养膜，将原生质体溶液滴在饲养膜上，吸去清水，密封，暗培养10-15天。待长成小细胞团后，将细胞团逐个转至PellC平板上，5-7天后将长成3-5mm的小愈伤，转入PellE诱导芽。出芽后将幼芽转至PellF中继续生长，当幼苗出现2-3片展开的叶片后，转至MS培养基上诱导生根，得到生根后的再生植株。

2、野芥细胞质雄性不育恢复品系的选育：

2.1杂种可育株的鉴定和纯化：将再生植株移栽到温室或大田，进行性状鉴定，花期观察育性，选有花粉的可育株套袋自交，获得杂交二代F2种子，或利用甘蓝型油菜品种的花粉给再生出来的杂种植株授粉，获得回交一代BC1种子。种植F2及BC1种子，选择F2及BC1群体中的可育株，继续套袋自交或通过小孢子培养纯合基因型，获得性状较为一致的可育株系。

2.2野芥细胞质不育恢复品系的鉴定：以可育株系为父本，给野芥细胞质雄性不育系的不育株授粉进行测交，获得测交一代杂种，种植杂种鉴定育性，如果杂种的育性可以得到恢复的，则其父本株系为恢复株系，恢复株系自交繁殖成为群体，即育成油菜野芥不育胞质的恢复品系。

3、油菜野芥细胞质雄性不育及恢复性状向十字花科蔬菜的转育：

以野芥细胞质不育系为细胞质供体，以十字花科蔬菜白菜、甘蓝等为父本，连续回交4代以上获得十字花科蔬菜野芥细胞质雄性不育系及其保持系，以步骤2中选育的野芥不育细胞质的恢复品系为恢复基因供体，与十字花科蔬菜进行有性杂交，在杂交种自交后的F2后，选取单株与野芥胞质不育单株成对测交鉴定恢复性能，筛选获得十字花科蔬菜野芥不育细胞质的恢复品系。恢复系的性状来源于新疆野芥。

4、野芥细胞质雄性不育杂交种生产

4.1不育系的繁殖：以油菜或十字花科蔬菜的野芥细胞质雄性不育系为母本，以任何油菜或十字花科蔬菜的可育品种为父本，连续回交4次，繁殖油菜或十字花科蔬菜野芥细胞质雄性不育系，形成一对不育系和保持系，不育系含新疆野芥的细胞质，不育系可用来生产杂交种，保持系则用来通过给不育系授粉，继续繁殖不育系。

4.2不育杂交种的生产：以步骤4.1中繁殖的不育系为母本，任何油菜或十字花科蔬菜可育品种为父本，按不育系和可育品系4∶2或5∶2或6∶2的行比种植，开花期辅以人工或蜂媒传粉，终花期砍去父本，收获不育株行的种子，即生产出不可育的杂交种种子，可以用于杂种蔬菜的生产。

4.3可育杂交种的生产：以步骤4.1中繁殖的不育系为母本，步骤2或3中育成的油菜或十字花科蔬菜野芥恢复品系为父本，按不育系和恢复系4∶2或5∶2或6∶2的行比种植，开花期辅以人工或蜂媒传粉，终花期砍去父本，收获不育株行的种子，即生产出可育的杂交种种子，可以用于杂种油菜和蔬菜的生产。

本发明的方法与现有技术相比具有以下优点：

1、恢复材料鉴定效率高，由于恢复基因与不育胞质是共同进化的，恢复基因通过属间杂交转入油菜栽培种中，通过对杂种后代的鉴定，很快可获得恢复材料，且恢复材料的育性正常，花粉量大，结实性好(请见图1)。

2、恢复系选育速度快，由于同时进行测交和自交，结合小孢子培养，恢复系纯化快，边纯化边鉴定，3-5个世代即2-3年就可获得纯合恢复系(请见图2)。

3、三系选育容易，野芥胞质不育属异源细胞质雄性不育，所有油菜或十字花科白菜、甘蓝类蔬菜都是其保持系，转育不育系和保持系只需进行简单连续回交，加上2中陈述的恢复系选育快，很容易成功选育配套的三系。

4、组合选配灵活，杂交种选育效率高，由于所有油菜或十字花科白菜、甘蓝类蔬菜都是其保持系，一旦一个恢复系选育成功，可以与很多油菜或十字花科白菜、甘蓝类蔬菜品系测配，只要发现强优势组合，都能用于生产。

5、杂交种种子纯度高，由于野芥细胞质雄性不育育性稳定，恢复系的恢复率高，杂种结实正常(请见图3)，配制出的杂交种种子纯度高，杂交种生产安全性好。

本发明所用的培养系统中PellB、PellC、PellF培养基与Pelletier等(1983)所用相同(Pelletier G P C，Vedel F，Chetrit P，Remy R，Rouselle P，and Renard M.Intergeneric cytoplasm hybridization in Cruciferae by protoplast fusion.MolecularGeneral Genetics，1983，(191)：244-250)。MS培养基则是Murashige和Skoog(1962)发明的(Murashige T and Skoog F，A revised medium for rapid growth andbio-assays with tobacco tissue cultures.Physiol Plant，1962，15：473-497)。小孢子培养方法依照的是梅德圣等(2007)已发表的程序进行(梅德圣，王汉中，李云昌，胡琼，李英德，徐育松，油菜小孢子培养影响因素及黄籽油菜双单倍体群体的构建。华北农学报，2007，22(1)：112-113)

附图说明

图1为一种甘蓝型油菜野芥胞质不育恢复品系的育性示意图，A图为盛花期花药散粉情况，其花药饱满，花粉量大，雄性育性正常。B图为不同恢复单株套袋自交后结实情况，角果大小和结实均正常。

图2甘蓝型油菜野芥胞质不育恢复品系的小孢子培养及田间一致性，A图为小孢子培养成胚情况，可见材料成胚率高，每花蕾成胚可达100个以上。B图为恢复品系田间生长情况，其花期性状整齐一致。

图3甘蓝型油菜野芥细胞质雄性不育系与恢复系的F1杂种育性表现，A图为F1植株的开花情况，其花瓣平展，花大，雄蕊正常伸长，花粉散粉正常。B图为F1不同单株的结实情况，可见结实性良好，角果发育正常。

具体实施方式

实施实例1：属间杂交引进野芥细胞质雄性不育恢复性状制备杂交种

1、采用植物材料进行原生质体融合或有性杂交(见实施实例2)获得含野芥细胞质的体细胞杂种，所用植物材料为甘蓝型油菜双低品种中双4号和新疆野芥资源野油18号，包括以下步骤：

A、叶肉原生质体的分离：甘蓝型油菜品种中双4号及野芥野油18号的种子经表面消毒后(置70％的乙醇1分钟，1.5％的次氯酸纳10分钟，无菌水冲洗3次)，接种在MS培养基上培养，置25℃、16小时60-80μmol m-2s-1光照条件下生长。取充分展开的叶片用于原生质体的分离。酶解时在5cm的培养皿中加入3.5ml SCM溶液(0.5M山梨醇，10mM CaCl2，5mM MES，pH5.8)。用解剖刀将叶片划成羽状后加1.5ml酶液(0.2M甘露醇，80mM CaCl2，2％的纤维素酶，1％的Macerozyme，0.5％的Driselase)，25℃避光酶解14-18个小时，轻微晃动。

B、原生质体的纯化：用孔径为200目或400目的细胞筛过虑，加W5(154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，5mM葡萄糖)混匀至10ml离心管中，600rmp/min离心5分钟，弃上清液收集原生质体，用5ml蔗糖+MES(0.5M蔗糖，1mM MES)溶液重新悬浮，在上层加入W5，形成界面离心(600rmp/min)10分钟，用吸管取两界面之间的原生质体带，再用W5悬浮，离心(600rmp/min)5分钟。

C、原生质前处理及融合：利用5mM的碘乙酸(IOA)处理近缘种原生质体20-45分钟，甘蓝型原生质体不做任何前处理，密度均调至2×10⁶pp/ml。将PEG融合液(15％PEG，60mM CaCl₂，90mM甘露醇，25mM甘氨酸，10％DMSO)成对滴入培养皿中。将已处理的两亲本原生质体等体积混匀，加2-3滴在成对的融合液中间，两边再各加1滴融合液，共培养10min。随后将上述混和原生质体逐步用W5+MES稀释，剂量分别为0.125ml，0.25ml，0.375ml，0.5ml，1.0ml，时间间隔1min，共滴入W5+MES溶液2.5ml，在超净工作台上静置共培养1.5小时后，收集原生质体于离心管中，用W5洗涤，离心(600ppm/min)5min。再用液体PellB悬浮原生质体，将调整密度为10⁵pp/ml。

D、原生质体培养及杂种鉴定繁殖：在PellB平板上倒一薄层细胞悬浮液，放上饲养膜，将原生质体溶液滴在饲养膜上，吸去清水，密封，暗培养10-15天。待长成小细胞团后，将细胞团逐个转至PellC平板上，5-7天后将长成3-5mm的小愈伤，转入PellE诱导芽。出芽后将幼芽转至PellF中继续生长，当幼苗出现2-3片展开的叶片后，转至MS培养基上诱导生根。得到生根后的再生体细胞杂种植株。

2、野芥细胞质雄性不育恢复品系的选育：

A、杂种可育株的鉴定和纯化：将再生植株移栽到温室或大田，进行性状鉴定，花期观察育性，选有花粉的可育株套袋自交，获得F2种子，或利用甘蓝型油菜品种的花粉给再生出来的杂种植株授粉，获得回交一代(BC1)种子。种植F2及BC1种子，选择F2及BC1群体中的可育株，继续套袋自交或通过小孢子培养纯合基因型，获得性状较为一致的可育株系。

B、野芥胞质恢复品系的鉴定：以可育株系为父本，给野芥细胞质雄性不育系的不育株授粉进行测交，获得测交一代杂种，种植杂种鉴定育性，杂种的育性可以得到恢复的，则其父本株系为恢复株系，恢复株系自交繁殖成为群体，即育成油菜野芥不育胞质的恢复品系。

3、野芥细胞质雄性不育及恢复性状向十字花科蔬菜的转育：

以野芥细胞质不育系为细胞质供体，以十字花科蔬菜白菜、甘蓝等为父本，连续回交4代获得十字花科蔬菜野芥细胞质雄性不育系及其保持系，以步骤2中选育的野芥不育胞质的恢复品系为恢复基因供体，与十字花科蔬菜进行有性杂交，在杂交种自交后的F2后，选取单株与野芥细胞质不育单株成对测交鉴定恢复性能，筛选获得十字花科蔬菜野芥不育胞质恢复品系。恢复系的性状来源于新疆野芥。

4、野芥细胞质雄性不育杂交种生产

A、不育系的繁殖：以油菜或十字花科蔬菜的野芥细胞质雄性不育系为母本，以任何油菜或十字花科蔬菜白菜或甘蓝的可育品种为父本，连续回交4代，繁殖油菜或白菜或甘蓝的野芥细胞质雄性不育系，形成一对不育系和保持系，不育系含新疆野芥的细胞质，不育系可用来生产杂交种，保持系则用来通过给不育系授粉，继续繁殖不育系。

B、不育杂交种的生产：以步骤4.1中繁殖的不育系为母本，以任何油菜品种或十字花科蔬菜白菜或甘蓝的可育品种为父本，按不育系和可育品系4∶2或5∶2或6∶2的行比种植，开花期辅以人工或蜂媒传粉，终花期砍去父本，收获不育株行的种子，即生产出不可育的杂交种种子，可以用于杂种蔬菜的生产。

C、可育杂交种的生产：以步骤4.1中繁殖的不育系为母本，步骤2或3中育成的油菜或十字花科蔬菜野芥恢复品系为父本，按不育系和恢复系4∶2或5∶2或6∶2的行比种植，开花期辅以人工或蜂媒传粉，终花期砍去父本，收获不育株行的种子，即生产出可育的杂交种种子，可以用于杂种油菜和蔬菜的生产。

实施实例2：有性杂交引进野芥细胞质雄性不育恢复基因生产杂交种

1.子房培养获得含野芥细胞质的属间杂种：田间种植野芥野油18及甘蓝型油菜中双4号，开花期以野油18为母本，中双4号为父本，进行人工去雄和授粉，授粉7-10天后，采回开始发育的角果，经表面消毒后，置含0.8％的水解酪蛋白的MS培养基上培养，35-40天后，将角果中的幼胚取出，置MS培养基上萌发，萌发后长出真叶。

2.属间杂种的染色体加倍：待真叶长出之后，将幼苗切下，置含0.01％秋水仙碱的MS培养基中处理10天进行染色体加倍，随后转入含0.2mg/l NAA的MS培养基上生根，获得染色体加倍后的含野芥细胞质的甘蓝型油菜与野芥有性杂交一代F1。

3.杂种鉴定及纯合：将杂种植株转入田间，根据形态性状鉴定杂种的真实性。选取染色体加倍成功的杂种植株(植株生长正常，器官大小也正常，有花粉)，花期套袋自交或利用甘蓝型油菜做父本与之回交，获得自交二代F2和回交一代BC1种子。种植F2及BC1种子，选择F2及BC1群体中的可育株，继续套袋自交或通过小孢子培养纯合基因型，获得性状较为一致的可育株系。

4.油菜野芥细胞质雄性不育恢复品系的选育同实施实例1。

5.油菜野芥细胞质雄性不育和恢复性状向十字花科蔬菜的转育同实施实例1。

6.油菜及十字花科蔬菜野芥细胞质雄性不育杂交种生产同实施实例1。

Claims

1.一种利用野芥不育细胞质制备油菜及十字花科蔬菜白菜、甘蓝杂交种的方法，包括以下步骤：

A、属间可育杂种的获得：首先是叶肉原生质体的分离：甘蓝型油菜及野芥的种子经消毒后，置70％的乙醇1分钟，1.5％的次氯酸纳10分钟，无菌水冲洗3次，接种在MS培养基上培养，置25℃、16小时60-80μmol m^-2s^-1光照条件下生长，取展开的叶片用于原生质体的分离，酶解时在5cm的培养皿中加入3.5ml含0.5M山梨醇、10mM CaCl₂、5mM MES、pH5.8的SCM溶液，用刀将叶片划成羽状后，加含0.2M甘露醇、80mM CaCl₂、2％纤维素酶、1％Macerozyme、0.5％Driselase的酶液，25℃避光酶解14-18个小时，晃动；其次是原生质体的纯化：用孔径为200或400目的细胞筛过虑，加含154mM NaCl、125mM CaCl₂、5mM KCl、5mM葡萄糖的W5混匀至离心管中，离心，弃上清液收集原生质体，用5ml含0.5M蔗糖和1mM MES的溶液重新悬浮，在上层加入W5，离心，取两界面之间的原生质体带，再用W5悬浮，离心；第三是原生质前处理及融合：利用5mM的碘乙酸处理近缘种原生质体20-45分钟，密度均调至2×10⁶pp/ml，将含15％PEG、60mM CaCl₂、90mM甘露醇、25mM甘氨酸、10％DMSO的PEG融合液成对滴入培养皿中，将已处理的两亲本原生质体等体积混匀，加2-3滴在成对的融合液中间，两边再各加1滴融合液，共培养，随后将上述混和原生质体用W5+MES稀释，收集原生质体于离心管中，用W5洗涤，离心，再用液体PellB悬浮原生质体，将密度调整为105pp/ml；第四是原生质体培养及杂种鉴定繁殖，在PellB平板上倒一层细胞悬浮液，放上饲养膜，将原生质体溶液滴在饲养膜上，吸去清水，密封，暗培养10-15天，待长成细胞团后，将细胞团逐个转至PellC平板上，5-7天后将长成3-5mm的小愈伤，转入PellE诱导芽，出芽后将幼芽转至PellF中继续生长，当幼苗出现叶片后，转至MS培养基上诱导生根，得到生根后的再生植株；

B、野芥细胞质雄性不育恢复品系的选育：首先是杂种可育株的鉴定和纯化，将再生植株移栽到温室或大田，进行性状鉴定，花期观察育性，选有花粉的育株套袋自交，获得F₂种子，或利用甘蓝型油菜品种的花粉给再生出来的杂种植株授粉，获得回交一代即BC₁种子，种植F₂及BC₁种子，选择F₂及BC₁群体中的可育株，继续套袋自交或通过小孢子培养纯合基因型，获得性状一致的可育株系；其次是野芥胞质恢复品系的鉴定，以可育株系为父本，给野芥细胞质雄性不育系的不育株授粉进行测交，获得测交一代杂种，种植杂种鉴定育性，杂种的育性得到恢复的，父本株系为恢复系，恢复系自交繁殖成为群体，即育成油菜野芥不育胞质的恢复品系；

C、野芥细胞质雄性不育及恢复性状向十字花科蔬菜白菜或甘蓝的转育：是野芥细胞质不育系为细胞质供体，以十字花科蔬菜白菜、甘蓝为父本，连续回交4代以上获得十字花科蔬菜野芥细胞质雄性不育系及其保持系，以步骤B中选育的野芥不育细胞质的恢复品系为恢复基因供体，与十字花科蔬菜进行有性杂交，在杂交种自交后的F2后，选取单株与野芥胞质不育单株成对测交鉴定恢复性能，筛选获得十字花科蔬菜野芥不育细胞质的恢复品系；

D、野芥细胞质雄性不育杂交种生产：首先是不育系的繁殖，以油菜或十字花科蔬菜的野芥细胞质雄性不育系为母本，以油菜或十字花科蔬菜白菜或甘蓝品种为父本，连续回交4代，繁殖油菜或十字花科蔬菜蔬菜白菜或甘蓝野芥细胞质雄性不育系，形成一对不育系和保持系，继续繁殖不育系；其次是不育杂交种的生产，以步骤D中繁殖的不育系为母本，油菜或十字花科蔬菜白菜或甘蓝的可育品种为父本，按不育系和可育品系4∶2或5∶2或6∶2的行比种植，开花期辅以人工或蜂媒传粉，终花期砍去父本，收获不育株行的种子，生产出不育的杂交种种子，用于杂种蔬菜的生产；第三是可育杂交种的生产：以步骤D中繁殖的不育系为母本，步骤B或C中育成的油菜或十字花科蔬菜野芥恢复品系为父本，按不育系和恢复系4∶2或5∶2或6∶2的行比种植，开花期辅以人工或蜂媒传粉，终花期砍去父本，收获不育株行的种子，生产出的杂交种种子，用于杂种油菜和蔬菜的生产。

2.根据权利要求1所述的一种利用野芥不育细胞质制备油菜及十字花科蔬菜白菜、甘蓝杂种的方法，其特征在于所用的不育系含新疆野芥的细胞质。

3.根据权利要求1所述的一种利用野芥不育细胞质制备油菜及十字花科蔬菜白菜、甘蓝杂种的方法，其特征在于所用的恢复系的恢复性状来源于新疆野芥。