CN113711906A - 一种抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，属于甘蓝育种技术领域。该方法选择综合性状优良的甘蓝CMS不育系/保持系分别与综合性状优良的甘蓝可育株杂交，再分别从其杂交后代中采用离体组织培养，重组筛选球形相近、熟期相近、颜色相近综合性状优良的不育株与相近的可育株回交3代，可育株自交一代后株间交，培育出新的不同熟性，球形，颜色综合性状优良的CMS不育系/保持系，以及其它新的优良可育株。通过愈伤组织原生质体改良培养，提高原生质体再生植株发生频率，剔除嵌合体，多倍体，保留优良的可育株，创制更多更好的新种质资源。

Description

一种抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法
技术领域
本发明属于甘蓝育种技术领域，具体涉及一种抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法。
背景技术
结球甘蓝(Brassica oleacea L.var.capitata L.)是十字花科芸薹属植物的一个变种，又名卷心菜、包菜等，起源于地中海沿岸，性喜温和气候，是中国主要的蔬菜作物之一，16世纪开始传入中国。结球甘蓝(以下简称甘蓝)具有抗病、适应性强、易贮耐运、产量高、品质好等特点，在我国各地普遍栽培，发展很快，是我国东北、西北、华北等地区春、夏、秋冬季的主要蔬菜之一，每年种植面积300万hm2以上，在蔬菜周年供应及出口贸易中都占有重要地位。
目前国内甘蓝种子仍需从国外进口，种子价格昂贵，由于甘蓝有较强的杂种优势，生产上主要利用自交不亲和系和细胞质雄性不育系(CMS不育系)配制杂交种。但利用自交不亲和系制种要花费大量的人力和时间进行亲本繁殖(通过人工蕾期授粉)，成本很高，推广面积受制种量制约。更不利的是亲本长期连续自交易生活力退化，使一些优良的性状丢失，杂交率很难达到100％，而利用细胞质雄性不育系(CMS不育系)配制甘蓝优良品种时杂交率达到100％，不需要恢复系，只需要父本系。
甘蓝优良品种是提高农产品产量、改善品质、提高市场竞争力的基础。创制种质资源是培育优良新品种基础中的基础。随着基因组学和生物信息学的迅猛发展，正在促使植物育种方法发生重大变革。通过甘蓝的真叶、胚轴及愈伤组织等原生质体培养创造具有重大应用价值的种质资源，培育高产优质多抗高效甘蓝新品种，对打破外国垄断，推广自主知识产权品种，确保我国粮食安全、生态安全和促进农民增收具有重大战略意义。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明要解决的技术问题在于提供一种抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，通过愈伤组织原生质体改良培养，提高原生质体再生植株发生频率，剔除嵌合体，多倍体，保留优良的可育株，创制更多更好的新种质资源。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，综合性状优良的甘蓝CMS不育系/保持系分别与综合性状优良的甘蓝可育株杂交，再分别从其杂交后代中采用离体组织培养，重组筛选球形相近、熟期相近、颜色相近综合性状优良的不育株与相近的可育株回交3代，可育株自交一代后株间交，培育出新的不同熟性，球形，颜色综合性状优良的CMS不育系/保持系，以及其它新的优良可育株。具体包括以下步骤：
(1)愈伤组织培养
通过综合性状优良的甘蓝成对CMS不育系/保持系单株与综合性状优良的甘蓝可育株杂交，分别得到CMS不育系F1/保持系F1；选择CMS不育系F1后代和保持系F1后代优良单株的叶球剖面进行愈伤组织培养，得到锥形愈伤组织；CMS不育系和可育系愈伤组织培养，方法同上，分开培养；
(2)增殖培养
将锥形愈伤组织消毒处理后切取15-20g，横切成0.5～1.5mm长的切片，先后进行质壁分离和酶解处理；酶解完成后，将原生质体酶混合液经70-80μm尼龙膜过滤，除去酶解杂质，以1200r/min的离心速度离心4min收集原生质体；收集的原生质体以不同梯度浓度的蔗糖液漂浮并离心，根据原生质体层所处的位置挑选漂浮液适宜的蔗糖浓度，收集原生质体条带；纯化后的原生质体以血球计数板统计产量，以台盼蓝染色测定原生质体活力，以去壁彻底的原生质体频率计算“完全去壁率”；其中原生质体呈球形，质膜薄而光滑的计为去壁彻底者； CMS不育系和可育系叶球剖面诱导的锥形愈伤组织增殖培养，方法同上，分开培养；
(3)原生质体培养
将纯净的原生质体密度调节为每毫升1.5×105个，并用原生质体培养基对原生质体进行液体浅层培养；原生质体培养12d后，每隔5d向每培养皿分别加入400μl渗透压降压培养基，培养到第5周，开始有肉眼可见的微愈伤出现，将培养皿移入弱光下生长；微愈伤增长至一定数量时，陆续将其从液体培养基中移至增殖培养基中；CMS不育系和可育系原生质体培养，方法同上，分开处理；
(4)芽的诱导
将转绿的愈伤颗粒转移到芽分化培养基中进行诱导芽的分化；CMS不育系和可育系愈伤颗粒培育，方法同上，分开处理；
(5)根的诱导
取生长状态良好的再生绿芽，按照每瓶接种3-4个的接种量接种于体积为60-70ml生根培养基上进行生根培养；CMS不育系和可育系再生绿芽培育，方法同上，分开培养；
(6)再生苗的移植
2周后生根，获得完整的再生植株；再生植株经驯化炼苗后移入营养钵中，置于温室中炼苗，炼苗条件为:温度20-25℃，3天后将组培瓶的瓶塞打开，7天后取出，洗去根部琼脂，将其栽植于培养介质中，湿度为80％-90％，温度20℃-23℃，20天后定植移栽到大花钵中让其充分生长；CMS不育系和可育系再生苗培育方法同上，分开移植；
(7)再生植株倍性检测
剔除嵌合体，多倍体，只保留优良的植株；CMS不育系和可育系再生植株，倍性检测方法同上，分开检测；
CMS不育系和可育系相近植株筛选原则：对优良的CMS不育系和可育系再生植株根据株型，子叶颜色，下胚轴颜色，外叶颜色，外叶形状，叶球形状，叶球颜色、叶球熟性较近的CMS不育系和可育系植株1:1配对，不育株作母本，可育株作父本，成对回交3代，不育株作CMS不育系，可育株自交1代后株间交保存作保持系，从而形成N组新CMS不育系和保持系。
所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，选择CMS不育系F1后代和保持系F1后代优良单株，叶球紧实时，切割叶球，切口平，再沿叶球顶部中心位置竖切，呈1/2半球状，叶球、切口处洗净，先用质量百分比为70％的酒精浸泡30s，再用0.1％HgCl2消毒1min，然后无菌水冲洗3-4次，得到消毒后的叶球剖面，用于愈伤组织培养。
所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，MS培养基，以1L计，组成为：NH4HO31650mg，KNO3 1900mg，CaCl2·2H2O 440mg，KH2PO4 170mg，MgSO4·7H2O 370mg，FeSO4·7H2O27.8mg，Na2EDTA 37.3mg，H3BO3 6.2mg，MnSO4·H2O 16.9mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg， Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，KI 0.83mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，维生素B1 0.1mg，维生素B6 0.5mg和余量的无菌水。
所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，愈伤组织培养基为MS+25mg/L蔗糖+琼脂 7mg/L，pH为5.9；愈伤组织培养条件为：光照培养室中进行暗培养，培养温度22-24℃，光照强度1500Lx，光照时间18小时/天，培养湿度75％-80％，培养周期7-10天，待愈伤组织 5-10mm时，调节温度24-26℃，光照强度2500Lx，光照时间20小时/天，保持空气湿度80％，再培养2-3天，长出更多优良粗壮的锥形愈伤组织。
所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，步骤(2)愈伤组织消毒处理：挑选粗壮的锥形愈伤组织用75％乙醇浸泡杀菌0.5min，再用0.1％HgCl2消毒2min，除去后用无菌水冲洗4 次；质壁分离处理：将切片置于含13％甘露醇的CPW溶液中使材料质壁分离1h，除去CPW-13 溶液；所述酶解处理时加入混合酶液，混合酶液为2.5％纤维素酶和0.08％果胶酶的酶液组合物，用量为5mL，26～27℃恒温震荡培养箱中黑暗低速震荡酶解，震荡速度75～80r/mi。
所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，所述原生质体培养基为B5培养基+0.25mg/L NAA+0.6mg/L 2,4-D+0.3mg/L 6-BA；所述B5培养基，以1L计，组成为：NaH2PO4·2H2O 195mg，KNO3 3000mg，NH4NO3 150mg，MgSO4·7H2O 6000mg，MnSO4·4H2O 15mg，H3BO34mg，ZnSO4·7H2O 3mg，KI 0.75mg，Na2MoO4·2H2O 0.2mg，CuSO4·5H2O 0.02mg，CoCl2·6H2O0.03mg，Na2EDTA 35.5mg，FeSO4·7H2O 25.5mg，CaCl2·2H2O 1000mg，VB1 10mg，VB6 2mg，VPP 2mg，肌醇110mg和余量的蒸馏水。
所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，所述增殖培养基为MS+0.035mg/L NAA+0.035mg/L 2,4-D+0.2mg/L 6-BA；芽分化培养基为MS+3mg/L 6-BA+0.15mg/L ZT+0.2mg/LNAA。
所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，所述生根培养培养基的组成为：1/2MS+IBA 0.3mg/L，蔗糖20g/L，琼脂6g/L，pH值5.8；生根培养的培养条件为：温度24-26℃，光照强度2200-2500Lx，光照时间15小时/天，培养湿度75％-80％。
有益效果：与现有的技术相比，本发明的优点包括：
(1)本发明通过利用植株长势中、中熟、扁圆球形、颜色浅绿、抗逆性强、品质好等性状的一组甘蓝细胞质雄性不育系(CMS不育系)及其保持系单株分别与另一个植株长势强、抗霜霉病、牛心形、颜色鲜绿、抗逆性强的甘蓝可育株杂交得到F1(CMS不育、可育)，高效扩大种质资源的遗传背景；F1(CMS不育、可育)后代筛选优良单株，在其叶球紧实时割球并纵剖后组织培养形成愈伤组织，通过愈伤组织原生质体改良培养，提高原生质体再生植株发生频率，剔除嵌合体，多倍体，保留优良的可育株，创制更多更好的新种质资源。
(2)依次鉴定筛选优良相似成对单株F1(CMS不育、可育)分别以1、2……N标记，相对的1、2……N成对CMS不育株与可育株回交3代，可育株自交1代后株间交保存，从而形成N组新CMS不育系/保持系，创制新种质资源效率高。扩大群体遗传范围，加快甘蓝育种进程，较常规利用保持系与CMS不育系先杂交，再回交转育6-7代培育新的CMS不育系相比，时间缩短一半，效率提高1倍以上，不仅省工节本，大大缩短育种时间，而且还可将原品种的杂种优势保留到新的杂交品种中，具有可复制，操作性强的特点。新的N组不育系的创制，利于配制杂交新组合，杂交率达到100％，而且能有效保护新品种，不会发生因自交不亲和系配制杂交种可能导致亲本流失，有利于加强新品种知识产权的保护，而且克服了因自交不亲和系配制杂交种带来的纯度不高的缺点，大大提升了新材料的创制效率，具有极高的应用价值的特点。常规方法是结合小孢子培养，较之前回交转育缩短一半时间，且产生更多新种质。
(3)叶球营养丰富，经洗净、消毒灭菌，叶球剖面培养愈伤组织，再以愈伤组织原生质体为试材，进行原生质体诱导培育幼苗，其质量优，增殖系数高，较腋芽、上胚轴取材广泛；而且叶球剖面培养的愈伤组织生长环境相同，同一区段的组织结构幼嫩一致，便于消毒，灭菌容易；新生愈伤组织细胞再生能力强，生命力旺盛，便于对原生质体分离、培养、植株再生诱导成功率大大提高。
附图说明
图1为育种图谱1；
图2为育种图谱2。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1
一种抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，包括以下步骤：
第一年春季4月中旬，利用晚熟、结球紧、外叶颜色深绿色、叶球颜色深绿色、叶球扁圆形、中心柱长度中、耐寒、耐裂球、抗黑腐病、品质好等综合性状优良的一组或多组甘蓝细胞质雄性不育系CMS0801与保持系0801的单株分别与另一个晚熟、植株高度中、开展度中、外叶数少、叶片长宽度中、外叶叶色深绿色、叶球颜色绿色、叶球高度高、叶球结球紧、牛心形、中心柱长度中、耐寒、抗病毒病、品质好等综合性状优良的甘蓝自交系0912的单株杂交得到F1(CMS不育，可育)，扩大遗传背景，6月中旬CMS0801(不育)单株收获F1 种子230粒，保持系0801(可育)单株收获F1种子245粒。
8月中旬(CMS0801(F1)不育)播种210粒，(0801(F1)可育)播种220粒。11月中旬(CMS0801(F1)不育)田间筛选优良单株，待叶球紧实时割球3个，切口平，再沿叶球顶部中心位置竖切，呈1/2半球状，叶球、切口处洗净，先用质量百分比为70％的酒精浸泡30秒，再用0.1％HgCl2消毒1min，然后无菌水冲洗3-4次。(0801(F1)可育)田间筛选优良单株，待叶球紧实时割球3个，方法同上，分开处理。
(1)愈伤组织培养
将上述消毒后的叶球剖面(CMS0801(F1)不育)置放于MS(25mg/L蔗糖、琼脂7mg/L,pH 为5.9)培养基，光照培养室中进行暗培养，培养温度22℃-24℃，光照强度1500Lx，光照时间18小时/天，培养湿度75％-80％，培养周期7-10天，观察切口锥形愈伤组织的数量，待愈伤组织5-10mm时，调节温度24-26℃，光照强度2500Lx，光照时间20小时/天，保持空气湿度80％左右，再培养2-3天，以利于长出更多优良粗壮的锥形愈伤组织。上述消毒后的叶球剖面(0801(F1)可育)愈伤组织培养，方法同上，分开培养。
所述的MS培养基，以1L计，组成为：NH4HO3 1650mg，KNO3 1900mg，CaCl2·2H2O440mg，KH2PO4 170mg，MgSO4·7H2O 370mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2EDTA37.3mg，H3BO36.2mg，MnSO4·H2O 16.9mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，KI 0.83mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，维生素 B10.1mg，维生素B6 0.5mg和余量的无菌水。
(2)增殖培养
11下旬，将上述(CMS0801(F1)不育)叶球剖面诱导的锥形愈伤组织切取，挑选粗壮的锥形愈伤组织用75％乙醇浸泡杀菌0.5min，再用0.1％HgCl2消毒2min，除去后用无菌水冲洗4次，取愈伤组织15-20g。将材料横切成约1mm长的切片。置于含13％甘露醇的CPW溶液中使材料质壁分离1h，除去CPW-13溶液，加入5mL混合酶液(以2.5％纤维素酶+0.08％果胶酶的酶液组合)，27℃恒温震荡培养箱中黑暗低速震荡酶解，震荡速度约80r/min，20min。酶解完成后，将原生质体酶混合液经70-80μm尼龙膜过滤，除去酶解杂质，通过低速离心方法收集原生质体，离心速度为1200r/min，离心4min。收集的原生质体以15mg/L、25mg/l、35mg/L不同梯度浓度的蔗糖液漂浮并离心，根据原生质体层所处的位置挑选漂浮液适宜的蔗糖浓度25mg/l，收集原生质体条带。上述收集的纯化后的原生质体以血球计数板统计产量，以台盼蓝染色测定原生质体活力，以去壁彻底的原生质体频率计算“完全去壁率”(原生质体呈球形，质膜薄而光滑的计为去壁彻底者)。将上述(0801(F1)可育)叶球剖面诱导的锥形愈伤组织增殖培养，方法同上，分开培养。
(3)原生质体培养
11月底，将纯净的原生质体密度调节为每毫升1.5×105个，并用B5培养基对原生质体进行液体浅层培养，将CaCl2·2H2O，KNO3分别增加到1000mg/L和3000mg/L NH4NO3含量降低到150mgL；上述培养基均附加0.25mg/L NAA+0.6mg/L 2,4-D+0.3mg/L 6-BA。12月上旬，原生质体培养12d后，每隔5d向每培养皿分别加入400μl渗透压降压培养基，培养到第5周，至第二年1月中下旬，开始有肉眼可见的微愈伤出现，将培养皿移入弱光下生长。微愈伤增长至1.5×102个/ml时，陆续将其从液体培养基中移至增殖培养基中(MS+0.035mg/L NAA+0.035mg/L 2,4-D+0.2mg/L 6-BA)。2月中下旬记录培养基中原生质体培养35d后的分裂频率和45d后的植板率。在Nikon荧光倒置显微镜200倍视野内统计分裂频率。(CMS0801 (F1)不育、0801(F1)可育)原生质体培养，方法同上，分开处理。
所述的B5培养基，以1L计，组成为：NaH2PO4·2H2O 195mg，KNO3 3000mg，(NH4)2SO4150mg，MgSO4·7H2O 6000mg，MnSO4·4H2O 15mg，H3BO3 4mg，ZnSO4·7H2O 3mg，KI 0.75mg，Na2MoO4·2H2O 0.2mg，CuSO4·5H2O 0.02mg，CoCl2·6H2O 0.03mg，Na2EDTA35.5mg， FeSO4·7H2O 25.5mg，CaCl2·2H2O 1000mg，VB1 10mg，VB6 2mg，VPP 2mg，肌醇110mg和余量的蒸馏水。
原生质体分裂频率(％)＝视野内分裂细胞数/视野内细胞总数×100％
植板率(％)＝每皿内形成的细胞团数/每皿内培养的原生质体总数×100％
(4)芽的诱导
3月初，将转绿的愈伤颗粒转移到芽分化培养基中上述的MS+3mg/L 6-BA+0.15mg/L ZT+0.2mg/L NAA诱导芽的分化。(CMS0801(F1)不育、0801(F1)可育)愈伤颗粒，方法同上，分开处理。
(5)根的诱导
3月中旬，取生长状态良好的再生绿芽，按照每瓶接种3-4个的接种量接种于体积为 60-70ml生根培养基上进行生根培养，14天后观察生根情况；生根培养培养基的组成为:1/2MS+IBA 0.3mg/L，蔗糖20g/L，琼脂6g/L，pH值5.8；生根培养的培养条件为：温度 24-26℃，光照强度2200-2500Lx，光照时间15小时/天，培养湿度75％-80％；(CMS0801(F1) 不育、0801(F1)可育)再生绿芽，方法同上，分开培养。
(6)再生苗的移植
4月中旬生根，获得完整的再生植株。再生植株经驯化炼苗后移入营养钵中，置于温室中炼苗，炼苗条件为：温度20-25℃，3天后将组培瓶的瓶塞打开，7天后取出，洗去根部琼脂，将其栽植于培养介质中，湿度为80％-90％，温度20-23℃，5月上旬后定植移栽到大花钵中让其充分生长。(CMS0801(F1)不育)再生苗320株，(0801(F1)可育)再生苗335株。方法同上，分开移植。
(7)再生植株倍性检测
6月上旬，采集PARTEC PA流式细胞仪分析倍性的方法，对所获得的再生植株进行倍性鉴定标记。剔除嵌全体，多倍体，只保留优良的植株。(CMS0801(F1)不育)再生植株，(0801 (F1)可育)再生植株倍性检测方法同上，分开检测。经检测，(CMS0801(F1)不育)共获得再生优良的植株105株并标记，(0801(F1)可育)共获得再生优良的植株112株并标记。 7月下旬，对上述已标记的优良的植株(CMS0801(F1)不育、0801(F1)可育)，从大花钵中移出定植在大田中让其充分生长。
10月上旬，从(CMS0801(F1)不育)与(0801(F1)可育)已标记的再生植株中筛选成对不育株、可育株相近似植株并编号，并从大田里挖出相邻定植在简易棚中，并与其它的成对编号的相近似不育株、可育株植株相互隔离。筛选原则：根据株型，子叶颜色，下胚轴颜色，外叶颜色，外叶形状，叶球形状，叶球颜色、叶球熟性相近似植株，从(CMS0801(F1) 不育)获得再生优良的植株105株中筛选的植株按CMS01、CMS02、CMS03、CMS04…… CMS038编号；从(0801(F1)可育)获得再生优良的植株112株中筛选的植株按01、02、 03、04……38编号；(不育：可育)1:1成对。次年4月开花期田间观察筛选成对植株，选留生长势强，雄蕊退化，雌蕊正常，柱头直立，不弯曲，花瓣大，颜色浓黄，蜜腺大，花蜜多的不育株作母本，不合格的淘汰；选留生长势强，花蕾发育正常，蜜腺发达，柱头发育良好，雄蕊发达的成对可育株作父本，不合格的淘汰。
最终鉴定筛选后得到CMS01、01；CMS06、06；CMS07、07；CMS10、10；CMS12、12；CMS16、16；CMS19、19；CMS22、22；CMS27、27；CMS31、31；CMS34、34；CMS36、 36共12组成对的优良不育株、可育株。(不育，可育)1:1配对，不育株作母本，可育株作父本，成对回交3代，不育株作CMS不育系，可育株自交1代后株间交保存作保持系，CMS 不育系与保持系性状稳定一致，即为新的CMS不育系和保持系。
其中CMS01、01；CMS07、07；CMS12、12；CMS27、27；CMS34、34；属于晚熟、高扁圆、耐寒、抗病、优质、适应性强的CMS不育系和保持系；其中CMS19、19；CMS31、 31；CMS36、36属于晚熟、扁圆、耐寒、抗病、优质、适应性强的CMS不育系和保持系；其中CMS06、06；CMS10、10；CMS16、16；CMS22、22属于晚熟、牛心形、耐寒、抗病、优质、适应性强的CMS不育系和保持系。
另外(0801F1)未成对的优良的单株有：44、48、55、60、67、69、72、75、83、88、 91、92、95、103、107、109共16株，其中44、60、72、88、92、109属于晚熟、高扁圆、耐寒、抗病、优质、适应性强植株；其中48、55、69、83、107属于晚熟、扁圆、耐寒、抗病、优质、适应性强的植株；其中67、75、91、95、103属于晚熟、牛心形、耐寒、抗病、优质、适应性强的植株，分别自交1代后株间交保存作新的亲本，可与其它亲本试配新组合。
表1新方法下甘蓝优良CMS不育系回交转育形态变异趋向
回交转育 回交代数 形态变异趋向 变异程度(％) 不育株率(％) 不育度(％)
CMS01 BC3 01 98 100 100
CMS07 BC3 07 98.5 100 100
CMS12 BC3 12 97.5 100 100
CMS27 BC3 27 99 100 100
CMS34 BC3 34 98 100 100
CMS19 BC3 19 97.5 100 100
CMS31 BC3 31 97 100 100
CMS36 BC3 36 98 100 100
CMS06 BC3 06 98 100 100
CMS10 BC3 10 99 100 100
CMS16 BC3 16 97.5 100 100
CMS22 BC3 22 97 100 100
表2传统方法下(育种图谱2)甘蓝优良CMS不育系回交转育形态变异趋向比较(以瑞甘17为例，鉴定编号：国品鉴菜2015039)
Figure BDA0003175249340000081
Figure BDA0003175249340000091
表3甘蓝优良CMS不育系性状
Figure BDA0003175249340000092
表4甘蓝优良成对CMS不育系/保持系性状
Figure BDA0003175249340000093
Figure BDA0003175249340000101
表5甘蓝其它优良可育株性状
Figure BDA0003175249340000102
育种图谱1：(见图1)
育种图谱2：甘蓝瑞甘17选育图谱(见图2)
抗病优质等综合性状优良的甘蓝CMS不育系/保持系分别与综合性状优良的甘蓝可育株杂交，再分别从其杂交后代中采用离体组织培养，重组筛选球形相近，熟期相近，颜色相近等综合性状优良的不育株与相近的可育株(保持系)回交3代，保持系自交一代后株间交，培育出新的不同熟性，球形，颜色等综合性状优良的CMS不育系/保持系，以及其它新的优良可育株，扩大群体遗传范围，加快甘蓝育种进程，较常规利用保持系与CMS不育系先杂交，再回交转育6-7代培育新的CMS不育系相比，时间缩短一半，效率提高1倍以上，不仅省工节本，大大缩短育种时间，而且还可将原品种的杂种优势保留到新的杂交品种中，具有可复制，操作性强的特点。
新的N组不育系的创制，利于配制杂交新组合，杂交率达到100％，而且能有效保护新品种，不会发生因自交不亲和系配制杂交种可能导致亲本流失，有利于加强新品种知识产权的保护，而且克服了因自交不亲和系配制杂交种带来的纯度不高的缺点，大大提升了新材料的创制效率，具有极高的应用价值的特点。

Claims (9)

1.一种抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，其特征在于，选择综合性状优良的甘蓝CMS不育系/保持系分别与综合性状优良的甘蓝可育株杂交，再分别从其杂交后代中采用离体组织培养，重组筛选球形相近、熟期相近、颜色相近综合性状优良的不育株与相近的可育株回交3代，可育株自交一代后株间交，培育出新的不同熟性，球形，颜色综合性状优良的CMS不育系/保持系，以及其它新的优良可育株。
2.根据权利要求1所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)愈伤组织培养
通过综合性状优良的甘蓝成对CMS不育系/保持系单株与综合性状优良的甘蓝可育株杂交，分别得到CMS不育系F1/保持系F1；选择CMS不育系F1后代和保持系F1后代优良单株的叶球剖面进行愈伤组织培养，得到锥形愈伤组织；CMS不育系和可育系愈伤组织培养，方法同上，分开培养；
(2)增殖培养
将锥形愈伤组织消毒处理后切取15-20g，横切成0.5～1.5mm长的切片，先后进行质壁分离和酶解处理；酶解完成后，将原生质体酶混合液经70-80μm尼龙膜过滤，除去酶解杂质，以1200r/min的离心速度离心4min收集原生质体；收集的原生质体以不同梯度浓度的蔗糖液漂浮并离心，根据原生质体层所处的位置挑选漂浮液适宜的蔗糖浓度，收集原生质体条带；纯化后的原生质体以血球计数板统计产量，以台盼蓝染色测定原生质体活力，以去壁彻底的原生质体频率计算“完全去壁率”；其中原生质体呈球形，质膜薄而光滑的计为去壁彻底者；CMS不育系和可育系叶球剖面诱导的锥形愈伤组织增殖培养，方法同上，分开培养；
(3)原生质体培养
将纯净的原生质体密度调节为每毫升1.5×105个，并用原生质体培养基对原生质体进行液体浅层培养；原生质体培养12d后，每隔5d向每培养皿分别加入400μl渗透压降压培养基，培养到第5周，开始有肉眼可见的微愈伤出现，将培养皿移入弱光下生长；微愈伤增长至一定数量时，陆续将其从液体培养基中移至增殖培养基中；CMS不育系和可育系原生质体培养，方法同上，分开处理；
(4)芽的诱导
将转绿的愈伤颗粒转移到芽分化培养基中进行诱导芽的分化；CMS不育系和可育系愈伤颗粒培育，方法同上，分开处理；
(5)根的诱导
取生长状态良好的再生绿芽，按照每瓶接种3-4个的接种量接种于体积为60-70ml生根培养基上进行生根培养；CMS不育系和可育系再生绿芽培育，方法同上，分开培养；
(6)再生苗的移植
2周后生根，获得完整的再生植株；再生植株经驯化炼苗后移入营养钵中，置于温室中炼苗，炼苗条件为:温度20-25℃，3天后将组培瓶的瓶塞打开，7天后取出，洗去根部琼脂，将其栽植于培养介质中，湿度为80％-90％，温度20℃-23℃，20天后定植移栽到大花钵中让其充分生长；CMS不育系和可育系再生苗培育方法同上，分开移植；
(7)再生植株倍性检测
剔除嵌合体，多倍体，只保留优良的植株；CMS不育系和可育系再生植株，倍性检测方法同上，分开检测；
CMS不育系和可育系相近植株筛选原则：对优良的CMS不育系和可育系再生植株根据株型，子叶颜色，下胚轴颜色，外叶颜色，外叶形状，叶球形状，叶球颜色、叶球熟性较近的CMS不育系和可育系植株1:1配对，不育株作母本，可育株作父本，成对回交3代，不育株作CMS不育系，可育株自交1代后株间交保存作保持系，从而形成N组新CMS不育系和保持系。
3.根据权利要求2所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，其特征在于，选择CMS不育系F1后代和保持系F1后代优良单株，叶球紧实时，切割叶球，切口平，再沿叶球顶部中心位置竖切，呈1/2半球状，叶球、切口处洗净，先用质量百分比为70％的酒精浸泡30s，再用0.1％HgCl2消毒1min，然后无菌水冲洗3-4次，得到消毒后的叶球剖面，用于愈伤组织培养。
4.根据权利要求2所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，其特征在于，MS培养基，以1L计，组成为：NH4HO3 1650mg，KNO3 1900mg，CaCl2·2H2O 440mg，KH2PO4 170mg，MgSO4·7H2O 370mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2EDTA 37.3mg，H3BO3 6.2mg，MnSO4·H2O 16.9mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，KI 0.83mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，维生素B1 0.1mg，维生素B6 0.5mg和余量的无菌水。
5.根据权利要求4所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，其特征在于，愈伤组织培养基为MS+25mg/L蔗糖+琼脂7mg/L，pH为5.9；愈伤组织培养条件为：光照培养室中进行暗培养，培养温度22-24℃，光照强度1500Lx，光照时间18小时/天，培养湿度75％-80％，培养周期7-10天，待愈伤组织5-10mm时，调节温度24-26℃，光照强度2500Lx，光照时间20小时/天，保持空气湿度80％，再培养2-3天，长出更多优良粗壮的锥形愈伤组织。
6.根据权利要求2所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，其特征在于，步骤(2)愈伤组织消毒处理：挑选粗壮的锥形愈伤组织用75％乙醇浸泡杀菌0.5min，再用0.1％HgCl2消毒2min，除去后用无菌水冲洗4次；质壁分离处理：将切片置于含13％甘露醇的CPW溶液中使材料质壁分离1h，除去CPW-13溶液；所述酶解处理时加入混合酶液，混合酶液为2.5％纤维素酶和0.08％果胶酶的酶液组合物，用量为5mL，26～27℃恒温震荡培养箱中黑暗低速震荡酶解，震荡速度75～80r/mi。
7.根据权利要求4所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，其特征在于，所述原生质体培养基为B5培养基+0.25mg/L NAA+0.6mg/L 2,4-D+0.3mg/L 6-BA；所述B5培养基，以1L计，组成为：NaH2PO4·2H2O 195mg，KNO3 3000mg，NH4NO3 150mg，MgSO4·7H2O 6000mg，MnSO4·4H2O 15mg，H3BO3 4mg，ZnSO4·7H2O 3mg，KI 0.75mg，Na2MoO4·2H2O 0.2mg，CuSO4·5H2O 0.02mg，CoCl2·6H2O 0.03mg，Na2EDTA 35.5mg，FeSO4·7H2O 25.5mg，CaCl2·2H2O1000mg，VB1 10mg，VB6 2mg，VPP 2mg，肌醇110mg和余量的蒸馏水。
8.根据权利要求4所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，其特征在于，所述增殖培养基为MS+0.035mg/L NAA+0.035mg/L 2,4-D+0.2mg/L 6-BA；芽分化培养基为MS+3mg/L 6-BA+0.15mg/L ZT+0.2mg/L NAA。
9.根据权利要求4所述抗病优质结球甘蓝种质资源创制方法，其特征在于，所述生根培养培养基的组成为：1/2MS+IBA 0.3mg/L，蔗糖20g/L，琼脂6g/L，pH值5.8；生根培养的培养条件为：温度24-26℃，光照强度2200-2500Lx，光照时间15小时/天，培养湿度75％-80％。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114568298A (zh) * 2022-04-02 2022-06-03 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所 一种优质抗病结球甘蓝的选育及栽培方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1232608A (zh) * 1999-03-29 1999-10-27 南京农业大学 不结球白菜非对称细胞融合方法及其获得的再生植株
US6046383A (en) * 1995-09-11 2000-04-04 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Cytoplasmic male sterile Brassica oleracea plants which contain the polima CMS cytoplasm and are male sterile at high and low temperatures
CN101044838A (zh) * 2007-04-30 2007-10-03 中国农业科学院油料作物研究所 油菜异源细胞质雄性不育系选育的方法
CN101803564A (zh) * 2010-05-07 2010-08-18 镇江瑞繁农艺有限公司 一种利用细胞质雄性不育系配制杂交甘蓝的简化育种方法
CN111248083A (zh) * 2020-03-30 2020-06-09 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所 一种杂交青花菜的育种方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6046383A (en) * 1995-09-11 2000-04-04 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Cytoplasmic male sterile Brassica oleracea plants which contain the polima CMS cytoplasm and are male sterile at high and low temperatures
CN1232608A (zh) * 1999-03-29 1999-10-27 南京农业大学 不结球白菜非对称细胞融合方法及其获得的再生植株
CN101044838A (zh) * 2007-04-30 2007-10-03 中国农业科学院油料作物研究所 油菜异源细胞质雄性不育系选育的方法
CN101803564A (zh) * 2010-05-07 2010-08-18 镇江瑞繁农艺有限公司 一种利用细胞质雄性不育系配制杂交甘蓝的简化育种方法
CN111248083A (zh) * 2020-03-30 2020-06-09 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所 一种杂交青花菜的育种方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
方智远等: "甘蓝显性雄性不育的遗传及不育系的选育与利用研究", 《中国园艺学会会议论文集》 *
王晓佳等: "甘蓝CMS系的原生质体培养与植株再生", 《西南农业大学学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114568298A (zh) * 2022-04-02 2022-06-03 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所 一种优质抗病结球甘蓝的选育及栽培方法

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