CN101044838A - 油菜异源细胞质雄性不育系选育的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种油菜异源细胞质雄性不育系选育的方法，其步骤是：首先是叶肉原生质体的分离；第二是原生质体的纯化；第三是原生质体融合前处理；第四是原生质体融合；第五是原生质体培养；第六是杂种鉴定和繁殖；第七是连续回交替换甘蓝型油菜细胞核基因组，提高不育株率，选育不育系和保持系。本发明方法易行，操作性强，获得的雄性不育材料育性稳定性好、对温度变化的敏感性低，制种安全性高，不育株率和不育度均可达到100％。

Description

油菜异源细胞质雄性不育系选育的方法

                          技术领域

本发明涉及种属间杂交技术重组油菜的细胞质和细胞核基因组，创建异源细胞质雄性不育，属植物生物工程领域。本发明更具体涉及一种油菜异源细胞质雄性不育系选育的方法，它可以用来建立含细胞质类型不同的油菜异源细胞质雄性不育，并在育种中配制高产杂交种。

                          背景技术

用于收籽榨油的芸薹属栽培种油菜主要有甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜及埃塞俄比亚芥。芸薹属的另外两个栽培种白菜和甘蓝则主要用于蔬菜。利用杂种优势提高产量是这些栽培种高产育种的主要途径。

油菜细胞质雄性不育是生产油菜杂交种的主要授粉控制系统。目前我国生产上使用的杂交油菜有70％左右为细胞质雄性不育杂种，基本上是华中农业大学1972年从引进品种“波里马”中发现的波里马不育细胞质(Pol CMS)(傅廷栋，杨光圣.油菜细胞质雄性不育系杂种.傅廷栋主编.杂交油菜的育种和利用.武汉：湖北科学技术出版社，1995：33-35)。Pol CMS易受温度影响，育性的不稳定性导致杂交种制种纯度下降，一定比例的不育株的存在影响了杂交种产量潜力的发挥，增加了杂交油菜利用的风险性。其他存在于我国的雄性不育细胞质有陕2ACMS、MI CMS、Nca CMS等，这些不育细胞质均是在芸薹属栽培种中经自然变异或种间杂交鉴定出来的，属于同源雄性不育胞质，均有育性不够稳定的缺点(李殿荣.甘蓝型油菜三系选育初报.陕西农业科学，1980，(1)：26-29)或应用性不强(傅寿仲，戚存扣，唐继红.甘蓝型油菜细胞质雄性不育系MI CMS的选育.作物学报，1989，17(2)：151-156.刘贵华，蔡明，盛晓燕.甘蓝型油菜NCa雄性不育材料的选育及其在甘蓝型油菜中的恢保关系.中国农业科学，1997，30(3)：61-65)。虽然国外已将墙生二行芥(Hinata K，Konno N.Studies on a male sterile strain having theBrassica campestris nucleus and the Diplotascis muralis cytoplasm.Japanese Journal of Breeding，1979，29：305-311)、萝卜(Bannerot H，Boulidard L，Cauderon Y and Tempe J.Transferof cytoplasmic male sterility from Raphanus sativus to Brassica oleracea.Proc.Eucarpia Meeting Cruciferae：1974，52-54)、B.tournefortii(Stiewe G，Robelen G.Establishing cytoplasmic male sterility in Brassica napus by mitochondrial recombination with B.tournefortii.Plant Breeding，1994，(113)：294-304)、Trachystoma ballii(Kirti P B，MohapatraT，Baldev A，Prakash S，Chopra V L.A stable cytoplasmic male-sterile line of Brassica junceacarrying restructured organelle genomes from the somatic hybrid Trachystoma ballii+B.juncea.Plant Breeding，1995，(114)：434-438)、Moricandia arvensis(Prakash P B，Kirti P，Prakash S，Kirti P B，Bhat S R，Gaikwad K，Kumar V D，Chopra V L.A Moricandia arvensis-basedcytoplasmic male sterility and fertility restoration system in Brassica juncea.Theoretical andApplied Genetics，1998，97：488-492)、Arabidopsis thaliana(Leino M，Teixeira R et al.2003 Brassica napus lines with rearranged Arabidopsis mitochondria display CMSand a range of developmental aberrations.Theor Appl Genet 2003，106(7)：1156-1163)等的不育细胞质转入油菜栽培种中，获得了育性较为稳定的异源细胞质雄性不育材料，其中墙生二行芥、T.ballii、M.arvensis的细胞质在芥菜型油菜中诱导了雄性不育(Kirti等，1995；Prakash等，1998)，萝卜、B.tournefortii、A.thaliana的细胞质雄性不育特性则在甘蓝型油菜中得以体现(Hinata等，1979；Pelletier等，1983；Stiewe等，1994；Leino等，2003)。经检索未发现一种利用油菜近缘种特别是野生近缘种诱导油菜细胞质雄性不育的被公开或使用。

                          发明内容

本发明的目的在于提供一种油菜异源细胞质雄性不育系选育的方法，其特点是方法易行，操作性强，获得的雄性不育材料育性稳定性好、对温度变化的敏感性低，制种安全性高，不育株率和不育度均可达到100％。

根据本发明提供的方法并使用本发明提供的实验步骤可实现上述目的。

一种油菜异源细胞质雄性不育系选育的方法，它包括以下步骤：

A、以油菜近缘种(如野芥、白芥等)和油菜栽培种为融合亲本进行原生质体融合，通过植株再生鉴定获得含有近缘种细胞质的体细胞杂交后代植株；

或油菜以近缘种和油菜栽培种为融合亲本进行小孢子之间或小孢子与体细胞之间的融合，通过植株再生鉴定获得含有近缘种细胞质的细胞杂交后代植株；

或以油菜近缘种为母本，油菜栽培种为父本，通过有性杂交获得含有近缘种细胞质的有性杂交后代植株。

B、以油菜栽培种为回交父本，与步骤A中获得的种属间杂交后代进行连续回交4次，每次回交均从回交后代中选择鉴定出雄性不育材料，然后通过连续回交和定向选择转育出含有近缘种细胞质的油菜雄性不育栽培品系。

C、利用PCR技术进行细胞质特异性鉴定，以特异性核苷酸引物获得不同于现有油菜雄性不育细胞质(波里马和萝卜质)的DNA扩增带型，用于鉴定雄性不育细胞质的特异性。

在本发明的一个优选方案中，由甘蓝型油菜与野芥通过属间杂交创建异源细胞质雄性不育并鉴定其特异性的方法包括如下步骤：

1、叶肉原生质体的分离：

甘蓝型油菜及野芥的种子经表面消毒后(置70％的乙醇1分钟，1.5％的次氯酸纳10分钟，无菌水冲洗3次)，接种在MS培养基上培养，置25℃、16小时60-80μmol m^-2s^-1光照条件下生长。取充分展开的叶片用于原生质体的分离。酶解时在5cm的培养皿中加入3.5ml SCM溶液(0.5M山梨醇，10mM CaCl₂，5mM MES，pH5.8)。用解剖刀将叶片划成羽状后加1.5ml酶液(0.2M甘露醇，80mM CaCl₂，2％的纤维素酶，1％的Macerozyme，0.5％的Driselase)，25℃避光酶解14-18个小时，轻微晃动。

2、原生质体的纯化：

用孔径为200目或400目的细胞筛过虑，加W5(154mM NaCl，125mMCaCl₂，5mM KCl，5mM葡萄糖)混匀至10ml离心管中，600rmp/min离心5分钟，弃上清液收集原生质体，用5ml蔗糖+MES(0.5M蔗糖，1mM MES)溶液重新悬浮，在上层加入W5，形成界面离心(600rmp/min)10分钟，用吸管取两界面之间的原生质体带，再用W5悬浮，离心(600rmp/min)5分钟。

3、原生质体融合前处理：

利用5mM的碘乙酸(IOA)处理近缘种原生质体20-45分钟，甘蓝型原生质体不做任何前处理，密度均调至2×10⁶pp/ml。

4、原生质体融合：

将PEG融合液(15％PEG，60mM CaCl₂，90mM甘露醇，25mM甘氨酸，10％DMSO)成对滴入培养皿中。将已处理的两亲本原生质体等体积混匀，加2-3滴在成对的融合液中间，两边再各加1滴融合液，共培养10min。随后将上述混和原生质体逐步用W5+MES稀释，剂量分别为0.125ml，0.25ml，0.375ml，0.5ml，1.0ml，时间间隔1min，共滴入W5+MES溶液2.5ml，在超净工作台上静置共培养1.5小时后，收集原生质体于离心管中，用W5洗涤，离心(600ppm/min)5min。再用液体PellB悬浮原生质体，将调整密度为105pp/ml。

5、原生质体培养

在PellB平板上倒一薄层细胞悬浮液，放上饲养膜，将原生质体溶液滴在饲养膜上，吸去清水，密封，暗培养10-15天。待长成小细胞团后，将细胞团逐个转至PellC平板上，5-7天后将长成3-5mm的小愈伤，转入PellE诱导芽。出芽后将幼芽转至PellF中继续生长，当幼苗出现2-3片展开的叶片后，转至MS培养基上诱导生根。得到生根后的再生植株。

6、体细胞杂种鉴定和繁殖：

生根后的再生植株移栽到温室或大田，进行性状鉴定，花期观察育性，并利用甘蓝型油菜亲本的花粉授粉，获得回交一代(BC₁)种子。

7、种植回交一代BC₁种子，选择回交一代植株群体中的不育株，继续与甘蓝型油菜亲本的花粉授粉，获得回交二代种子。继续种植回交二代种子，选择回交二代植株群体中的不育株，继续用甘蓝型油菜亲本的花粉授粉，获得回交三代种子。继续回交，直到回交群体中不育株率达100％。此时回交群体即为不育系，选育出来的雄性不育系含有油菜近缘种野芥的细胞质，可以用来生物杂交油菜品种，回交父本即为保持系，形成一对同核异质的不育系和保持系。

8、不育胞质特异性鉴定：

1)利用波里马雄性不育细胞质特异性引物，引物序列为Orf224 F：5’-AGCTGT CTG GAG GGA ATC-3’，Orf224 R：5’-ACG ACA TCA AGG AGG AAC-3’，进行DNA聚合酶链式扩增反应，在异源细胞质雄性不育材料中不能扩增出任何产物。

2)利用萝卜质雄性不育细胞质特异性引物，引物序列为Orf138 F：5’-GAAACG GGA AGT GAC AAT AC-3’，Orf138 R：5’-GCA TTA TTT TCT CGG TCCAT-3’，进行DNA聚合酶链式扩增反应，在异源细胞质雄性不育材料中不能扩增出任何产物。

3)利用一对非特异性引物，引物序列为正向：5’-GTG TTG CTG CGC CAAGTC T-3’，反向：5’-CCA GGA GGG CTT GAC GCC-3’，进行DNA聚合酶链式扩增反应，在异源细胞质雄性不育材料中扩增出一条900bp的特异性片断。

本步骤1)、2)和3)中PCR反应条件为：

10ul DNA聚合酶链式反应

10×缓冲液         1ul

MgCl2(25mM)        0.6ul

DNTPs(10uM)        0.8ul

正向引物(5uM)      2.5ul

反向引物(5uM)      2.5ul

Taq DNA合成酶(2U)  0.4ul

重蒸水             0.1ul

模板DNA(10ng/ul)   1.5ul

热循环条件为：

94℃ 2min；

95℃ 45sec，50℃ 30sec，72℃ 2.5min；30次循环

72℃ 10min；

4℃保存

4)利用基于重复序列的PCR(rep-PCR，repetitive sequence basedpolymerase chain reaction)引物，序列为ERIC 1R：5’-TGT AAG CTC CTGGGG ATT CAC-3’，ERIC2：5’-AAG TAA GTG ACT GGG GTGAGC G-3’，进行DNA聚合酶链式扩增反应，在异源细胞质雄性不育材料中扩增出的带型与其他不育胞质不同，其中一条大小约为750bp的带为该异而本方法达到平均再生频率为1.4％，最高可达3.5％。

3、杂种选择容易，由于野芥在本方法所用的培养系统上不能通过原生质体培养再生植株，所以可以选用碘乙酸处理甘蓝型油菜的原生质体，使仅仅两亲本融合后的原生质体才能再生，未融合的或同亲本融合的原生质体则不能再生，真杂种率为100％。

4、细胞质雄性不育诱导成功率高，所有甘蓝型油菜与野芥不同基因型间组配的体细胞组合都诱导出了不育杂种，经回交后均能形成不育群体。

5、雄性不育稳定快，利用不育株与甘蓝型油菜亲本连续回交，很快将体细胞杂种中的细胞核用甘蓝型油菜的细胞核代换，在回交3-5代就能获得100％的不育株率。

6、雄性不育彻底，由于杂种中含有野芥的细胞质特别是线粒体基因组成分，经与甘蓝型油菜连续回交后，其与甘蓝型油菜细胞核基因组互作，导致的异源细胞质雄性不育，较同源细胞质雄性不育更为彻底。

本发明所用的培养系统中PellB、PellC、PellF培养基与Pelletier等(1983)所用相同(Pelletier G P C，Vedel F，Chetrit P，Remy R，Rouselle P，and Renard M.Intergeneric cytoplasm hybridization in Cruciferae by protoplast fusion.MolecularGeneral Genetics，1983，(191)：244-250)。MS培养基则是Murashige和Skoog(1962)发明的(Murashige T and Skoog F，A revised medium for rapid growth andbio-assays with tobacco tissue cultures.Physiol Plant，1962，15：473-497)。

                          附图说明

图1甘蓝型油菜与野芥融合后的原生质体群体，体积较大的为融合原生质体。

源不育胞质所特有。

20ul PCR体系：

10×缓冲液           2ul

MgCl₂(25mM)         2ul

dNTPs(10uM)          0.8ul

ERIC 1R引物(5uM)     2ul

ERIC2引物(5uM)       2ul

Taq DNA合成酶(2U)    1.2ul

重蒸水               6ul

模板DNA(2ng/ul)      4ul

热循环条件：

94℃ 3min；

92℃ 20sec，52℃ 1min，68℃ 5min；37次循环

68℃ 10min；

4℃保存

PCR产物在1％的琼脂糖胶上分离，经溴化乙锭染色后在紫外灯下观察。

本发明的方法与现有技术相比具有以下优点：

1、杂交成功率高，常规杂交基本上不能获得含野芥细胞质的野芥与甘蓝型油菜的杂交后代，本方法无论利用有性杂交还是体细胞杂交，由于采用了组培技术，可成功获得预期杂种。

2、原生质体融合效率高，一般油菜属间原生质体融合的再生频率都低于1％，

图2在饲养膜上长成的小细胞团，每个细胞团可长成一个愈伤组织

图3甘蓝型油菜野芥细胞质雄性不育植株的雄蕊败育情况，左图为正常油菜品种，其雄蕊伸长正常，较雌蕊长，花药饱满，呈四方体，花粉量大。右图为野芥细胞质雄性不育植株，其雄蕊不伸长，花药空瘪，呈楔型，无花粉。

图4甘蓝型油菜野芥细胞质雄性不育植株自交结实情况，左图为正常可育胞质油菜品种，自交结实正常，每角可结14粒种子。中间图为现有同源陕2A细胞质雄性不育系，在武汉气候条件下生长自交每角可结8粒种子。右图为野芥细胞质雄性不育植株，套袋自交不结实。

图5甘蓝型油菜野芥细胞质雄性不育系与现有萝卜质和波里马不育胞质的区别，泳道1为nap CMS，泳道2为萝卜质CMS，泳道3为野芥CMS，泳道4为诸葛菜CMS，泳道5为波里马CMS。左图为一对非特异性引物的扩增产物，在萝卜和野芥不育胞质中均可以扩增出一条带，但大小不同，而在其他不育胞质中无扩增产物。中间图为萝卜细胞质特异引物只在萝卜质材料中可扩增出一条带，而在野芥不育胞质中无扩增产物。右图为波里马细胞质特异引物只在波里马不育胞质材料中可扩增出一条带，而在野芥不育胞质中无扩增产物。

图6一对基于重复序列的PCR引物可将野芥细胞质与现有油菜不育胞质完全区分开来，泳道1为nap CMS，泳道2为拟南芥CMS，泳道3为萝卜质CMS，泳道4为诸葛菜CMS，泳道5为野芥不育胞质，泳道6为波里马不育胞质，箭头示差异条带。

                        具体实施方式

实施实例1：属间杂交创建含野芥细胞质的甘蓝型油菜雄性不育

1、采用植物材料进行原生质体融合或有性杂交(见实施实例2)获得含野芥胞质的体细胞杂种，所用植物材料为甘蓝型油菜双低品种中双4号或新疆野芥资源野油18号，包括以下步骤：

A.、叶肉原生质体的分离：甘蓝型油菜及野芥的种子经表面消毒(置70％的乙醇1分钟，1.5％的次氯酸纳10分钟，无菌水冲洗3次)后，接种在MS培养基上，置25oC、16小时60-80μmol m^-2s^-1光照条件下生长。取充分展开的叶片用于原生质体的分离。酶解时在5cm的培养皿中加入3.5ml SCM溶液(0.5M山梨醇，10mM CaCl2，5mM MES，pH5.8)。用解剖刀将叶片划成羽状后加1.5ml酶液(0.2M甘露醇，80mM CaCl2，2％的纤维素酶，1％的Macerozyme，0.5％的Driselase)，25℃避光酶解14-18个小时，轻微晃动。

B、原生质体的纯化：用孔径为200目或400目的细胞筛过虑，加W5(154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，5mM葡萄糖)混匀至10ml离心管中，600rmp/min离心5分钟，弃上清液收集原生质体，用5ml蔗糖+MES(0.5M蔗糖，1mM MES)溶液重新悬浮，在上层加入W5，形成界面离心(600rmp/min)10分钟，用吸管取两界面之间的原生质体带，再用W5悬浮，离心(600rmp/min)5分钟。

C、原生质体融合前处理与融合：利用5mM的碘乙酸(IOA)处理近缘种原生质体20-45分钟，甘蓝型原生质体不做任何前处理，密度均调至2×10⁶pp/ml。将PEG融合液(15％PEG，60mM CaCl₂，90mM甘露醇，25mM甘氨酸，10％DMSO)成对滴入培养皿中。将已处理的两亲本原生质体等体积混匀，加2-3滴在成对的融合液中间，两边再各加1滴融合液，共培养10min。随后将上述混和原生质体逐步用W5+MES稀释，剂量分别为0.125ml，0.25ml，0.375ml，0.5ml，1.0ml，时间间隔1min，共滴入W5+MES溶液2.5ml，在超净工作台上静置共培养1.5小时后，显微镜下可见大小不同的原生质体(请见图1)。收集原生质体于离心管中，用W5洗涤，离心(600ppm/min)5min。再用液体PellB悬浮原生质体，将调整密度为10⁵pp/ml。

D、原生质体培养：在PellB平板上倒一薄层细胞悬浮液，放上饲养膜，将原生质体溶液滴在饲养膜上，吸去清水，密封，暗培养10-15天，长成小细胞团(请见图2)。将细胞团逐个转至PellC平板上，5-7天后将长成3-5mm的小愈伤，转入PellE诱导芽。出芽后将幼芽转至PellF中继续生长，当幼苗出现2-3片展开的叶片后，转至MS培养基上诱导生根。

2、体细胞杂种鉴定和繁殖

生根后的再生植株移栽到温室或大田，进行性状鉴定，花期观察育性，并利用甘蓝型油菜亲本中双4号的花粉为之授粉，获得回交一代BC₁代种子。

3、不育系和保持系的选育：种植回交一代BC₁种子，选择回交一代群体中的不育株继续与甘蓝型油菜中双4号亲本回交，连续回交3或4或5代，直到回交群体中不育株率达100％。此时回交群体即为不育系，回交父本即为保持系，形成一对同核异质的野芥细胞质雄性不育系及其保持系。所育出来的油菜雄性不育系含有油菜近缘种野芥的细胞质，完全可以用于生产杂交油菜品种。野芥细胞质不育系不育性稳定，雄蕊不伸长，花药完全败育，无花粉产生(请见图3)。不育株套袋自交不结实(请见图4)。利用该不育系生产杂交种，不会因不育株自交而产生假杂种，可显著提高杂交油菜种子纯度。

4、野芥不育胞质特异性鉴定

1)利用波里马雄性不育细胞质特异性引物，引物序列为Orf224 F：5’-AGCTGT CTG GAG GGA ATC-3’，Orf224 R：5’-ACG ACA TCA AGG AGG AAC-3’，进行DNA聚合酶链式扩增反应，在野芥细胞质雄性不育材料中不能扩增出任何产物(图5右)。

2)利用萝卜质雄性不育细胞质特异性引物，引物序列为Orf138 F：5’-GAAACG GGA AGT GAC AAT AC-3’，Orf138 R：5’-GCA TTA TTT TCT CGG TCCAT-3’，进行DNA聚合酶链式扩增反应，在异源细胞质雄性不育材料中不能扩增出任何产物(图5中)。

3)利用一对非特异性引物，引物序列为正向：5’-GTG TTG CTG CGC CAAGTC T-3’，反向：5’-CCA GGA GGG CTT GAC GCC-3’，进行DNA聚合酶链式扩增反应，在异源细胞质雄性不育材料中扩增出一条900bp的特异性片断(图5左)。

上述步骤1)、2)和3)中PCR反应条件为：

10ul DNA聚合酶链式反应

10×缓冲液         1ul

MgCl₂(25mM)       0.6ul

DNTPs(10uM)        0.8ul

正向引物(5uM)      2.5ul

反向引物(5uM)      2.5ul

Taq DNA合成酶(2U)  0.4ul

重蒸水             0.1ul

模板DNA(10ng/ul)   1.5ul

热循环条件为：

94℃ 2min；

95℃ 45sec，50℃ 30sec，72℃ 2.5min；30次循环

72℃ 10min；

4℃保存

4)利用基于重复序列的PCR(rep-PCR，repetitive sequence based polymerasechain reaction)引物，序列为ERIC 1R：5’-TGT AAG CTC CTG GGG ATTCAC-3’，ERIC2：5’-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGCG-3’，进行DNA聚合酶链式扩增反应，在异源细胞质雄性不育材料中扩增出的带型与其他不育胞质不同，其中一条大小约为750bp的带为该异源不育胞质所特有(图6)。

20ul PCR体系：

10×缓冲液           2ul

MgCl₂(25mM)          2ul

dNTPs(10uM)          0.8ul

ERIC 1R引物(5uM)     2ul

ERIC2引物(5uM)       2ul

Taq DNA合成酶(2U)    1.2ul

重蒸水               6ul

模板DNA(2ng/ul)      4ul

热循环条件：

94℃ 3min；

92℃ 20sec，52℃ 1min，68℃ 5min；37次循环

68℃ 10min；

4℃保存

PCR产物在1％的琼脂糖胶上分离，经溴化乙锭染色后在紫外灯下观察。

实施例2：有性杂交获得含野芥胞质的体细胞杂种

1)子房培养生产含野芥细胞质的属间杂种：田间种植野芥及甘蓝型油菜，开花期以野芥为母本，甘蓝型油菜为父本，进行人工去雄和授粉，授粉7-10天后，采回开始发育的角果，经表面消毒(置70％的乙醇1分钟，1.5％的次氯酸纳10分钟，无菌水冲洗3次)后，置含0.8％的水解酪蛋白的MS培养基上，置25℃、16小时60-80μmol m^-2s^-1光照条件下培养，35-40天后，将角果中的幼胚取出，置MS培养基上萌发，萌发后在25℃、16小时60-80μmol m^-2s^-1光照条件下让其长出真叶。

2)属间杂种的染色体加倍：待真叶长出之后，将幼苗切下，置含0.01％秋水仙碱的MS培养基中处理10天进行染色体加倍，随后转入含0.2mg/l NAA的MS培养基上生根，获得染色体加倍后的含野芥细胞质的甘蓝型油菜与野芥有性杂交一代F1。

3)将杂种植株转入田间，根据形态性状鉴定杂种的真实性。选取染色体加倍成功的杂种植株(植株生长正常，器官大小也正常，有花粉)，花期利用甘蓝型油菜做父本与之回交一次，获得回交一代(BC1)种子。

4)种植BC1种子建成BC1植株群体，选择BC1回交群体中的不育株继续与甘蓝型油菜亲本回交4次，直到回交群体中不育株率达100％。此时回交群体即为野芥细胞质雄性不育系，回交父本即为保持系，形成一对同核异质的不育系和保持系。

4、不育胞质特异性鉴定同实施实例1。

Claims (2)

1、一种油菜异源细胞质雄性不育系选育的方法，它包括下列步骤：

A、原生质体融合或有性杂交采用植物材料获得含油菜近缘种细胞质的体细胞杂种：首先是叶肉原生质体的分离，甘蓝型油菜及油菜近缘种的种子经消毒后，接种在MS培养基上培养，光照，取展开的叶片用于原生质体的分离，酶解时在培养皿中加入3.5ml SCM溶液，将叶片划成羽状后加1.5ml酶液，避光酶解14-18个小时，晃动；其次是用孔径为200目或400目的细胞筛过虑，加W5混匀至离心管中，离心，弃上清液收集原生质体，用蔗糖+MES溶液重新悬浮，在上层加入W5，形成界面离心，用吸管取两界面之间的原生质体带，再用W5悬浮，离心；第三是原生质体前处理与融合，利用5mM的碘乙酸处理近缘种原生质体20-45分钟，密度均调至2×10⁶pp/ml，将PEG融合液成对滴入培养皿中，将已处理的两亲本原生质体等体积混匀，加2-3滴在成对的融合液中间，两边再各加1滴融合液，共培养，将上述混和原生质体用W5+MES稀释，静置共培养，收集原生质体于离心管中，用W5洗涤，离心，再用液体PellB悬浮原生质体，将调整密度为105pp/ml；第四是原生质体培养，在PellB平板上倒一薄层细胞悬浮液，放上饲养膜，将原生质体溶液滴在饲养膜上，吸去清水，密封，暗培养10-15天，长成细胞团后，将细胞团转至PellC平板上，5-7天后将长成3-5mm的小愈伤，转入PellE诱导芽，出芽后将幼芽转至PellF中继续生长，当幼苗出现2-3片展开的叶片后，转至MS培养基上诱导生根，得到生根后的再生植株；

或有性杂交生产含油菜近缘种细胞质的属间杂种，利用子房培养生产含油菜近缘种细胞质的属间杂种，首先是田间种植油菜近缘种及甘蓝型油菜，开花期以近缘种为母本，甘蓝型油菜为父本，进行人工去雄和授粉，授粉7-10天后，采回开始发育的角果，经消毒后，置含0.8％的水解酪蛋白的MS培养基上，置25℃、16小时60-80μmol m-2s-1光照条件下培养，35-40天后，将角果中的幼胚取出，置MS培养基上萌发，萌发后在25℃、16小时60-80μmol m-2s-1光照条件下让其长出真叶；其次是进行属间杂种的染色体加倍，待真叶长出之后，将幼苗切下，置含0.01％秋水仙碱的MS培养基中处理10天进行染色体加倍，转入含0.2mg/l NAA的MS培养基上生根，获得染色体加倍后的含近缘种细胞质的甘蓝型油菜与近缘种有性杂交一代F1；

B、体细胞杂种鉴定和繁殖：生根后的再生植株移栽到温室或大田，进行性状鉴定，花期观察育性，并利用甘蓝型油菜花粉为之授粉，获得回交一代BC₁种子；

C、不育系和保持系的选育：种植回交一代BC₁种子，选择回交一代植株BC1群体中的不育株继续与甘蓝型油菜亲本的花粉授粉，获得回交二代种子，继续种植回交二代植株群体中的不育株，继续用甘蓝型油菜亲本的花粉授粉，获得回交三代种子，继续回交，直到回交群体中不育株，回交群体为不育系，回交父本为保持系，形成一对同核异质的油菜异源细胞质雄性不育系和保持系；

D、异源不育胞质特异性鉴定：利用波里马和萝卜质雄性不育细胞质特异性引物，引物序列分别为Orf224 F：5’-AGC TGT CTG GAG GGA ATC-3’，Orf224R：5’-ACG ACA TCA AGG AGG AAC-3’、Orf138 F：5’-GAA ACG GGA AGT GACAAT AC-3’，Orf138 R：5’-GCA TTA TTT TCT CGG TCC AT-3’，进行DNA聚合酶链式扩增反应，在异源细胞质雄性不育材料中不能扩增出产物，利用一对非特异性引物，引物序列为：5’-GTG TTG CTG CGC CAA GTC T-3’，5’-CCA GGAGGG CTT GAC GCC-3’，进行DNA聚合酶链式扩增反应，在异源细胞质雄性不育材料中扩增出一条900bp的特异性片断，利用基于重复序列的PCR引物，序列为ERIC 1R：5’-TGT AAG CTC CTG GGG ATT CAC-3’，ERIC2：5’-AAG TAAGTG ACT GGG GTG AGC G-3’，进行DNA聚合酶链式扩增反应，获得异源雄性不育细胞质的特征带。

2、根据权利要求书1所述的一种油菜异源细胞质雄性不育系选育的方法，其特征在于所选育出的油菜雄性不育系含有油菜近缘种野芥的细胞质。

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