CN105145337B - 一种油菜优异种质资源的培育方法 - Google Patents

Abstract

一种油菜优异种质资源的培育方法，包括以下步骤：(1)以甘蓝为砧木，以甘蓝型油菜为接穗，通过斜面插接的稼接方法获得F1群体变异种群；(2)从F1群体中筛选变异植株，自交获得F2群体子代变异源；(3)目标性状特异种质资源的获得：从F2的子代分离群体中筛选目标性状优良的单株，再经小孢子培养获得DH分离后代群体，从中筛选农艺性状特征、抗病抗逆性、生育期和含油量目标性状优良及特殊性状突出的材料，即油菜优异种质资源。本发明具有可操作性强，简单，无风险，不需要有性杂交和其他一些特殊处理，获得纯合稳定材料的时间短，且获得的变异类型丰富的特点。

Description

一种油菜优异种质资源的培育方法

技术领域

本发明涉及一种油菜优异种质资源的培育方法，具体涉及一种利用甘蓝型油菜与甘蓝稼接技术结合小孢子培养培育油菜优异种质资源的方法。

背景技术

油菜是我国重要的油料和经济作物之一，在国民经济尤其是在食用油的供给方面，地位显著，目前我国食用植物油需求量大，自给不足，供需矛盾十分突出，因此培育高产、优质、抗病适宜机械化生产的新品种是油菜育种的主要目标。而收集和创造具有广泛遗传基础的油菜种质资源材料是油菜新品种选育的前提和基础，可在育种实践中现有可以利用的优异种质资源十分有限。

为了拓展油菜种质资源的遗传基础，创造新的优异种质，通常采用常规种间杂交、物理诱变、化学诱变、太空诱变、基因转化等技术，尽管人们利用这些技术也已取得了不菲的业绩，创造出了不少可供利用的优异种质和品种。但常规种间杂交选育技术的杂交结实率低，甚至亲缘关系较远时往往不能正常结实，且后代优良变异基因难以固定；而物理、化学和太空诱变不但成本高，诱变因子与剂量难以控制，且后代群体会出现疯狂不定向分离，后代选育难度大，费工费时；而转基因技术尽管目标性强，但需要开展基因克隆、转化、筛选、鉴定等大量工作，不但成本高难度大，并且创造的资源难以释放。因此，研究一种简单易行，优良变异基因可以较快固定，且效率高、成本低的新技术，对广泛开展油菜种质的创新十分必要。

嫁接作为一种植物繁殖的方法，已被广泛应用，但嫁接能使植物种子后代产生变异的事实,虽在达尔文和米丘林的著作中有过许多描述，但至今却仍未引起人们的重视，早在达尔文之前的中国古代北魏时期《齐民要术》和明代《本草纲目》就有大量嫁接引起植物种子后代变异的记载。但到目前为止，对于稼接变异的产生和维持机制的研究还不够完善，特别是对于稼接变异遗传规律的分析甚少，至今仍未引起人们的重视，而且传统的劈接、靠接等稼接方法诱导遗传变异的频率较低，砧穗物种细胞和组织间的交流有限。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用甘蓝型油菜与甘蓝稼接引起的油菜种子后代变异，并结合利用小孢子培养技术快速纯合稳定变异目标性状，小孢子培养获得DH分离群体，以农艺性状特征、抗病抗逆性、生育期和含油量等主要性状经多点田间表型特征鉴定筛选培育油菜新种质的新方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种油菜优异种质资源的培育方法，包括以下步骤：

(1)F1群体变异种群的获得：以甘蓝为砧木，以甘蓝型油菜为接穗，通过斜面插接的稼接方法稼接，接穗成活后开花前套袋自交，获得F1群体变异种群；

(2)F2群体子代变异源的获得：从F1的子代分离群体中筛选变异植株，自交获得F2群体种子；

(3)目标性状特异种质资源的获得：从F2的子代分离群体中筛选目标性状优良的单株，再经小孢子培养获得DH分离群体后代中筛选农艺性状特征、抗病抗逆性、生育期和含油量目标性状优良及特殊性状突出的材料。

进一步，步骤(1)中，所述稼接方法为在3～4月份，选择与甘蓝型油菜抽薹期相近的甘蓝，在薹高20～30cm时期稼接；选择与薹直径相近的甘蓝和甘蓝型油菜，以甘蓝为砧木，甘蓝型油菜为稼接接穗，采用消毒的刀具把砧木甘蓝和接穗甘蓝型油菜薹茎在距下部10～15cm处平切掉，采用斜面插接的方法，将接穗和砧木的稼接面切成长2～3cm，斜度为45～50度的平滑斜面，在平行于斜面沿薹茎中线劈开长1.8～2.2cm，将接穗的内切斜面体插入砧木的内切中线中，对齐斜面，使两斜面充分紧密接触，然后用无菌封口膜封缠。

本发明以甘蓝为砧木，以甘蓝型油菜为接穗，通过稼接的方法获得接穗子代变异的群体，变异群体中目标性状优良单株用小孢子培养的方法获得的DH分离群体，并在后代中筛选农艺、抗逆性及含油量等目标性状优良及特殊性状突出的材料，最终获得纯合稳定油菜优异种质资源。该方法操作简便、取材广泛、无风险、成本低、不需要有性杂交和其他一些特殊处理，获得纯合稳定材料的时间短，且变异类型极其丰富等优势。

附图说明

图1为甘蓝做砧木，甘蓝型油菜为接穗的稼接体田间长势图。

图2用本方法获得的矮杆、多分支、抗倒性好的材料单株图。

图3用本方法获得的无花瓣材料花序图。

图4用本方法获得的深缺刻花叶单株图。

图5用本方法获得的白花性状植株花序图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步加以说明。

实施例1

1、F1群体变异种群的获得：结球甘蓝自交系MP02yyz-1在8月20号播种，甘蓝型油菜自交纯合系K407、加219和青油14在9月15号播种，并按相应的试验密度水平定植；次年3～4月份，选择和甘蓝型油菜抽薹期相近的甘蓝单株，在薹高20～30cm时期稼接，稼接时选取薹直径相近的甘蓝和甘蓝型油菜，以甘蓝为砧木，甘蓝型油菜为稼接接穗，用75％的酒精消毒处理刀具和手，把砧木甘蓝和接穗甘蓝型油菜薹茎在距下部10～15cm处平切掉，采用斜面插接的方法，将接穗和砧木的稼接面切成2cm长的斜度为45度的平滑斜面，在平行于斜面沿薹茎中线劈开2cm长，将接穗的内切斜面体插入砧木的内切中线中，对齐斜面，使两斜面充分紧密接触，然后用封口膜封缠；稼接完成后遮阴5～7天，并每天喷水保持一定的湿度，减少接穗因蒸腾作用失去的水分，利用该方法稼接成活率均在98％以上，稼接成活后加强后期管理，及时去除掉砧木甘蓝发的侧芽，以保障接穗充足的营养供给，为接穗获得变异种子提供充足的能量，接穗成活后形成新的花蕾，开花前套袋自交，见图1，获得F1种子在第二年播种。

2、F2群体子代变异源的获得：在F1代群体中出现变异，有两种表现型，一种为与接穗的表现型一致，另一种则与砧木相似的偏甘蓝类型，表现为叶色深蓝、叶子直立上挺，分枝多，角粒数少但角果数多，长势强，见表1，这一类型为后代群体主要的变异源，以此为标准3种甘蓝型油菜和甘蓝稼接变异率分别为10％、3.125％和20％。选择变异株自交，次年播种。

表1-稼接F1代变异株考种结果

3、目标性状特异种质资源的获得：F2群体子代中，变异类型则非常丰富，根据农艺性状大多数变异可分为3种类型，分别为白菜型、甘蓝型和甘蓝型油菜型，还有其他一些3种类型之间的中间类型和一些特异类型等。稳定纯合的目标性状特异种质资源的获得可以通过(稼接+常规系选)法和(稼接+小孢子培养)法，本发明先从F2的子代分离群体中筛选纯合目标性状，然后采用小孢子培养法：从F2的子代分离群体中筛选目标性状优良的单株在油菜初花期,选取油菜花粉小孢子发育处于单核靠边期至双核早期的花蕾(蕾长3～4mm)，用70％酒精清洗30s,0.1％升汞消毒8～10min,无菌水洗3次；置于无菌试管中,加入少量B5-13液体培养基(pH6.0),用玻璃棒将花蕾研碎,经300目双层尼龙网过滤,离心5min(800rpm)沉淀小孢子,弃上清后再用B5-13清洗2～3次，用含50～100mg/l秋水仙碱的NNL-13(pH5.8)液体培养基悬浮小孢子于Φ60mm培养皿中,置于32℃恒温培养箱中培养48h后离心,去掉上清,用不含秋水仙碱的NNL-13培养基悬浮小孢子,密度为5蕾/m1，分装培养在Φ90mm培养皿中(10mml/皿)；置于25℃暗培养2～3周,转移到摇床上进行震荡培养(转速80rpm)；待胚长大后,转接到B5-3固体培养基中，先经4℃低温处理3d,再置于14～16h光照,25℃培养分化成苗；继代1～2次，MS-3固体培养基加NAA0.2mg/l和矮壮素0.2mg/l生根，11月中上旬将小孢子试管苗在室外炼苗3～5d后移栽大田。在小孢子培养获得DH分离群体后代中筛选农艺、抗逆性及含油量等目标性状优良及特殊性状突出的材料。

4、结果分析

稳定纯合的目标性状特异种质资源的获得可以通过(稼接+常规系选)法和(稼接+小孢子培养)法，分别用这两种方法均可从F2的子代分离群体中筛选到目标性状相同的稳定纯合的种质资源材料；获得目标性状相同的稳定纯合的种质资源材料用(稼接+常规系选)法时间长，至少用时7-8年，有时甚至更长时间，而且要求选育者要有丰富的育种经验；而用(稼接+小孢子培养)法时间短，只需要4-5年，为前者用时的60％左右，要求选育者有一般的育种经验就可以，显著降低了选育者的日常工作量，大大提高了选育效率。

F2群体子代中，变异类型则非常丰富，根据农艺性状大多数变异可分为3种类型，分别为白菜型、甘蓝型和甘蓝型油菜型，还有其他一些3种类型之间的中间类型和一些特异类型等。

在MP02yyz-1+K407变异后代F2群体中目标性状优良单株用小孢子培养的方法获得的DH分离群体，在DH分离群体中通过筛选获得了新的矮茎的类型资源,株高85cm，有效分枝数21个，分枝部位5cm，长势具有甘蓝杆硬分枝多，又具有白菜型油菜的形态(图2)，这种类型对用来选育矮秆、抗倒高产油菜新品种而作为原始材料来说,具有重要的意义。

MP02yyz-1+青油14变异后代F2群体中目标性状优良单株用小孢子培养的方法获得的DH分离群体，在DH分离群体中通过筛选获得了花瓣变异的新资源，而且变异丰富，有残瓣花、多瓣花和复式花瓣花，这些材料对于花发育的研究是非常宝贵的材料，特别是获得的无花瓣材料具有节能减耗、提高光能利用、有利于传粉和结实及抗(耐)病性的许多优点，因此常被作为构建油菜理想株型的重要性状之一，更是选育高产、高抗菌核病油菜新品种的重要基础资源(图3)。从该稼接变异后代DH分离群体中通过还筛选到深缺刻花叶甘蓝型油菜资源，花叶性状在油菜苗期容易鉴别、不受环境影响、不存在明显的负效应,是一种很好的形态标记。叶片的缺刻可以使下层叶片也能接受光照,同时利于空气流通,并减少病害的发生，有适合高密度种植的潜力，是培育适合油菜直播与机械化作业品种的重要资源之一(图4)。

MP02yyz-1+加219和MP02yyz-1+青油14变异后代F2群体中目标性状优良单株用小孢子培养的方法获得的DH分离群体，在DH分离群体中通过筛选获得了白花资源(图5)，白花在油菜育种中是一种很好的指示性状，遗传稳定、表型直观，在测定天然异交率、鉴定种子纯度等方面具有重要作用。还可作为观赏旅游资源和美化环境，具有促进地方经济的发展，提高人民收入作用。

Claims (2)

1.一种油菜优异种质资源的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)F1群体变异种群的获得：以甘蓝为砧木，以甘蓝型油菜为接穗，通过斜面插接的稼接方法稼接，接穗成活后开花前套袋自交，获得F1群体变异种群；

(2)F2群体子代变异源的获得：从F1的子代分离群体中筛选变异植株，自交获得F2群体种子；

(3)目标性状特异种质资源的获得：从F2的子代分离群体中筛选目标性状优良的单株，再经小孢子培养获得DH分离群体后代，从中筛选农艺性状特征、抗病抗逆性、生育期和含油量目标性状优良及特殊性状突出的材料，即油菜优异种质资源。

2.根据权利要求1所述的油菜优异种质资源的培育方法，其特征在于，其特征在于，步骤(1)中，所述稼接方法为在3～4月份，选择与甘蓝型油菜抽薹期与薹直径相近的甘蓝，在薹高20～30cm时期稼接，以甘蓝为砧木，甘蓝型油菜为稼接接穗，采用消毒的刀具把砧木甘蓝和接穗甘蓝型油菜薹茎在距下部10～15cm处平切掉，采用斜面插接的方法，将接穗和砧木的稼接面切成长2～3cm，斜度为45～50度的平滑斜面，在平行于斜面沿薹茎中线劈开长1.8～2.2cm，将接穗的内切斜面体插入砧木的内切中线中，对齐斜面，然后用无菌封口膜封缠。