CN103392604A - 一种青花菜的组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种青花菜的组织培养方法，包括如下步骤：（1）取青花菜的花蕾和小麦子房，灭菌；（2）将灭菌后的花蕾配制成小孢子悬浮液，将所述小孢子悬浮液和小麦子房置于培养液中混合培养，诱导获得子子叶型胚状体；（3）将子叶型胚状体接入分化培养基中，培养获得再生植株；（4）从再生植株切取再生芽，接入生根培养基，获得完整植株。本发明采用青花菜顽固基因型游离小孢子与小麦子房按一定数目配比共培养，从而促进青花菜顽固基因型小孢子胚胎发生。

Description

一种青花菜的组织培养方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种促进青花菜顽固基因型小孢子胚胎发生的组织培养方法。

背景技术

青花菜(Brassica oleracea L.var.italica)又名西兰花、绿菜花、茎椰菜等，是十字花科芸薹属甘蓝种中以绿色花球为产品器官的一、二生草本植物，其以主茎及侧枝顶端形成的绿色花球为产品，营养丰富，色、香、味具佳，是国际市场十分畅销的一种名特蔬菜。目前，我国青花菜主栽品种大部分都来自国外，具有我们自主知识产权的品种匮乏，究其原因是因为国内青花菜优异育种资源很少，配制不出好的材料，因此迫切需要通过育种的手段，把市场上应用的品种进行多年自交分离。传统的多代自交分离的方法一般需要5～6年的时间才能选育到一个纯合的亲本材料。而小孢子培养方法可以在1～2年内快速获得双单倍体纯系，比传统的方法缩短了3～4年的时间，从而大大缩短了育种进程，提高了育种的效率。

自1982年Lichter首次报道油菜游离小孢子培养获得再生植株以来，芸薹属作物的小孢子培养，无论是在出胚率、出胚量及再生植株方面都获得了较大成功。相对于甘蓝型油菜来说，青花菜游离小孢子的培养难度较大。国外研究最早见于1991年Takahata等人的报道，国内则是张德双等1997年在青花菜品种“巴绿”的研究上获得成功。随后，张延国等（中国蔬菜，2005（6）：7～9）、方淑桂等（福建农林大学学报（自然科学版），2005,34（1）：51～55）、袁素霞（中国农业科学，2009,42（1）：189～197）等人也有报道，但存在问题是小孢子胚胎发生率普遍不高，且受基因型影响较大。申请号为200910101722.5的中国发明专利申请中公开了一种青花菜高二倍体率小孢子再生植株的培养方法，主要涉及改变常规培养基成分和培养方法，以提高青花菜植株的二倍体率。专利号为ZL201110112536.9的中国发明专利主要是采用青花菜顽固基因型小孢子与易出胚油菜的小孢子共培养的方法，达到了促进青花菜小孢子出胚的目的，但由于是小孢子共同培养，对于得到的胚状体可能是青花菜胚状体，也可能是油菜胚状体，要到田间种植后才能判断，选育时间较长。

发明内容

本发明提供了一种青花菜的组织培养方法，采用青花菜顽固基因型游离小孢子与小麦子房按一定数目配比共培养，显著促进了青花菜小孢子胚胎发生，操作方便。

一种青花菜的组织培养方法，包括以下步骤：

（1）取青花菜的花蕾和小麦子房，灭菌；

（2）将灭菌后的花蕾配制成小孢子悬浮液，将所述小孢子悬浮液和小麦子房置于培养液中混合培养，诱导获得子叶型胚状体；

（3）将子叶型胚状体接入分化培养基中，培养获得再生植株；

（4）从再生植株切取再生芽，接入生根培养基，获得完整植株。

本发明中的培养方法为小麦子房与青花菜小孢子混合培养，利用小麦子房的良好刺激作用，促进青花菜小孢子胚胎发生。另外，培养过程中，青花菜的小孢子胚胎发生、发育过程都能与小麦子房显著区分，培养得到的胚状体在初期即可确定为青花菜的胚状体，且方法简便易行，易于操作。

步骤（1）中灭菌时所用灭菌液成分为次氯酸钠56mL/L+99%酒精100mL/L+洗涤精200μL。

作为优选，所述花蕾与小麦子房的数量比为1：5～10。

进一步优选，所述青花菜的花蕾为处于单核晚期的青花菜花蕾；所述小麦子房取自受精前2～3天的小麦麦穗。

更进一步优选，所述青花菜花蕾的花瓣和花药长度比为0.8～1.2：1；花蕾灭菌后置于无菌NLN-13液体培养基中预培养1～3天。

作为优选，步骤（2）中，将所述花蕾用所述培养液配制成小孢子悬浮液，将小孢子悬浮液与所述小麦子房混合培养。

所述培养液为NLN-13液体培养基和无菌活性炭混合液的混合物。

所述活性炭混合液的组成为：1L NLN液体培养基、2～5g琼脂糖和1g活性炭。

所述培养液中活性炭混合液与NLN-13液体培养基的体积比为1:80。

配制成小孢子悬浮液的过程为：

向灭菌后的青花菜花蕾中加入NLN-13液体培养基研磨成悬浮液，将所述悬浮液经过滤、离心、去上清后得沉淀，依次加入NLN-13液体培养基和无菌活性炭混合液（即上述培养液）混配成小孢子悬浮液。

所述过滤、离心、去上清得沉淀过程进行1～2次，所述过滤采用300目无菌滤网，所述离心为700～1000rpm离心3～5分钟。

所述NLN-13液体培养基为：由1L NLN液体培养基和130g蔗糖组成，pH6.0～6.2。

所述NLN液体培养基，以1L计，组成为：KNO₃125mg，Ca(NO₃)₂·4H₂O500mg，MgSO₄·7H₂O125mg，KH₂PO₄125mg，H₃BO₃6.2mg，MnSO₄·H₂O18.95mg，ZnSO₄·7H₂O8.6mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，CuSO₄·5H₂O0.025mg，CoCl₂·6H₂O0.025mg，维生素B10.5mg，维生素B60.5mg，生物素0.05mg，叶酸0.5mg，Na₂EDTA37.3mg，FeSO₄·7H₂O27.8mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，维生素B55mg，丝氨酸100mg和余量的无菌水。

作为优选，所述混合培养条件为：

所述小孢子悬浮液和小麦子房混合后先在33℃、黑暗条件下恒温培养2天，再在25℃、黑暗条件下恒温培养10～15天至肉眼可见细胞团出现，最后在25℃、黑暗条件下50～60rpm振荡培养10～15天，得到子叶型胚状体。

所述分化培养基为：B5培养基+蔗糖30g/L，琼脂9～10g/L，pH5.9～6.1。

所述分化培养过程为：

无菌条件下，将成熟的子叶型胚状体转接至胚状体固体分化培养基中，每天16小时光照、23±2℃条件下培养15～20天至形成愈伤组织或直至分化出芽；再按大小将愈伤组织切成2～4块置于相同培养基与条件下培养，至分化形成再生植株。

所述生根培养基为：由1/2MS培养基1L+0.1～0.2mg NAA+0.1～0.2mg IBA、蔗糖或白砂糖20～30g和琼脂7～8组成，pH5.8～6.0。

进一步优选地，可以将在生根培养基上根系生长健壮的植株经炼苗后移栽到田间，并倍性鉴定后，获得纯合双单倍体再生植株。

再生植株倍性鉴定采用气孔保卫细胞叶绿体数目计数法。

本发明的有益效果为：

（1）本发明采用青花菜顽固基因型游离小孢子与小麦子房按一定数目比例共培养，促进了青花菜顽固基因型小孢子胚胎发生。本发明方法获得的青花菜顽固基因型小孢子平均出胚数最高达21个/蕾，而对照青花菜出胚率最高仅为3.5个/蕾，且胚状体的质量也得到很大改善，解决了青花菜顽固基因型小孢子胚胎发生率低的问题，提高了小孢子培养技术的利用效率。

（2）经植株形态鉴定及气孔保卫细胞叶绿体数目观察发现，在相同的条件下混合培养最后得到37株青花菜再生植株，而单独培养的对照株数为5。

（3）所采用的方法简便易行，培养得到的小孢子再生植株群体为青花菜，不需要对植株类型进行鉴定，从而减少了工作量，提高了培养效率，具有可操作性。

具体实施方式

实施例1

培养方法按如下步骤进行。

培养基配制：包括小孢子不同培养阶段的培养基，其组分与各组分在每升培养基中所含的重量为：

NLN-13液体培养基：NLN液体培养基1L+蔗糖130g/L，pH6.0，过滤灭菌；

NLN液体培养基，以1L计，组成为：KNO₃125mg，Ca(NO₃)₂·4H₂O500mg，MgSO₄·7H₂O125mg，KH₂PO₄125mg，H₃BO₃6.2mg，MnSO₄·H₂O18.95mg，ZnSO₄·7H₂O8.6mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，CuSO₄·5H₂O0.025mg，CoCl₂·6H₂O0.025mg，维生素B10.5mg，维生素B60.5mg，生物素0.05mg，叶酸0.5mg，Na₂EDTA37.3mg，FeSO₄·7H₂O27.8mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，维生素B55mg，丝氨酸100mg和余量的无菌水。

胚状体分化培养基：B5培养基+蔗糖30g/L，琼脂9g/L，pH6.0，高温高压灭菌；

B5洗涤培养基，以1L计，组成为：NaH₂PO₄·2H₂O169.5mg,KNO₃2500mg，(NH₄)₂SO₄134mg，MgSO₄·7H₂O500mg，MnSO₄·4H₂O10mg,H₃BO₃3mg,ZnSO₄·7H2O2mg,KI0.75mg,Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg,CuSO₄·5H₂O0.025mg,CoCl₂·6H₂O0.025mg,Na₂-EDTA37.3mg,FeSO₄·7H₂O27.8mg,CaCl₂.2H₂O150mg,VB110mg,VB61mg,VPP1mg,肌醇100mg和余量的蒸馏水。

生根培养基：由1/2MS培养基1L+0.1mg NAA+0.1mg IBA、白砂糖30g和琼脂7g组成，pH5.8，高温高压灭菌；

MS培养基，以1L计，组成为：NH₄HO₃1650mg，KNO₃1900mg，CaCl₂·2H₂O440mg，KH₂PO₄170mg，MgSO₄·7H₂O370mg，FeSO₄·7H₂O27.8mg，Na₂EDTA37.3mg，H₃BO₃6.2mg，MnSO₄·H₂O16.9mg，ZnSO₄·7H₂O8.6mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，CuSO₄·5H₂O0.025mg，CoCl₂·6H₂O0.025mg，KI0.83mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，维生素B10.1mg，维生素B60.5mg和余量的无菌水。

促进青花菜顽固基因型小孢子胚胎发生的方法：

1）供体材料选取：取青花菜花序上花瓣和花药长度比为0.8、单核晚期至双核早期、健康、无病虫害的花蕾及受精前2天的小麦麦穗作为试验的供体材料；

2）供体材料的灭菌：用5.6%（质量百分浓度）次氯酸钠水溶液56ml/L+无水乙醇100ml/L+洗洁精200μL+无菌水配制成的灭菌液；把小麦麦穗和青花菜花蕾分别放入无菌培养皿中，加入灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒18分钟，再在超净工作台上用无菌水荡洗5次后，备用；

3）在超净工作台上将12个无菌青花菜花蕾置于无菌烧杯中，加入10mL NLN-13液体培养基，用玻棒将花蕾研磨成悬浮液；将该悬浮液用300目无菌滤网过滤于50mL离心管中，所得滤液经700离心5分钟，弃上清液后再加10mL NLN-13培养基按同法离心，弃上清液；往沉淀中加入40mL NLN-13液体培养基，再按每4mL培养基中加入0.05mL由NLN-13液体培养基1L+琼脂糖5g/L+1g/L活性炭配制、高温灭菌而成的无菌活性炭混合液，混配成小孢子悬浮液；将该混悬液分装于10个直径为60mm的塑料或玻璃无菌培养皿中，每培养皿分装4mL；

4）无菌条件下，剥取小麦子房加入到上述培养皿中，每培养皿放7个，加盖后用parafilm膜封口；

5）将装有青花菜小孢子悬浮液和小麦子房的培养皿置于33℃生化培养箱中，黑暗条件培养2天；后取出放置在25℃恒温培养箱，黑暗条件下培养10～15天至肉眼可见细胞团出现，再在25℃黑暗下50rpm振荡培养10天，至子子叶型胚状体形成并成熟；

6）无菌条件下，将成熟的子子叶型胚状体转接至胚状体固体分化培养基中，每天16小时光照、23±2℃条件下培养15～20天至形成愈伤组织或直至分化出芽；再按大小将愈伤组织切成2～4块置于相同培养基与条件下培养，至分化形成再生植株；

7）切取生长健康的再生芽接种至生根培养基上，在每天16小时光照、25℃下进行生根培养；3周后将根生长健壮的苗进行炼苗3天；移栽时用清水洗净组培苗根部培养基，后把植株植于蔬菜育苗专用基质穴盘，塑料膜罩住保湿，在温室中培养10天后移栽，得到再生植株；

8）取再生植株的嫩叶，观察、比较气孔保卫细胞叶绿体数目，检测各植株倍性。

对照：仅取青花菜生长健康、无病虫害的花序作为小孢子培养的供体植株，其它操作同上述步骤（1）～（8），作为对照青花菜。

结果：混合培养青花菜出胚率为19个/蕾，而对照青花菜出胚率仅为1.5个/蕾；经田间观察验证，与小麦子房共培养培养得到14株青花菜小孢子苗，而对照青花菜小孢子单独培养的对照株数为1株。

实施例2

培养基配制：

NLN-13诱导培养基：NLN-13培养基+蔗糖130g/L，pH6.2，过滤灭菌，NLN液体培养基成分同实施例1。

胚状体分化培养基：B5培养基+蔗糖20g/L，琼脂10g/L，pH6.1，高温高压灭菌；B5培养基成分同实施例1。

生根培养基：由1/2MS培养基1L+0.2mg NAA+0.1mg IBA、蔗糖20g和琼脂7g组成，pH6.0，高温高压灭菌；MS培养基成分同实施例1。

提高青花菜顽固基因型小孢子胚胎发生的方法：

1）供体材料选取：取青花菜花序上花瓣和花药长度比为1.0、健康、无病虫害的花蕾和受精前2天的小麦麦穗作为试验的供体材料；

3）在超净工作台上将14个无菌青花菜花蕾置于无菌烧杯中，加入10mL NLN-13液体培养基，用玻棒将花蕾研磨成悬浮液；将该悬浮液用300目无菌滤网过滤于50mL离心管中，所得滤液经800rpm离心4分钟，弃上清液后再加10mL NLN-13培养基按同法离心，弃上清液；往沉淀中加入40mL NLN-13液体培养基，再按每4mL培养基中加入0.05m由NLN-13液体培养基1L+琼脂糖5g/L+1g/L活性炭配制、高温灭菌而成的无菌活性炭混合液L，混配成小孢子悬浮液；将该混悬液分装于10个直径为60mm的塑料或玻璃无菌培养皿中，每培养皿分装4mL；

4）无菌条件下，剥取小麦子房加入到上述培养皿中，每培养皿放9个，加盖后用parafilm膜封口；

5）将装有青花菜小孢子悬浮液和小麦子房的培养皿置于33℃生化培养箱中，黑暗条件培养2天；后取出放置在25℃恒温培养箱，黑暗条件下培养10～15天至肉眼可见细胞团出现，再在25℃黑暗下55rpm振荡培养13天，至子叶型胚状体形成并成熟；

其余操作同时实施例1。

结果：共培养青花菜出胚率为20个/蕾，而对照青花菜出胚率仅为2个/蕾；经田间观察验证，共培养得到17株青花菜小孢子再生植株，而对照青花菜小孢子单独培养的对照株数为2株。

实施例3

培养基配制：

NLN-13诱导培养基：NLN-13培养基+蔗糖130g/L，pH6.1，过滤灭菌；NLN液体培养基成分同实施例1；

胚状体分化培养基：B5培养基+蔗糖20g/L，琼脂10g/L，pH6.0，高温高压灭菌；B5培养基成分同实施例1；

生根培养基：由1/2MS培养基1L+0.2mg NAA+0.2mg IBA、蔗糖25g和琼脂7.5g组成，pH5.9，高温高压灭菌；MS培养基成分同实施例1。

提高青花菜顽固基因型小孢子胚胎发生的方法：

1）供体材料选取：取青花菜花序上花瓣和花药长度比为1.2、油健康、无病虫害的花蕾和小麦麦穗作为小孢子培养的供体材料；

3）在超净工作台上将15个无菌青花菜花蕾置于无菌烧杯中，加入10mL NLN-13液体培养基，用玻棒将花蕾研磨成悬浮液；将该悬浮液用300目无菌滤网过滤于50mL离心管中，所得滤液经900rpm离心3分钟，弃上清液后再加10mL NLN-13培养基按同法离心，弃上清液；往沉淀中加入40mL NLN-13液体培养基，再按每4mL培养基中加入0.05mL由NLN-13液体培养基1L+琼脂糖5g/L+1g/L活性炭配制、高温灭菌而成的无菌活性炭混合液，混配成小孢子悬浮液；将该混悬液分装于10个直径为60mm的塑料或玻璃无菌培养皿中，每个培养皿分装4mL；

4）无菌条件下，剥取无菌小麦子房加入到上述培养皿中，每培养皿放10个，加盖后用parafilm膜封口；

5）将装有青花菜小孢子悬浮液和小麦子房的培养皿置于33℃生化培养箱中，黑暗条件培养2天；后取出放置在25℃恒温培养箱，黑暗条件下培养10～15天至肉眼可见细胞团出现，再在25℃黑暗下60rpm振荡培养15天，至子叶型胚状体形成并成熟；

其余操作同实施例1。

结果：共培养青花菜出胚率为18个/蕾，而对照出胚率仅为2.2个/蕾；经田间观察发现，混合培养最后得到23株青花菜小孢子再生植株，而对照青花菜小孢子单独培养的对照株数为3株。

由以上实施例结果证明，本发明方法培养得到的小孢子再生植株群体为青花菜，不需要对植株类型进行鉴定，从而减少了工作量，提高了培养效率，具有可操作性。

Claims (9)

1.一种青花菜的组织培养方法，包括以下步骤：

（1）取青花菜的花蕾和小麦子房，灭菌；

（2）将灭菌后的花蕾配制成小孢子悬浮液，将所述小孢子悬浮液和小麦子房置于培养液中混合培养，诱导获得子叶型胚状体；

（3）将子叶型胚状体接入分化培养基中，培养获得再生植株；

（4）从再生植株切取再生芽，接入生根培养基，获得完整植株。

2.根据权利要求1所述青花菜的组织培养方法，其特征在于，所述花蕾与小麦子房的数量比为1：5～10。

3.根据权利要求1所述青花菜的组织培养方法，其特征在于，所述青花菜的花蕾为处于单核晚期的青花菜花蕾；所述小麦子房取自受精前2～3天的小麦麦穗。

4.根据权利要求3所述青花菜的组织培养方法，其特征在于，所述青花菜花蕾的花瓣和花药长度比为0.8～1.2：1；花蕾灭菌后置于无菌NLN-13液体培养基中预培养1～3天。

5.根据权利要求1所述青花菜的组织培养方法，其特征在于，所述培养液为NLN-13液体培养基和无菌活性炭混合液的混合物。

6.根据权利要求5所述青花菜的组织培养方法，其特征在于，所述活性炭混合液的组成为：1L NLN液体培养基、2～5g琼脂糖和1g活性炭。

7.根据权利要求6所述青花菜的组织培养方法，其特征在于，所述培养液中活性炭混合液与NLN-13液体培养基的体积比为1:80。

8.根据权利要求7所述青花菜的组织培养方法，其特征在于，所述小孢子悬浮液和小麦子房混合后先在33℃、黑暗条件下恒温培养2天，再在25℃、黑暗条件下恒温培养10～15天至肉眼可见细胞团出现，最后在25℃、黑暗条件下50～60rpm振荡培养10～15天，得到子叶型胚状体。

9.根据权利要求1所述青花菜的组织培养方法，其特征在于，所述生根培养基由1/2MS培养基1L+0.1～0.2mg NAA+0.1～0.2mg IBA、20～30g蔗糖或白砂糖和7～8琼脂组成，pH5.8～6.0。