CN110495393A

CN110495393A - 一种获得紫色花椰菜小孢子dh再生植株的方法

Info

Publication number: CN110495393A
Application number: CN201910740645.1A
Authority: CN
Inventors: 盛小光; 顾宏辉; 赵振卿; 虞慧芳; 王建升; 沈钰森
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-08-12
Filing date: 2019-08-12
Publication date: 2019-11-26

Abstract

本发明公开了一种获得紫色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，供体花球紫色花椰菜植株经过割球疏枝精心管理，促进花蕾良好发育，挑选适宜花蕾，分离小孢子，培养游离小孢子至子叶胚状体形成，将子叶胚状体插入胚状体分化培养基中，至胚状体膨大并再生出新植株，再生植株插于生根培养基中进行培养，将生根后的再生植株移入基质中，成活后进行小孢子再生植株倍性检测，获得紫色花椰菜小孢子双单倍体DH(doubled haploid)再生植株。本发明方法获得纯合的花球紫色花椰菜小孢子DH再生植株，小孢子培养出胚率最高可达13个胚/蕾，胚状体的萌发率平均达60％。

Description

一种获得紫色花椰菜小孢子DH再生植株的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种获得紫色花椰菜小孢子DH再生植株的方法。

背景技术

花椰菜(Brassica oleracea L.var.botrytis)是十字花科芸薹属甘蓝种中以花球为食用器官的一个变种，因其丰富的营养、鲜美的口感成为人们喜爱的蔬菜之一，在世界各地普遍栽培。紫色花椰菜是近年来出现的一种花球紫色的特色花椰菜，由于其花球呈靓丽的紫色，富含具保健功能的花青素，成为人们菜篮子的“新宠”。然而，目前市场上的紫色花椰菜品种很少，而且种子纯度差，供需矛盾日益加大。市场迫切需要具有自主知识产权的优良紫色花椰菜新品种，然而传统的花椰菜杂交新品种的选育需要7～8年，费时费工，阻碍了花椰菜新品种选育的进程。利用小孢子培养方法能在当代获得纯合的育种材料，翌年就可以配制杂交组合，缩短育种周期至3～4年。因此，小孢子培养技术是花椰菜高效育种的手段之一，对提高花椰菜育种效率和水平具有重要意义。

十字花科作物小孢子培养前人已经做了较为详细的研究，但花椰菜小孢子培养还存在很多难关需要攻克。胚胎发生是小孢子培养成功的关键和前提，影响胚胎发生的因素很多，包括基因型、生理状况、预处理、小孢子发育时期、培养基及其成分等。其中供体植株的生理状况，预处理条件，小孢子发育时期及培养基类型和成分等已经得到了充分的改良和优化，但是基因型限制的难关一直无法攻克，基因型已经成为花椰菜小孢子胚胎是否发生和发生多少的关键性制约因素。

紫色花椰菜是一类较难进行胚胎发生诱导的基因型之一，主要是紫色花椰菜资源少，现有紫色资源花粉发育不整齐，花粉少等问题，至今国内外未见有紫色花椰菜小孢子培养成功获得再生植株的报道。本申请通过对紫色花椰菜游离小孢子进行培养，并成功获得一定数量的双单倍体(DH)再生植株，从中筛选出性状优良的单株可直接作为育种亲本进行杂交组合的配制，为培育具有自主知识产权的紫色花椰菜新品种提供技术和材料支撑。

发明内容

本发明的目的是提供一种获得花球紫色花椰菜小孢子培养DH再生植株的方法，建立紫色花椰菜小孢子培养再生体系，利用紫色花椰菜纯系以加快紫色花椰菜的育种进程与效率。

为了实现上述技术效果，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种获得紫色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，包括以下步骤：

1)供体的选择与管理

以可育的紫色花椰菜作为小孢子培养供体，植株花球在近收获期进行割球，对花梗进行疏枝，对花序进行疏蕾，保持植株健康营养，促进花蕾良好发育。

2)花蕾小孢子的分离

选择大小合适发育良好的花蕾，将压碎的花蕾置于胚状体诱导培养基中，过滤离心，弃上清液，加入活性炭混合液混配成小孢子悬浮液。

3)小孢子胚状体的培养

将小孢子悬浮液置于恒温培养箱中暗培养至胚状体出现后，振荡培养至子叶胚状体形成。

4)再生植株的分化与萌发

将子叶胚状体，插入胚状体分化培养基中，至胚状体膨大并再生出新植株。

5)再生植株的生根培养与移栽

切取萌发有正常生长点的再生植株插于生根培养基中，进行生根培养，将生根后的再生植株移入基质中，覆盖薄膜保温培养。

6)再生植株的倍性检测

取移栽成活再生植株的嫩叶，用倍性分析仪检测该再生植株的DNA倍性，如检测为双单倍体，即为DH再生植株。DH再生植株表现为花球深紫、偏圆形、紧实，花梗紫色，株形中等，叶色绿，叶片长椭圆形，植株整齐一致。

进一步的，所述的花蕾选自植株与花蕾生长健康的紫色花椰菜，且花瓣与花药长度比在1.2～1.4之间，处于单核晚期至双核早期的花蕾。

进一步的，所述的胚状体诱导培养基为：NLN-13液体培养基+蔗糖130g/L，pH 5.6～6.0，过滤灭菌。

进一步的，所述的活性炭混合液为：NLN-13液体培养基+1g/L活性炭，高温灭菌两次。

进一步的，按照0.1mL/10mL胚状体诱导培养基的比例加入活性炭混合液。

进一步的，小孢子胚状体的培养具体为：将分装好的培养皿置于31-33℃恒温培养箱中，暗培养24-48小时；后置于25℃恒温培养箱，暗培养15-20天至肉眼可见胚状体出现；再在25℃黑暗下50rpm振荡培养7-10天，至子叶胚状体形成。

进一步的，所述的胚状体分化培养基为：MS培养基+NAA0.01～0.06mg/L+BAP 0.1～0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂10g/L，pH 5.6～6.0，高温灭菌。

进一步的，所述的生根培养基为：MS培养基+NAA 0.05～0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH 5.8，高温灭菌。

本发明的有益效果为：

本发明首次建立了快速有效地获得纯合紫色花椰菜DH再生植株方法，紫色花椰菜小孢子培养的出胚率，最高可达13个胚/蕾，胚状体的萌发率，平均达60％，为培育具有自主知识产权的紫色花椰菜新品种提供技术和材料支撑，对加快紫色花椰菜的育种进程与效率具有实际意义。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1.培养基的配制：包括小孢子培养各阶段的培养基，它们的组分与各组分在每升培养基中的具体含量为：

1.1胚状体诱导培养基：NLN-13液体培养基+蔗糖130g/L，pH6.0，过滤灭菌，其中NLN-13培养基配方见表1；

1.2胚状体分化培养基：MS培养基+NAA 0.02mg/L+BAP 0.3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 6.0，高温灭菌，其中MS培养基配方见表1；

1.3萌发、生根培养基：MS培养基+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8，高温灭菌；

表1 NLN-13和MS培养基配方

2.紫色花椰菜小孢子再生植株的培养

2.1供体植株与花蕾的选择：选择NPK营养均衡充足、植株与花蕾生长健康，无明显病情的紫色花椰菜植株作供体；选择刚开放1-2朵花的花序，并从中摘取花瓣与花药长度比为1.2，处于单核靠边期至双核早期的花蕾10个；

2.2花蕾灭菌：先用纯净水清洗花蕾3次，然后将其放入灭菌液(0.1％HgCl₂+0.1％吐温20)中，摇床轻微摇晃(50-80rpm)进行表面消毒12分钟，再在超净台上用无菌水清洗4次后，备用；

2.3花蕾小孢子的分离、混配与分装：在超净台上将灭菌后的花蕾置于无菌烧杯中，加入1mL胚状体诱导培养基，用平头玻棒压碎花蕾，然后再加入5mL相同培养基，搅成悬浮液；将该悬浮液用40μm无菌尼龙滤网过滤于离心管中，1000rpm离心4分钟，弃上清液；再加5mL胚状体诱导培养基按同样方法离心并弃上清液；加入胚状体诱导培养基，调节至小孢子密度为2.0～3.0×10⁶个小孢子/ml。再按0.1mL/10mL培养基比例加入活性炭混合液(配方见上)，混配成小孢子悬浮液；将该小孢子悬浮液分装于直径为6cm的无菌培养皿中，加盖后用parafilm膜封口，备用；

2.4小孢子胚状体的培养：将分装好的培养皿置于33℃恒温培养箱中，暗培养24小时；后置于25℃恒温培养箱，暗培养10-15天至胚状体出现；再在25℃黑暗下50rpm振荡培养7-10天，至子叶胚状体形成；

2.5再生植株的分化与萌发培养：在超净台中将子叶型胚状体，平放于胚状体分化培养基上，在每天光照16小时、25℃下培养15天至胚状体膨大并再生出新植株；

2.6再生植株的生根培养与移栽：切取萌发有正常生长点的再生植株插于生根培养基中，在每天光照16小时、25℃下进行生根培养；将生根后的再生植株移入含泥炭与珍珠岩按体积2︰1配制的基质中，浇透水，覆盖薄膜保湿在25℃下培养1周；

2.7再生植株的倍性检测：取移栽成活再生植株的嫩叶，用partecPA倍性分析仪检测该再生植株染色体的DNA倍性；

用本例方法培养获得的紫色花椰菜小孢子再生植株共92株，经倍性检测，其中二倍体的再生植株共有61株，二倍体率占总株数的66.3％。DH再生植株均表现为花球深紫、偏圆形、紧实，花梗紫色，株形中等，叶色绿，叶片长椭圆形，植株整齐一致。

实施例2

本实施例中，选取10个双核早期花蕾，花瓣与花药长度比为1.3；花蕾灭菌后进行小孢子分离，然后加入胚状体诱导培养基，调节至小孢子密度为4.0～6.0×10⁶个小孢子/ml。再按0.1mL/10mL培养基比例加入活性炭混合液(配方见上)，混配成小孢子悬浮液；将该小孢子悬浮液按4mL/皿分装于直径为6cm的无菌塑料培养皿中，加盖后用parafilm膜封口，将培养皿置于32℃条件下培养24小时；获得的胚状体置于胚状体分化培养基MS培养基+NAA0.05mg/L+BAP 0.4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH 5.8中，在每天16小时光照25℃条件下培养18天至胚状体再生出植株；NLN-13、MS培养基配方同表1；其余步骤工艺均同于实施例1。

实施例3

小孢子培养获得的二倍体再生植株为双单倍体，基因型完全纯合，可作为育种亲本直接进行F₁杂交种的配制。利用本实施方案获得双单倍体紫色花椰菜材料，进行大量测配，培育出了具有自主知识产权的，并且在球色、球形及抗性等方面均表现优良的紫色花椰菜新品种‘浙农紫花1号’。‘浙农紫花1号’表现为中熟，生育期从移栽至采收80天左右，株形中等，花球紫色、圆整、紧实，单球重约1500g，综合抗性优良，经过近两年的示范与推广，市场反应良好，有望大面积生产应用。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种获得紫色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)供体的选择与管理

以可育的花球紫色的花椰菜作为小孢子培养供体，植株花球在近收获期进行割球，对花梗进行疏枝，对花序进行疏蕾，保持植株健康营养，促进花蕾良好发育；

2)花蕾小孢子的分离

选择大小合适发育良好的花蕾，将压碎的花蕾置于胚状体诱导培养基中，过滤离心，弃上清液，加入活性炭混合液混配成小孢子悬浮液；

3)小孢子胚状体的培养

将小孢子悬浮液置于恒温培养箱中暗培养至胚状体出现后，振荡培养至子叶胚状体形成；

4)再生植株的分化与萌发

将子叶胚状体，插入胚状体分化培养基中，至胚状体膨大并再生出新植株；

5)再生植株的生根培养与移栽

切取萌发有正常生长点的再生植株插于生根培养基中，进行生根培养，将生根后的再生植株移入基质中，覆盖薄膜保温培养；

6)再生植株的倍性检测

取移栽成活再生植株的嫩叶，用倍性分析仪检测该再生植株的DNA倍性，如检测为双单倍体，即为DH再生植株。

2.根据权利要求1所述的一种获得紫色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，其特征在于，所述的花蕾选自植株与花蕾生长健康的可育紫色花椰菜，且花瓣与花药长度比在1.2～1.4之间，处于单核晚期至双核早期的花蕾。

3.根据权利要求1所述的一种获得紫色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，其特征在于，所述的胚状体诱导培养基为：NLN-13液体培养基+蔗糖130g/L，pH 5.6～6.0，过滤灭菌。

4.根据权利要求1所述的一种获得紫色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，其特征在于，所述的活性炭混合液为：NLN-13液体培养基+1g/L活性炭，高温灭菌两次。

5.根据权利要求1所述的一种获得紫色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，其特征在于，按照0.1mL/10mL胚状体诱导培养基的比例加入活性炭混合液。

6.根据权利要求1所述的一种获得紫色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，其特征在于，小孢子胚状体的培养具体为：将分装好的培养皿置于31-33℃恒温培养箱中，暗培养24-48小时；后置于25℃恒温培养箱，暗培养15-20天至肉眼可见胚状体出现；再在25℃黑暗下50rpm振荡培养7-10天，至子叶胚状体形成。

7.根据权利要求1所述的一种获得紫色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，其特征在于，所述的胚状体分化培养基为：MS培养基+NAA 0.01～0.06mg/L+BAP 0.1～0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂10g/L，pH 5.6～6.0，高温灭菌。

8.根据权利要求1所述的一种获得紫色花椰菜小孢子DH再生植株的方法，其特征在于，所述的生根培养基为：MS培养基+NAA 0.05～0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH 5.8，高温灭菌。