CN112189563A - 一种加快甘蓝型油菜细胞质雄性不育系转育的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于油菜遗传育种技术领域，公开了一种加快甘蓝型油菜细胞质雄性不育系转育的方法，通过未成熟种子萌发培养以及生根培养和高光照强度培养获得健壮的幼苗，将健壮幼苗的获得、低温诱导开花处理和生长室内控制条件下生长有机结合起来，实现甘蓝型油菜细胞质雄性不育系的快速转育，一年可回交转育3～4代。相对于异地加代繁殖技术，本发明克服了异地繁殖管理不便和一年只能增加繁殖1代的缺陷，便于精细管理和增加繁殖2至3代；相对于萌动种子低温处理的就地加代繁殖技术中小苗移栽不易成活、长成的植株弱小花蕾少不便于授粉操作的缺陷，本发明通过健壮幼苗的获得步骤，提高了移栽成活率，开花时植株花蕾较多，授粉操作容易。

Description

一种加快甘蓝型油菜细胞质雄性不育系转育的方法
技术领域
本发明属于油菜遗传育种技术领域，具体涉及一种加快甘蓝型油菜细胞质雄性不育系转育的方法。
背景技术
油菜在国民经济和国民生活中占有重要的地位，是重要的油料和饲料作物，还在观光旅游中发挥重要作用。随着经济发展和人民生活水平提高，对油菜生产的需求越来越大。
高产稳产油菜品种的选育是油菜生产安全的根本保障。利用杂交种的杂种优势是提高油菜产量的重要途径。配制油菜杂交品种的最广泛方法是细胞质雄性不育三系法，即不育系、保持系和恢复系三系配套。理论上，不育系植株雄性不育而雌性可育，不能自我繁殖，但授以其它植株花粉能结籽而产生后代。保持系植株雌雄皆可育，能自我繁殖；不育系植株授以保持系植株花粉繁殖的后代植株仍保持雄性不育特性，即仍为不育系。恢复系植株雌雄皆可育，能自我繁殖；不育系植株授以恢复系植株花粉产生的杂种植株，其雄性不育特性被恢复为雄性可育、能正常结实结籽，生产上使用的杂交品种就是不育系与恢复系的杂交种。总之，保持系自交繁殖保持系，恢复系自交繁殖恢复系，不育系与保持系杂交繁殖不育系，不育系与恢复系杂交获得生产上应用的杂交品种。可见，不育系实际上是具有不育细胞质和保持系细胞核的核质杂合体。
在油菜育种上，新的不育系的培育通常是将已有的不育系或材料与新选育的保持系杂交和连续多代(一般6～8代)回交，需要较长的年限。为了加快不育系的转育，可采用异地加代繁殖的方法，即在当地油菜正常生长季节外，选取合适的其它地区继续种植油菜，使油菜植株开花结实，以达到加代繁殖的目的。但异地加代繁殖存在诸多缺陷。异地加代对繁殖地生态气候要求高，对育种材料的生态特性也有限制，冬性较强的材料难以开花结实，能开花结实的材料收获的种子往往成熟度不好而细瘪；异地加代繁殖对育种材料病虫害和生长管理不便，常常导致加代“流产”；油菜异地加代一般一年只能增加1代。也可采用人工低温处理就地加代的方法。人工就地加代时常常对萌动种子进行低温处理一段时间后再移栽到生长室中或就地较高海拔地区种植，直至开花结实，但这样的方法低温处理时间长，小苗移栽不易成活，长成的植株弱小，花蕾少，不便于杂交授粉操作。
发明内容
基于以上问题，本发明提供一种加快甘蓝型油菜细胞质雄性不育系转育的方法，通过未成熟种子萌发培养以及生根培养和高光照强度培养获得健壮的幼苗，将健壮幼苗的获得、低温诱导开花处理和生长室内控制条件下生长有机结合起来，实现甘蓝型油菜细胞质雄性不育系的快速转育，一年可回交转育3～4代。相对于异地加代繁殖技术，本发明克服了异地繁殖管理不便和一年只能增加繁殖1代的缺陷，便于精细管理和增加繁殖2至3代；相对于萌动种子低温处理的就地加代繁殖技术中小苗移栽不易成活、长成的植株弱小花蕾少不便于授粉操作的缺陷，本发明通过健壮幼苗的获得步骤，提高了移栽成活率，开花时植株花蕾较多，授粉操作容易。
为实现上述技术效果，本发明采用的技术方案是：
一种加快甘蓝型油菜细胞质雄性不育系转育的方法，包括如下步骤：
S1、大田正常生长季节获得的保持系、不育系BC1的完全成熟种子经消毒、清洗后将种子接种到MS培养基上萌发，待苗高1cm以上后在子叶节下0.5cm处将幼苗顶端切下扦插到MS+蔗糖30g/L+IBA 0.5mg/L的培养基上培养15-25天，获得健壮的生根幼苗；
S2、生根幼苗移入人工气候箱中进行低温诱导处理10-30天，其中温度为3～5℃，光照强度1000～3000Lux，光照时间24小时/天；
S3、将低温诱导处理后的生根幼苗移入生长室中，炼苗3天后，将苗移栽到盛有土壤的花盆中培养至开花后，取保持系花粉给不育系授粉；
S4、取保持系种子和授粉后20～30天的不育系未成熟种子进行离体培养获得健壮幼苗；重复S2、S3的步骤进行下一个繁殖世代。
进一步地，步骤S3中炼苗期间和移栽后2天内，生长室光照强度5000Lux；移栽2天后，光照强度提高到10000Lux；移栽4天后，光照强度提高到15000Lux；其中生长室光源为LED量子板光源，垂直距离花盆顶部1米，光照强度通过光源调光器调节，光照时间16小时/天；生长室温度23～25℃；幼苗移栽成活后施加适量复合肥，喷施杀虫剂和抑真菌剂；根据需要浇施适量水。
进一步地，步骤S4中的保持系种子仍采用S1的培育方法获得幼苗；不育系BC2及以后世代，取回交授粉后20～30天的未成熟种子消毒清洗后剥除种皮，将胚接种到MS+蔗糖0～20g/L的培养基上萌发，取苗高1cm以上的幼苗在子叶节下0.5cm处将萌发幼苗顶端切下扦插到MS+蔗糖30g/L+IBA 0.5mg/L的培养基上培养15～25天，获得健壮的生根幼苗。
进一步地，种子消毒、清洗过程为：完全成熟种子或未成熟种子用75％酒精消毒1分钟，再用5％安替福民液消毒10分钟，最后用无菌水清洗。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)本发明通过未成熟种子萌发培养以及生根培养和高光照强度培养获得健壮的幼苗，将健壮幼苗的获得、低温诱导开花处理和生长室内控制条件下生长有机结合起来，实现甘蓝型油菜细胞质雄性不育系的快速转育，一年可回交转育3～4代。
2)相对于异地加代繁殖技术，本发明克服了异地繁殖管理不便和一年只能增加繁殖1代的缺陷，便于精细管理和增加繁殖2至3代。
3)相对于萌动种子低温处理的就地加代繁殖技术中小苗移栽不易成活、长成的植株弱小花蕾少不便于授粉操作的缺陷，本发明通过健壮幼苗的获得步骤，提高了移栽成活率，开花时植株花蕾较多，授粉操作容易。
4)本发明所涉及培养基可以开发成商品利用。
附图说明
图1为实施例1和2中加快甘蓝型油菜细胞质雄性不育系转育的方法流程图；
具体实施方式
为使本发明的目的；技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
参见图1，一种加快甘蓝型油菜细胞质雄性不育系转育的方法，包括如下步骤：
S1、大田正常生长季节获得的保持系、不育系BC1的完全成熟种子经消毒、清洗后将种子接种到MS培养基上萌发，待苗高1cm以上后在子叶节下0.5cm处将幼苗顶端切下扦插到MS+蔗糖30g/L+IBA 0.5mg/L的培养基上培养15-25天，获得健壮的生根幼苗；
S2、生根幼苗移入人工气候箱中进行低温诱导处理10-30天，其中温度为3～5℃，光照强度1000～3000Lux，光照时间24小时/天；
S3、将低温诱导处理后的生根幼苗移入生长室中，炼苗3天后，将苗移栽到盛有土壤的花盆中培养至开花后，取保持系花粉给不育系授粉；；
其中炼苗期间和移栽后2天内，生长室光照强度5000Lux；移栽2天后，光照强度提高到10000Lux；移栽4天后，光照强度提高到15000Lux；其中生长室光源为LED量子板光源，垂直距离花盆顶部1米，光照强度通过光源调光器调节，光照时间16小时/天；生长室温度23～25℃；幼苗移栽成活后施加适量复合肥，喷施杀虫剂和抑真菌剂；根据需要浇施适量水。
S4、取保持系种子和授粉后20～30天的不育系未成熟种子进行离体培养获得健壮幼苗；重复S2、S3的步骤进行下一个繁殖世代。其中保持系种子仍采用S1的培育方法获得幼苗；不育系BC2及以后世代，取回交授粉后20～30天的未成熟种子消毒清洗后剥除种皮，将胚接种到MS+蔗糖0～20g/L的培养基上萌发，待苗高1cm以上后在子叶节下0.5cm处将萌发幼苗顶端切下扦插到MS+蔗糖30g/L+IBA 0.5mg/L的培养基上培养15-25天，获得健壮的生根幼苗。
在本实施例中，通过未成熟种子萌发培养以及生根培养和高光照强度培养获得健壮的幼苗，将健壮幼苗的获得、低温诱导开花处理和生长室内控制条件下生长有机结合起来，实现甘蓝型油菜细胞质雄性不育系的快速转育，一年可回交转育3～4代。相对于异地加代繁殖技术，本发明克服了异地繁殖管理不便和一年只能增加繁殖1代的缺陷，便于精细管理和增加繁殖2至3代；相对于萌动种子低温处理的就地加代繁殖技术中小苗移栽不易成活、长成的植株弱小花蕾少不便于授粉操作的缺陷，本发明通过健壮幼苗的获得步骤，提高了移栽成活率，开花时植株花蕾较多，授粉操作容易。
实施例2：
(一)初代繁殖
1.1健壮幼苗的获得
参见图1，大田正常生长季节获得的保持系k189、k196、k197和k199及各自不育系BC1的完全成熟种子用75％酒精消毒1分钟，再用5％安替福民液消毒10分钟，无菌水清洗后将种子接种到MS培养基上，7天后各材料的萌发率为100％，在子叶节下0.5cm处将幼苗顶端切下扦插到MS+蔗糖30g/L+IBA0.5mg/L的培养基上培养20天，生根率为100％，生根幼苗生长健壮，达到5叶期。所有培养基添加6g/L琼脂粉，用1mol/LKOH调节pH到5.8。培养温度23～25℃，光照时间16小时/天，光照强度20000Lux。
1.2低温诱导
将培养有幼苗的培养瓶移入人工气候箱中进行低温诱导处理30天。温度3～5℃，光照强度1000～3000Lux，光照时间24小时/天。
1.3生长室培养、管理和授粉
低温诱导处理后，将培养有幼苗的培养瓶移入生长室中，炼苗3天后，将苗移栽到盛有土壤的花盆中。炼苗期间和移栽后2天内，光照强度5000Lux；移栽2天后，光照强度提高到10000Lux；移栽4天后，光照强度提高到15000Lux。光源为LED量子板光源，垂直距离花盆顶部1米，光照强度通过光源调光器调节，光照时间16小时/天。温度23～25℃。幼苗移栽成活后施加适量复合肥，喷施杀虫剂(如高效氯氟氰菊酯)和抑真菌剂(如腐霉利)；根据需要浇施适量水。各材料从移栽到开花的时间和开花株率如表1所示。开花后，取保持系花粉给不育系授粉能正常结籽。
表1初代繁殖材料从移栽到开花经历时间和开花株率
材料 移栽至开花时间(天) 开花株率(％)
k189 24 86.67
k189BC1 24 73.33
k196 25 80
k196BC1 26 80
k197 20 93.33
k197BC1 23 100
k199 26 66.67
k199BC1 27 80
(二)继代繁殖BC2：授粉后取样时间和胚萌发培养基试验
2.1健壮幼苗的获得
保持系k196和k197的完全成熟种子用75％酒精消毒1分钟，再用5％安替福民液消毒10分钟，无菌水清洗后将种子接种到MS培养基上，7天后在子叶节下0.5cm处将幼苗顶端切下扦插到MS+蔗糖30g/L+IBA 0.5mg/L的培养基上培养20天。授粉后20天和30天的不育系BC2代未成熟种子，用75％酒精消毒1分钟，再用5％安替福民液消毒10分钟，无菌水清洗后小心剥除种皮，将胚接种到MS附加蔗糖0、10、20、30和40g/L的培养基上萌发，7天后各材料在不同培养基上的萌发率如表2所示。取MS附加蔗糖0、10和20g/L的培养基上萌发的幼苗，在子叶节下0.5cm处将萌发幼苗顶端切下扦插到MS+蔗糖30g/L+IBA0.5mg/L的培养基上培养20天，各材料的生根率为100％，生根幼苗生长健壮，保持系幼苗达5叶期，授粉后30天开始培养的幼苗达4～5叶期，授粉后20天开始培养的幼苗达3叶期。所有培养基添加6g/L琼脂粉，用1mol/L KOH调节pH到5.8。培养温度23～25℃，光照时间16小时/天，光照强度20000Lux。
表2不同胚龄种子在不同培养基的萌发率
Figure BDA0002731474480000081
Figure BDA0002731474480000091
2.2低温诱导
将培养有幼苗的培养瓶移入人工气候箱中进行低温诱导处理30天。温度3～5℃，光照强度1000～3000Lux，光照时间24小时/天。
2.3生长室培养、管理和授粉
低温诱导处理后，将培养有幼苗的培养瓶移入生长室中，炼苗3天后，将苗移栽到盛有土壤的花盆中。炼苗期间和移栽后2天内，光照强度5000Lux；移栽2天后，光照强度提高到10000Lux；移栽4天后，光照强度提高到15000Lux。光源为LED量子板光源，垂直距离花盆顶部1米，光照强度通过光源调光器调节，光照时间16小时/天。温度23～25℃。幼苗移栽成活后施加适量复合肥，喷施杀虫剂(如高效氯氟氰菊酯)和抑真菌剂(如腐霉利)；根据需要浇施适量水。各材料从移栽到开花的时间和开花株率如表3所示。开花后，取保持系花粉给不育系授粉能正常结籽。
表3继代繁殖材料从移栽到开花经历时间和开花株率
Figure BDA0002731474480000101
(三)继代繁殖BC3：低温诱导处理时间对开花的影响
3.1健壮幼苗的获得
保持系k197的完全成熟种子用75％酒精消毒1分钟，再用5％安替福民液消毒10分钟，无菌水清洗后将种子接种到MS培养基上，7天后在子叶节下0.5cm处将幼苗顶端切下扦插到MS+蔗糖30g/L+IBA 0.5mg/L的培养基上培养20天。授粉后20天的不育系BC3代未成熟种子，用75％酒精消毒1分钟，再用5％安替福民液消毒10分钟，无菌水清洗后小心剥除种皮，将胚接种到MS附加蔗糖10g/L的培养基上萌发。7天后k197的萌发率为93％，k197BC3的萌发率为43％。在子叶节下0.5cm处将萌发幼苗顶端切下扦插到MS+蔗糖30g/L+IBA0.5mg/L的培养基上培养20天，各材料的生根率为100％，生根幼苗生长健壮，保持系幼苗达5叶期，不育系BC3的幼苗达4～5叶期。所有培养基添加6g/L琼脂粉，用1mol/L KOH调节pH到5.8。培养温度23～25℃，光照时间16小时/天，光照强度20000Lux。
3.2低温诱导
将培养有幼苗的培养瓶移入人工气候箱中进行低温诱导处理10、15、20、25和30天。温度3～5℃，光照强度1000～3000Lux，光照时间24小时/天。
3.3生长室培养、管理和授粉
低温诱导处理后，将培养有幼苗的培养瓶移入生长室中，炼苗3天后，将苗移栽到盛有土壤的花盆中。炼苗期间和移栽后2天内，光照强度5000Lux；移栽2天后，光照强度提高到10000Lux；移栽4天后，光照强度提高到15000Lux。光源为LED量子板光源，垂直距离花盆顶部1米，光照强度通过光源调光器调节，光照时间16小时/天。温度23～25℃。幼苗移栽成活后施加适量复合肥，喷施杀虫剂(如高效氯氟氰菊酯)和抑真菌剂(如腐霉利)；根据需要浇施适量水。各材料从移栽到开花的时间如表4所示。开花后，取保持系花粉给不育系授粉能正常结籽。
表4低温处理不同时间下k197和k197BC3从移栽到开花经历时间和开花株率
Figure BDA0002731474480000121
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种加快甘蓝型油菜细胞质雄性不育系转育的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、大田正常生长季节获得的保持系、不育系BC1的完全成熟种子经消毒、清洗后将种子接种到MS培养基上萌发，待苗高1cm以上后在子叶节下0.5cm处将幼苗顶端切下扦插到MS+蔗糖30g/L+IBA0.5mg/L的培养基上培养15-25天，获得健壮的生根幼苗；
S2、生根幼苗移入人工气候箱中进行低温诱导处理10-30天，其中温度为3～5℃，光照强度1000～3000Lux，光照时间24小时/天；
S3、将低温诱导处理后的生根幼苗移入生长室中，炼苗3天后，将苗移栽到盛有土壤的花盆中培养至开花后，取保持系花粉给不育系授粉；
S4、取保持系种子和授粉后20～30天的不育系未成熟种子进行离体培养获得健壮幼苗；重复S2、S3的步骤进行下一个繁殖世代。
2.根据权利要求1所述的加快甘蓝型油菜细胞质雄性不育系转育的方法，其特征在于：步骤S3中炼苗期间和移栽后2天内，生长室光照强度5000Lux；移栽2天后，光照强度提高到10000Lux；移栽4天后，光照强度提高到15000Lux；其中生长室光源为LED量子板光源，垂直距离花盆顶部1米，光照强度通过光源调光器调节，光照时间16小时/天；生长室温度23～25℃；幼苗移栽成活后施加适量复合肥，喷施杀虫剂和抑真菌剂；根据需要浇施适量水。
3.根据权利要求1所述的加快甘蓝型油菜细胞质雄性不育系转育的方法，其特征在于：步骤S4中的保持系种子仍采用S1的培育方法获得幼苗；不育系BC2及以后世代，取回交授粉后20～30天的未成熟种子消毒清洗后剥除种皮，将胚接种到MS+蔗糖0～20g/L的培养基上萌发，取苗高1cm以上的幼苗在子叶节下0.5cm处将萌发幼苗顶端切下扦插到MS+蔗糖30g/L+IBA 0.5mg/L的培养基上培养15～25天，获得健壮的生根幼苗。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的加快甘蓝型油菜细胞质雄性不育系转育的方法，其特征在于，种子消毒、清洗过程为：完全成熟种子或未成熟种子用75％酒精消毒1分钟，再用5％安替福民液消毒10分钟，最后用无菌水清洗。
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