CN107326042A

CN107326042A - 水稻tms10基因的定点敲除系统及其应用

Info

Publication number: CN107326042A
Application number: CN201710345610.9A
Authority: CN
Inventors: 张大兵; 梁婉琪; 余君萍; 袁政; 陈明姣; 罗治靖
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2017-05-16
Filing date: 2017-05-16
Publication date: 2017-11-07

Abstract

本发明涉及水稻TMS10基因的定点敲除系统及其应用。所述定点敲除系统如下，定点敲除系统包括CRISPR/Cas9系统和sgRNA靶点；sgRNA靶点为水稻雄性不育基因TMS10中含有PAM或NGG的序列；CRISPR/Cas9系统为CC‑TMS10‑1；CC‑TMS10‑1靶序列为SEQ ID NO.1序列的第2281位至第2299位。所述应用是：通过单独使用CC‑TMS10‑1对不同粳稻和籼稻品种的TMS10基因进行靶向敲除；实验证明，在不同水稻品种中定点敲除诱导产生的纯合突变转化植株表现出温敏雄性不育特征。本发明为创造基于水稻温敏雄性不育基因TMS10的温敏雄性不育系种质资源、水稻杂交制种提供高效的育种方式。

Description

水稻TMS10基因的定点敲除系统及其应用

技术领域

本发明属于水稻育种技术领域，具体涉及一种水稻雄性不育基因TMS10的定点敲除系统及其在不同水稻品种中的应用。

背景技术

雄性不育系为水稻杂交制种技术提供关键的育种材料，在全世界范围内展开广泛的研究。水稻温敏雄性不育(Thermo-sensitive genic Male Sterile，TMS10)基因编码一个参与水稻花药发育的亮氨酸富集重复序列的受体激酶(LRR-RLK)，主要在花药发育早期表达。TMS10基因的突变会造成水稻温敏雄性不育，表现出在平均温度高温下雄性不育、平均温度低温条件下恢复可育的特征；此外，TMS10不育系和恢复系JP69杂交产生的F1代具有杂种优势，因此，基于TMS10的温敏雄性不育系，可用于水稻两系杂交稻制种，应用前景广阔。

CRISPR/Cas9(成簇、规律间隔短回文重复序列及相关蛋白)系统是近几年出现的基因组编辑新技术，在各种生物和细胞等领域都有广泛的研究和应用。CRISPR/Cas9系统是一种源于原核生物抵御噬菌体、质粒等入侵长期进化的获得性免疫系统，其在指导RNA下完成对外源遗传物质的降解。CRISPR/Cas9系统的Cas9蛋白与sgRNA形成复合体，切割与sgRNA上的spacer互补的基因组DNA序列，产生DNA双链断裂(DSB)，激活细胞启动DNA损伤修复机制，通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)方式引入突变。与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)相比，CRISPR/Cas9系统技术具有设计简单、构建快速、突变效率高、多靶点同时编辑等优势。

目前，水稻雄性不育系的创制主要是通过持续杂交和回交的方式将不育基因或位点导入其他水稻品种中，但是转育周期较长、过程较复杂、劳动成本大。本发明通过CRISPR/Cas9系统的靶向修饰直接对水稻TMS10基因进行定点突变或敲除，创制基于TMS10基因的水稻温敏雄性不育株系，将大大缩短育种周期。

发明内容

本发明的目的在于克服现有水稻雄性不育系的创制存在的转育周期较长、过程较复杂、劳动成本大等缺陷，提供一种水稻TMS10基因的定点敲除系统及其应用；具体涉及一种水稻雄性不育基因TMS10的定点敲除系统及其在水稻品种粳稻品种9522、农6B、空育131；籼稻品种明辉63、珍汕97中定点敲除应用的方法，利用TMS10基因及其蛋白参与水稻花药发育调控的特点及CRISPR/Cas9系统的基因组靶向修饰，通过突变该基因核苷酸序列筛选水稻雄性不育株系，在农业生产上具有十分重要的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种水稻雄性不育基因TMS10的定点敲除系统；所述定点敲除系统包括CRISPR/Cas9系统，以及sgRNA靶点；所述sgRNA靶点为水稻雄性不育基因TMS10中含有PAM或NGG的序列。

备注：其基本的原理是由CRISPR/Cas9系统，形成重组载体，将重组载体转入水稻中，重组载体与sgRNA位点结合，造成对应翻译形成的DNA断裂，进而实现突变。

优选的，所述水稻雄性不育基因TMS10的定点敲除系统由CC-TMS10-1组成；

所述CC-TMS10-1为特异性修饰所述水稻雄性不育基因TMS10内靶序列的CH-CRISPR/Cas9系统；所述靶序列为位于SEQ ID NO.1所示序列的第2281位至第2299位的核酸序列；所述靶点序列长度为19bp。单独使用所述CC-TMS10-1可在所述水稻基因TMS10内靶序列处引入插入缺失突变，使所述水稻TMS10基因失去原有的功能；

在上述定点敲除系统中，所述CC-TMS10-1由SEQ ID NO.1所示序列的第2281位至第2299位所示核苷酸序列组成。

在上述定点敲除系统中，所述水稻TMS10基因为SEQ ID NO.1序列所示基因。

本发明保护含有上述所述定点敲除系统的编码基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或重组细胞系。

所述重组表达载体为重组表达载体CC-TMS10-1；

所述重组表达载体CC-TMS10-1为在载体pCAMBI1300的CAMV35S启动子下游插入CC-TMS10-1入门载体；所述CC-TMS10-1入门载体是将载体18T-Cas9-chimeric-Os中BbsI位点间的片段替换为所述靶序列的重组载体。所述CC-TMS10-1靶序列具体为SEQ ID NO.1所示序列的第2281位至第2299位的核酸序列。

本发明还涉及一种水稻雄性不育株系创制的方法，包括：

常规水稻品种选择：在水稻中筛选上述定点敲除系统在所述水稻品种中表达的步骤；

CC-TMS10-1在水稻的表达，转化植株筛选，突变植株鉴定，即得水稻温敏雄性不育基因TMS10定点敲除的不育株系。

在上述方法中，所述水稻品种包括粳稻品种、籼稻品种；所述粳稻品种包括9522、N6B(农6B)、KY131(空育131)；所述籼稻品种包括明辉63、珍汕97。

所述CC-TMS10-1在水稻的表达是通过将所述重组表达载体CC-TMS10-1将编码所述CC-TMS10-1的靶序列导入所述水稻中实现的。

所述转化植株筛选是通过CRISPR/Cas9系统载体的通用引物M13F和CC-TMS10-1靶序列R引物(CC-TMS10-1R，如SEQ ID NO.3所示序列)的聚合酶链式反应扩增实现的。

所述突变植株鉴定是通过TMS10基因的特异性引物扩增TMS10基因的基因组片段，，然后进行测序及与TMS10野生型序列比对实现的；所述特异性引物为如SEQ ID NO.4所示的TMS10-F和如SEQ ID NO.5所示的TMS10-R。

上述方法中，采用CRISPR/Cas9技术使所述水稻品种中如SEQ ID NO.1所示序列第2281位至第2299位发生插入或缺失，进而获得所述水稻雄性不育株系。

本发明还涉及本发明的定点敲除系统及所述方法在创制水稻雄性不育株系中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、实验证明，单独使用CC-TMS10-1导入所述水稻品种9522、农6B、空育131、明辉63、珍汕97获得的TMS10基因突变植株的突变率分别为9.4％、10.5％、9.5％、20％、17.6％；同时在所述水稻品种中定点敲除诱导产生的纯合突变转化植株表现出雄性不育特征。

2、本发明为创造基于水稻温敏雄性不育基因TMS10的雄性不育系种质资源、水稻杂交制种提供一种高效的育种方式。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为重组表达载体活性检测的测序峰图；

图2为水稻品种9522中定点敲除诱导纯合突变植株的表型观察，具体为9522野生型和tms10突变体及9522^tms10在高低温下小花育性示意图；其中，图2A粳稻9522野生型小花示意图；图2B高温生长条件下粳稻tms10小花去掉一半内外稃示意图；图2C低温生长条件下粳稻tms10小花去掉一半内外稃示意图；图2D高温生长条件下粳稻9522^tms10纯合子小花去掉一半内外稃示意图；图2E低温生长条件下粳稻9522^tms10纯合子小花去掉一半内外稃示意图；图2F粳稻9522开花期花药I₂-KI示意图；图2G高温生长条件下粳稻tms10开花期花药I₂-KI示意图；图2H低温生长条件下粳稻tms10开花期花药I₂-KI示意图；图2I高温生长条件下粳稻9522^tms10成熟期花药示意图；图2J低温生长条件下粳稻9522^tms10纯合子开花期花药I₂-KI示意图；且，图2A到图2E的图标等于1毫米；图2F和图2J的图标等于100微米；

图3为水稻品空育131中定点敲除诱导纯合突变植株的表型观察，具体为KY131野生型及KY131^tms10纯合子在高低温下的表型示意图；其中，图3A粳稻KY131野生型小花示意图；图3B高温生长条件下粳稻KY131^tms10小花示意图；图3C低温生长条件下粳稻KY131^tms10小花示意图；图3D粳稻KY131野生型小花去掉内稃示意图；图3E高温生长条件下粳稻KY131^tms10小花去掉内稃示意图；图3F低温生长条件下粳稻KY131^tms10小花去掉内稃示意图；图3G粳稻ky131野生型成熟期花药示意图；图3H高温生长条件下粳稻KY131^tms10成熟期花药示意图；图3I低温生长条件下粳稻KY131^tms10成熟期花药示意图；图3J粳稻KY131开花期花药I₂-KI示意图；图3K高温生长条件下粳稻KY131^tms10开花期花药I₂-KI示意图；图3L低温生长条件下粳稻KY131^tms10开花期花药I₂-KI示意图；且，图3A到图3F的图标等于1毫米；图3G和图3I的图标等于500微米；图3J到图3L的图标等于200微米；

图4为水稻品种种农6B中定点敲除诱导纯合突变植株的表型观察，具体为N6B野生型及N6B^tms10纯合子在高低温下的表型示意图；其中，图4A粳稻N6B野生型小花示意图；图4B高温生长条件下粳稻N6B^tms10小花示意图；图4C低温生长条件下粳稻N6B^tms10小花示意图；图4D粳稻N6B野生型小花去掉内稃示意图；图4E高温生长条件下粳稻N6B^tms10小花去掉内稃示意图；图4F低温生长条件下粳稻N6B^tms10小花去掉内稃示意图；图4G粳稻N6B野生型成熟期花去内外稃示意图；图4H高温生长条件下粳稻N6B^tms10成熟期花去内外稃示意图；图4I低温生长条件下粳稻N6B^tms10成熟期花去内外稃示意图；图4J粳稻N6B开花期花药I₂-KI示意图；图4K高温生长条件下粳稻N6B^tms10开花期花药I₂-KI示意图；图4L低温生长条件下粳稻N6B^tms10开花期花药I₂-KI示意图；且，图4A到图4I的图标等于1毫米；图4J到图4L的图标等于200微米；

图5为水稻品种明辉63中定点敲除诱导纯合突变植株的表型观察，具体为明恢63(MH63)野生型及MH63^tms10纯合子在高低温下的表型示意图；其中，图5A籼稻MH63野生型小花示意图；图5B高温生长条件下籼稻MH63^tms10小花示意图；图5C低温生长条件下籼稻MH63^tms10小花示意图；图5D籼稻MH63野生型小花去掉外稃示意图；图5E高温生长条件下籼稻MH63^tms10小花去掉外稃示意图；图5F低温生长条件下籼稻MH63^tms10小花去掉外稃示意图；图5G籼稻MH63野生型成熟期花去内外稃示意图；图5H高温生长条件下籼稻MH63^tms10成熟期花去内外稃示意图；图5I低温生长条件下籼稻MH63^tms10成熟期花去内外稃示意图；图5J籼稻MH63开花期花药I₂-KI示意图；图5K高温生长条件下籼稻MH63^tms10开花期花药I₂-KI示意图；图5L低温生长条件下籼稻MH63^tms10开花期花药I₂-KI示意图；且，图5A到图5I的图标等于1毫米；图5J到图5L的图标等于200微米；

图6为水稻品种珍汕97中定点敲除诱导纯合突变植株的表型观察，具体为珍汕97(ZS97)野生型及ZS97^tms10纯合子在长日照、高低温下的表型示意图；其中，图6A籼稻ZS97野生型小花示意图；图6B高温生长条件下籼稻ZS97^tms10小花示意图；图6C低温生长条件下籼稻ZS97^tms10小花示意图；图6D籼稻ZS97野生型小花去掉内外稃示意图；图6E高温生长条件下籼稻ZS97^tms10小花去掉内外稃示意图；图6F低温生长条件下籼稻ZS97^tms10小花去掉内外稃示意图；图6G籼稻ZS97野生型成熟期花药示意图；图6H高温生长条件下籼稻ZS97^tms10成熟期花药示意图；图6I低温生长条件下籼稻ZS97^tms10成熟期花药示意图；图6J籼稻ZS97开花期花药I₂-KI示意图；图6K高温生长条件下籼稻ZS97^tms10开花期花药I₂-KI示意图；图6L低温生长条件下籼稻ZS97^tms10开花期花药I₂-KI示意图；且，图6A到图6I的图标等于1毫米；图6J到图6L的图标等于200微米。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中如无特殊说明的实验方法，均为常规方法。

实施例1、水稻雄性不育基因TMS10的序列及分析

水稻雄性不育基因TMS10的序列如SEQ ID NO.1序列所示。序列分析显示，该基因共包括11个外显子，分别为SEQ ID NO.1序列的第235-307位(第一外显子)、第2241-2373位(第二外显子)、第2487-2558位(第三外显子)、第3271-3414位(第四外显子)、第3514-3585位(第五外显子)、第3694-3759位(第六外显子)、第3846-3916位(第七外显子)、第4039-4179位(第八外显子)、第4590-4931位(第九外显子)、第5235-5626位(第十外显子)、第5724-6038位(第十一外显子)。

本发明以第二外显子上的第2281位至第2299位核苷酸序列为CRISPR/Cas9系统的靶序列。

实施例2、CRISPR/Cas9系统引物设计及其重组表达载体的构建

2.1 CRISPR/Cas9系统靶序列的选择

CRISPR/Cas9系统靶向水稻TMS10基因的第二外显子的正义链，靶序列如下：5’-TGGCAATCAGCTTTCGGAT-3’(SEQ ID NO.1序列的第2281位至第2299位。

2.2 CRISPR/Cas9系统靶序列引物的设计与合成

基于CH-CRISPR/Cas9系统设计靶向TMS10基因的靶序列引物，靶序列引物分别如下：Forward primer：5’-TGGCGTGGCAATCAGCTTTCGGAT-3’(SEQ ID NO.2所示序列，CC-TMS10-1F)和Reverse primer：5’-AAACATCCGAAAGCTGATTGCCAC-3’(SEQ ID NO.3所示序列，CC-TMS10-1R)；合成CRISPR/Cas9系统的靶序列引物。

2.3 CRISPR/Cas9系统重组表达载体的构建

将SEQ ID NO.2所示序列和SEQ ID NO.3所示序列通过引物退火方法合成双链靶序列，并通过酶切、连接方法插入到18T-Cas9-chimeric-Os载体的水稻U3启动子下游，获得CC-TMS10-1入门载体；经测序证实，CC-TMS10-1入门载体的水稻U3启动子下游插入SEQ IDNO.2所示序列；通过酶切、连接方法将CC-TMS10-1入门载体插入到pCAMBIA1300载体CAMV35S启动子下游，获得重组表达载体CC-TMS10-1；经测序证实，重组表达载体CC-TMS10-1的CAMV35S启动子下游插入SEQ ID NO.2所示序列；

所述18T-Cas9-chimeric-Os载体(文献信息为Mao Y，Zhang H，Xu N，Zhang B，GouF，Zhu JK Application of the CRISPR-Cas System for Efficient GenomeEngineering in Plants.Mol Plant.(2013)6(6)：2008-2011)、pCAMBIA1300载体来源于中国科学院上海生命科学研究院朱健康老师实验室。

实施例3、重组表达载体的活性检测

将实施例2中的重组表达载体CC-TMS10-1通过PEG介导导入水稻原生质体，获得重组表达载体CC-TMS10-1的瞬时表达结果；经测序验证，获得重组表达载体CC-TMS10-1在水稻原生质体中诱导生成的定点突变峰图(图1)。

实施例4、重组根癌农杆菌的获得

将实施例2中重组表达载体CC-TMS10-1电击转化农杆菌EH105，获得含有重组表达载体CC-TMS10-1的重组农杆菌，命名为EH105-CC-TMS10-1；

实施例5、定点敲除系统在不同水稻品种的应用

将实施例4中的重组农杆菌EH105-CC-TMS10-1侵染水稻粳稻品种9522、农6B、空育131；籼稻品种为明辉63、珍汕97的成熟胚诱导的愈伤组织，将获得的转化植株分别命名为9522-CC-TMS10-1、农6B-CC-TMS10-1、空育131-CC-TMS10-1、明辉63-CC-TMS10-1、珍汕97-CC-TMS10-1。转化实验具体方法如下：

1、将重组农杆菌接种于YEB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素和20μg/ml利福平)中，28℃、200rpm条件下振荡培养至OD600为0.6-0.8；以5000rpm、4℃离心5min，用AAM液体培养基(乙酰丁香酮浓度为200μM/L，pH 5.2)重悬菌体沉淀浓度至OD600为0.6-0.8。

2、分别将水稻粳稻品种9522、农6B、空育131的成熟种子除去颖壳，在75％乙醇中浸泡1min，然后在NaClO溶液中(与水1∶2混合，加1滴吐温20)振荡消毒20min，重复2次。经无菌水冲洗数次至无异味，将消毒后的水稻粳稻品种9522、农6B、空育131分别接种于NBD2培养基上诱导愈伤组织，26℃黑暗培养8-10天，切除根和残留胚乳，继代培养10天，获得成熟胚愈伤组织。

3、将步骤2获得的成熟胚愈伤组织分别浸于步骤1获得的重组农杆菌重悬液中，20～30min后移出水稻材料，接种于含有两层滤纸的共培养培养基(乙酰丁香酮浓度为100μM/L，pH 5.2)上，26℃黑暗条件下共培养3天。

4、将经过步骤3共培养的愈伤组织接种于筛选培养基(潮霉素浓度为50mg/L，pH5.8)中，28℃黑暗条件下筛选培养12天，转移抗性愈伤组织至含有50mg/L的Hyg的选择培养基上继续筛选12天。

5、重复筛选2次后，转移抗性愈伤组织至分化培养基上(24小时光照/天)诱导分化；待新的无根幼苗生成，转移再生幼苗至1/2MS培养基上诱导生根；待小苗茁壮后移入人工气候室进行营养液栽培。

6、获得的再生植株移栽成活后，提取再生植株的叶片总DNA，分别以基于重组表达载体CC-TMS10-1的M13F引物(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’，SEQ ID NO.6)和靶序列R引物(CC-TMS10-1R，SEQ ID NO.3)进行PCR扩增筛选阳性转化植株。统计检测的再生植株数、阳性转化植株数及阳性转化植株数占检测的再生植株数的百分比即突变效率(％)，结果如表1所示。

表1. CC-TMS10-1转化水稻品种的阳性率检测结果

7、以水稻雄性不育基因TMS10的基因组为模板，用引物TMS10-F(5’-AGAGGAGTGAAAGTTGAGTTGG-3’(对应于SEQ ID NO.4序列))和TMS10-R(5’-CAGCACAAACTTGTTGGAATTA-3’(对应于SEQ ID NO.5序列))进行PCR扩增，将所获得805bp扩增产物进行测序验证。测序验证结果如表2所示。统计检测的再生植株数、发生突变转化植株数及发生突变转化植株数占检测的再生植株数的百分比即突变效率(％)，结果如表2所示。

表2. CC-TMS10-1诱导水稻雄性不育基因TMS10发生突变的检测结果

8、从水稻品种9522中纯合突变转化植株表型上来看，在高温(HT)条件下，与野生型的饱满花药相比，9522^tms10突变体的花药与tms10突变体花药相似偏小并且皱缩的特征；而在低温(LT)条件下，9522^tms10突变体的花药与tms10突变体花药及野生型花药大小相似、花药饱满。花粉碘染结果证实9522^tms10突变体与tms10突变体在高温条件下不育，低温条件下可育(图2)，而野生型花粉碘染结果显示在高、低温条件下可育(图2)，这说明利用CRISPR/Cas9系统创制的9522^tms10突变体具有与tms10突变体相似的温敏不育性，可用于水稻两系杂交制种。

9、从水稻品种空育131(KY131)中纯合突变转化植株表型上来看，与野生型植株相比，在高温条件下，KY131^tms10突变体花药表现出雄性不育的特征，而在低温条件下，KY131^tms10突变体花药表现出恢复可育的特征(图3)，这说明利用CRISPR/Cas9系统创制KY131^tms10突变体的雄性生殖发育和育性受TMS10基因的控制，具有水稻两系杂交制种的应用潜力。

10.从水稻品种农6B(N6B)中纯合突变转化植株表型上来看，与野生型植株相比，在高温条件下，N6B^tms10突变体花药表现出不育的特征，而在低温条件下，N6B^tms10突变体花药表现出可与育的特征(图4)，这说明利用CRISPR/Cas9系统创制的N6B^tms10突变体的雄性生殖发育和育性受TMS10基因的控制，具有水稻两系杂交制种的应用潜力。

11.从籼稻品种明辉63(MH63)中纯合突变转化植株表型上来看，与野生型植株相比，在高温条件下，MH63^tms10突变体花药表现出雄性不育的特征，而在低温条件下，MH63^tms10突变体花药表现出恢复可育的特征(图5)，这说明利用CRISPR/Cas9系统创制MH63^tms10突变体的雄性生殖发育和育性受TMS10基因的控制，具有水稻两系杂交制种的应用潜力。

12.从籼稻品种珍汕97(ZS97)中纯合突变转化植株表型上来看，与野生型植株相比，在高温条件下，ZS97^tms10突变体花药表现出雄性不育的特征，而在低温条件下，ZS97^tms10突变体花药表现出恢复可育的特征(图6)，这说明利用CRISPR/Cas9系统创制ZS97^tms10突变体的雄性生殖发育和育性受TMS10基因的控制，具有水稻两系杂交制种的应用潜力。

综上所述，本发明提供一种水稻雄性不育基因TMS10的定点敲除系统，并在不同水稻品种中实现控制水稻雄性生殖发育和育性；本发明筛选的水稻突变体在营养生长时期与受体材料来源无明显差异，进入生殖生长阶段后，雄性生殖器官发育异常、花粉败育引起植株不育，在农业生产上具有十分重要的应用。

实施例6、CRISPR/Cas9定点敲除系统在水稻中敲除TMS10获得温敏雄性不育材料

CRISPR/Cas9(clustered，regularly interspaced，short palindromicrepeats)是一种细菌降解外源入侵DNA的免疫机制，CRISPR系统分为三类其中第一类和第三类需要多种CRISPR相关的Cas蛋白协调发挥作用，而第二类系统只需要一种Cas蛋白即可。Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链，Cas9首先与由crRNA及tracrRNA构成的sgRNA(single guide RNA)结合成复合物，然后通过PAM(5’-NGG-3’)序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。由于PAM序列结构简单，几乎可以在所有的基因中找到大量靶点。CRISPR/Cas9通过对靶点的DNA位点序列切割，造成DNA双链断裂(DSB，double strandbreak)。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：一是低保真性的非同源末端连接途径(NHEJ，Non-homologous end joining)，此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入(Indel)，从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。第二种DNA断裂修复途径为同源介导的修复(HR，homology-directedrepair)，这种基于同源重组的修复机制保真性高，但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。

CRISPR/Cas9定点敲除系统相关的研究如火如荼，目前报道了很多行之有效的经过加工和改造的针对于水稻基因编辑的CRISPR/Cas9定点敲除系统。由于本应用中所提到的靶位点已经在多种水稻品种中经过验证能成功敲除，因此其它经验证能成功进行水稻基因编辑的CRISPR/Cas9定点敲除系统应用本发明中所用的SEQ IDNO.1中第二外显子上的第2281位至第2299位核苷酸序列作为靶标序列都可以达到敲除TMS10的目的。此外，由于PAM位点结构简单，在TMS10基因组中存在多个特异(5’-NGG-3’)位点，因此可以选择其它靶位点，应用CRISPR/Cas9系统来进行TMS10的定点敲除。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学

<120> 水稻TMS10基因的定点敲除系统及其应用

<130> DAG29415

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6439

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

aaataaagga aaaaaaaaac actcgagaag ttcttctcct cctcctcttt ccccttcctc 60

tcgccgcccc aaatcacccg cccaccaaaa ccctcgccgc ggcctccgcc gccgcgggat 120

tccggccacc accagcagcc gccgcggcca ccggggcgcc ctcctcctcc tgccccccgg 180

caccggcgac cgaccatccc cttgccccct ttccccgtcg ggttgtgagg cgagatgagg 240

gagctgcgcg tcgccgtcct catcatcgcg gtctcgctgc cgtccttctc cgcgtccgac 300

cgccaaggta ccttagcttt ttgctgctct ccgaccccag tcgcctcgcc tgcgacgccc 360

cccggttgtc tcctccgagc ttctgtgtag tgtagtgtag tgtagtgcag tactgtagct 420

tcaattttcg catggtagat taccgaacgc cttgtggatt acatgccgtg gcacactgtc 480

gcgatggtag cgaagtaggt aaccagatgc catgtggaat tgctgtattg atttccaacg 540

ctacagacct taggttacct tcaattgata atacatagca caccttgcag taggtactac 600

tgctcgcttt cgttttgata gcttggaact actgcttttg gtcaaaactt gccttaaatg 660

tgaacgtact gctagttgct tagtccaaac aaagggaaaa gaaggcgcca acatgctaac 720

taatgcttcg ttggctgacg tggtcgcctg cgcaccagtc taaatctaaa ggtttatcca 780

aaaatagcat ggatttgaaa atgctgcata ttttgagata ttaagaaatt gcggaaagta 840

ggcacatgtt ttctcaaaac tttagaactg tcaaggtttt tatcctgaaa tgactgtttt 900

tgtttatatc gatggcttca ctgcagcatt aatgttatgt gataattgca tttttggaat 960

tgtgtctggg aaatacatgt ggtggatgca acaatacata ttacactctt tgaatcccca 1020

tatgttatat agtgagaata ttctttattt gccctacaag ttagtaactt accttatttg 1080

ctcctatgaa tgttcccctg ttgaccactt aaactcagtt tatgcccctt attattgacc 1140

ctcccaccac cctcctgtaa ctgttctgtg aactatgatg gaacatgtca attttgccct 1200

tcttccccct caatcccttc attgccatct tatatatctt cattggacgg catttcccca 1260

tcttgtcttc tgctggtacc gtggacggga ggctaattgg ccaaagaaga gggaggcagc 1320

ggagaaacag agatcatcaa agctgtccgt ctcatgcaaa tctgccatcc acaccattcg 1380

tcgagctcat gacaccattt tttcactggg ccactggagc tcatgacacc atgactgtcc 1440

ttccatggcc taccgccttt gttgagatta cgacagtttt gtggccctac ctagtctttc 1500

ccaagctcac agcatccatg gctggtgtca tcagatcttg ccacagacac tgctctgtct 1560

ttcaccaatc tcttgactgc cacagccctc ttgccataaa caaaaatgtg atttgctgca 1620

atttacagat tacagagaga gttatagaga agattagatc aacatggaaa tcaggcctat 1680

acggaaacca tgggatctat ctattctaaa ttcctaacca tttttcccct aatagtggaa 1740

atcaagtaaa atgcaagtgc cctgattgtt gccggatgga agaaatcgga cgggagagag 1800

aaaaaagtga gagtgaaaag gaaaaggtga ggaaggaaaa gaagaaactg acagtggccg 1860

ggatcagggg tacagctgct atatgagcaa aatagtgaga agaatattcg attaactgta 1920

tagcatacta acagaatgta actggaaggg gaaaagagga gtgaaagttg agttggcaaa 1980

tgagggatta tagtttctgt aaggggaaat gaaaagaatt ttctctacag agtgaaaaca 2040

cgggcaacaa tattcatatt agatgcccct atcatgcgag cttattatta cttgaaaatt 2100

tattcctcat ttttatgagt ggcgaatctt tggttggcac taactttggt gtaatcctga 2160

ggtattaagt tagttgatga acatagagta acttgttatt tatcctctgg ttctcaaaaa 2220

ccttttgtat gttttaccag gagatgcctt atatgatatg aaacaaaaac tgaatgttac 2280

tggcaatcag ctttcggatt ggaaccaaaa tcaagtcaac ccttgtacat ggaattctgt 2340

aatttgtgac aataacaaca atgttattca agtgtaagtt ggagctcatg caccttctca 2400

tcttgtacac ttaaatttta tactgattcc cacctctgct ctttgtcctg tttgttttca 2460

ttttttatga taatgctttc ctacagaaca ttggctgctc gtggatttgc tggagttttg 2520

tcaccaagaa ttggagaact gaaatatttg actgtcctgt gagtacatta ttctattatg 2580

tagattaata atacttggga attcaatata tgagtgttca ataaatggtt atgaagttgg 2640

taggaaaacc acaatctata ctaaattaag agaaaaatat tttctcaata cttgaaagta 2700

tttctgtaat ttgaaaaata taaataggtg gcatgagtaa ttccaacaag tttgtgctga 2760

ccccagaaac tgttgttaat attgctttca gttcctctat ttaatccctt tttaaaaggc 2820

aaacactaag gtagaaccct actggaaaat cattggatca aaataaaata aatatgcaat 2880

aaaaaagtta aaaaaatcaa gaagtccaag cacccaactc tgcaagatct gcacaaaatc 2940

ttaaggtcaa ttctatggag ttctgttcct ggtagttttt ctcctgtgct ttcttgttga 3000

ttggggttaa ctgtagtttc atgacaggtc tgagtttaac tgattttttc agtataaaag 3060

atcaatttct tctaaccagt aaccataaaa ccatttttaa ctgagagaaa tgcattgtac 3120

caatgttaca actgctaatt cttgattttg gaaggtggtg tgagtatgtt tttgtgtcct 3180

gcatgaactg atggttaggt taagtgcaat atgattctcc tgtcgattct ctccaactat 3240

tatgaaatgc tgttgtgtat gatcttgcag gtccttggct ggtaatagga tttccggtgg 3300

cataccagag caatttggta atctttctag tttgacaagc ttagatttag aagacaacct 3360

tttggtggga gaaataccag cttctcttgg ccagctttct aagctccagt tgttgtaagt 3420

atatctgcat ttcatcattc tcttcttttg gtgcatacaa tcaaaatgat tcatcatttt 3480

tcatgctttc tgtccttttt gtcacctgac caggatactt agtgataata atttcaatgg 3540

atcaattcct gacagtctag caaaaatctc aagcttgact gacatgtaag agtatacatc 3600

ttggctaagt atgatctctt ttttaaaatt tctgtttctg ctaacactag ttcatcttcc 3660

atttgttgac aaacaacttt ttttttatgg cagccggctg gcgtacaata atctgtctgg 3720

tcagatacct ggtccgttat tccaagtagc acgttacaag tatgtcaaga tctctctaaa 3780

aacagtttaa tccaattttt tttaaaaacc tgagtgactg atgaaggttc aattttcatg 3840

aatagctttt ctggtaatca cttaaattgt ggaaccaact tcccccactc ttgctcaacc 3900

aacatgtcct accagagtag gttaaatcct cattagttta tttatatatt tactgatacg 3960

gagtttgtct cctagaaaag atgtcacctt ataattctgt actatttctt aattgttcta 4020

gaatttttca tattacaggt ggatcccata gctcaaaaat tggcatagta cttggaacag 4080

ttggaggagt aataggactt ctcattgtag ctgctctctt tctgttctgt aaagggagga 4140

ggaaaagcca tctgcgggaa gtttttgtgg atgtagcagg tatttgtttt catgttcttg 4200

tagttgattt gtttttagta cctgcatcta tcatcagttt ttgtggttgt ggcaggttac 4260

ttcttttgtg gctttgtggt taggtttatt agttcctgca taattatttc tcttgctaat 4320

gtctcctggt tacacaaatg ctacatgttc ttgtgtaaat tgtaacttat ccgcatgatc 4380

aaagccgatg atcgtaagct atgtcctcaa tcaaccaaaa caagcaggtg cacctatttg 4440

tgacctcagt ttgataagtg tgtgatttat gccttaatct ttttttctaa atagaacatg 4500

tgaaggtatc tctgtgattt atacctagct tcatgtttgc ttgacagtgt gcattgaatg 4560

aagtaatgta aaaaaattgt gattcacagg tgaggatgat cgacgaattg catttggcca 4620

gctcaagaga tttgcatggc gagaactaca aatcgcgacg gataatttca gtgaaagaaa 4680

tgttctcggg cagggaggtt ttggtaaagt ttacaaaggt gttcttccag atggtactaa 4740

gattgctgta aaacgattga ctgattatga aagtcctggt ggtgaggccg ccttcttgcg 4800

tgaggtggag ctgattagtg ttgcagttca ccgcaatctt ctaaaattga ttggcttctg 4860

cacaacacaa acagagcgcc tcctggtata tccattcatg cagaatttga gtgttgccta 4920

ccgattgcga ggtatcaata tcgtacttct ccatccctaa tgccctattg ccttataaag 4980

tttgcttaaa tgtgctgcta ttattatttg gagtatctgt gaacagaatt ttgtcatttg 5040

cttaatttac ggttacagat ggtgggcatt gagtttttca gtttaatatt ttaaataaac 5100

ctcaagtcat gcactcatgt ggttgatttg tattttctat agacttgaaa attgataaaa 5160

ttaatttaac ctttatagtt atttggtgtg agcttcatgg catattgttt gttgtgttga 5220

aatcgatgca gattttaagc ctggagaacc tgtcttaaac tggccagaaa gaaaacgggt 5280

ggccattggt acagcacgtg gactagaata tctgcatgaa cactgcaacc caaagatcat 5340

acaccgtgat gtcaaagcgg cgaatgtctt gcttgatgag gactttgaac ctgttgttgg 5400

tgattttgga ctagcgaagc tagtggatgt gcagaagaca tctgtcacta ctcaagtccg 5460

tggaacaatg ggtcacatag cacctgaata tctatccaca gggaagtcat cagagagaac 5520

tgatgttttt ggctacggga tcatgcttct tgagcttgtg actggccagc gtgccattga 5580

cttctcacgc ttggaggaag aggacgatgt tctattgctc gatcatgtaa ggcttattta 5640

ctctaccact attaaccact ctaccatgtt ccttgggaaa ttttggaaac tgtgtcctta 5700

catggtgctt gttctccttt taggtaaaga agctacaaag agaagggcag ctaggatcca 5760

ttgtggaccg caacctgaac cagaattatg acgacgagga agttgagatg atgatacaga 5820

tagcattgct gtgcacacag tcatcgcccg aggatcggcc atccatgtca gaggtggttc 5880

ggatgctaga aggcgagggg ctggcggagc ggtgggagga gtggcagcag gtggaggtga 5940

caaggaggca ggagtacgag cggatgcagc ggcggttcga ctggggagag gactctgtct 6000

acaaccagga agcaatagag ttgtctggag gtagatgaca agggccgtga caacagacat 6060

caaacaaacg gcgtaagccg aatctgtact ttttctgtaa tggatgtagc gttgttcttt 6120

gtagagtaga tagaattgtc ctggaacaac agcgtaagcg atagctggta aatgatacaa 6180

tcggatggat aatgatatga tagaaaaata aagttgtatg tgtttggttg ggcatggctg 6240

aaccttagca gttgtgtgct ccccatgcac tgttatcaaa tcggccgatt agtcgtaaag 6300

tcggtcaaat tagttgacta aagagccatg actctgacca aattagtcgt aaagtcggtt 6360

gtaaattagt cgtgattatt gtagcaaatc accaattcac cgtgctaatt ggcttattgt 6420

gtttagtact ttagtttta 6439

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CC-TMS10-1F

<400> 2

tggcgtggca atcagctttc ggat 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CC-TMS10-1R

<400> 3

aaacatccga aagctgattg ccac 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TMS10-F

<400> 4

agaggagtga aagttgagtt gg 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TMS10-R

<400> 5

cagcacaaac ttgttggaat ta 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> M13F

<400> 6

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

Claims

1.一种水稻雄性不育基因TMS10的定点敲除系统，其特征在于，所述定点敲除系统包括CRISPR/Cas9系统，以及sgRNA靶点；所述sgRNA靶点为水稻雄性不育基因TMS10中含有PAM或NGG的序列。

2.根据权利要求1所述的定点敲除系统，其特征在于，所述定点敲除系统由CC-TMS10-1组成；

所述CC-TMS10-1为特异性修饰水稻雄性不育基因TMS10内靶序列的CH-CRISPR/Cas9系统；所述靶序列为位于SEQ ID NO.1所示序列的第2281位至第2299位的核酸序列；所述靶序列的长度为19bp。

3.根据权利要求2所述的定点敲除系统，其特征在于，所述CC-TMS10-1由SEQ IDNO.1所示序列的第2281位至第2299位所示核苷酸序列组成。

4.一种含有如权利要求1～3中任一项所述的定点敲除系统的编码基因的表达盒、重组菌或重组细胞系。

5.一种含有如权利要求1～3中任一项所述的定点敲除系统的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为重组表达载体CC-TMS10-1；

所述重组表达载体CC-TMS10-1为在载体pCAMBI1300的CAMV35S启动子下游插入CC-TMS10-1入门载体；

所述CC-TMS10-1入门载体是将载体18T-Cas9-chimeric-Os中BbsI位点间的片段替换为所述靶序列的重组载体。

6.一种水稻温敏雄性不育基因TMS10定点敲除的不育株系创制方法，其特征在于，所述方法包括：

常规水稻品种选择：在水稻中筛选如权利要求1～3中任一项所述的定点敲除系统在所述水稻品种中表达的步骤；

CC-TMS10-1在水稻的表达，转化植株筛选，突变植株鉴定，即得所述水稻温敏雄性不育基因TMS10定点敲除的不育株系。

7.根据权利要求6所述的不育株系创制方法，其特征在于，所述水稻品种包括粳稻品种、籼稻品种；所述粳稻品种包括9522、N6B、KY131；所述籼稻品种包括明辉63、珍汕97。

8.根据权利要求6所述的不育株系创制方法，其特征在于，所述CC-TMS10-1在水稻的表达是通过重组表达载体CC-TMS10-1将编码所述CC-TMS10-1的靶序列导入所述水稻中实现的。

9.根据权利要求6所述的不育株系创制方法，其特征在于，所述转化植株筛选是通过CRISPR/Cas9系统载体的通用引物M13F和CC-TMS10-1靶序列R引物的聚合酶链式反应扩增实现的；所述通用引物M13F的序列如SEQ ID NO.6所示，所述CC-TMS10-1靶序列R引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

10.根据权利要求6所述的不育株系创制方法，其特征在于，所述突变植株鉴定是通过TMS10基因的特异性引物扩增TMS10基因的基因组片段，然后进行测序及与TMS10野生型序列比对实现的；所述特异性引物为如SEQ ID NO.4所示的TMS10-F和如SEQ ID NO.5所示的TMS10-R。

11.根据权利要求6～10中任一项所述的不育株系创制方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9技术使水稻品种中如SEQ ID NO.1所示序列第2281位至第2299位发生插入或缺失，进而获得水稻雄性不育株系。

12.根据权利要求1～3中任一项所述的定点敲除系统及权利要求8～11中所述方法在创制水稻雄性不育株系中的应用。