CN101473789B - 雪菜单倍体育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种雪菜单倍体育种方法，包括以下步骤：取雪菜主茎或大分枝上的花序，低温诱导后取花序上单核晚期至双核早期的花蕾进行灭菌；将灭菌后的花蕾放入NLN-13培养液中，捣碎、过滤，离心后得到小孢子悬浮液；将小孢子悬浮液热击处理后再进行常温黑暗培养得到子叶期胚状体；收集子叶期胚状体，转移至固体分化培养基后进行分化培养，生根、炼苗后移栽到营养土中，得到单倍体植株；将单倍体植株的根系用秋水仙碱加倍处理，得到双单倍体植株。本发明方法在胚状体诱导过程当中，对花蕾进行了低温诱导，对小孢子进行热击处理，提高了胚状体发生频率和胚成活率，其胚成活率高达95％以上。
Description
技术领域
本发明涉及植物育种技术领域，尤其涉及一种雪菜单倍体育种方法。
背景技术
雪菜属十字花科芸苔属的芥菜种、是分蘖芥的一个变种。雪菜的别名有很多，如安徽、江苏和浙江等地称为“雪里蕻”、“九头芥”，在湖南、湖北等地称为“排菜”。它是我国长江流域普遍栽培的冬春两季重要蔬菜，以叶柄和叶片为食用部分，营养价值很高。香气浓郁、滋味清脆鲜美的东坡肉、雪菜肉丝面、雪菜冬笋、雪菜豆腐、雪菜黄鱼就是以雪菜作为主要成份烹制而成的。
所谓单倍体育种，即利用花药培养等方法诱导产生单倍体，并使其单一的染色体各自加倍成对，成为有活力、能正常结实的纯合体，从而选育出新的品种，单倍体主要是通过小孢子直接萌发或经过愈伤组织分化成植株获得。
我国在芸苔属作物小孢子培养方面有较多的研究，但对雪菜小孢子悬浮培养方法的优化研究尚未见报导。由于雪菜小孢子悬浮培养胚胎发生频率较低，继代技术难度大，难以有效获得双单倍体(DH)再生植株，给抗性育种、品质育种和转基因研究等应用造成困难。
发明内容
本发明提供了一种雪菜单倍体育种方法，该方法解决了雪菜小孢子悬浮培养胚胎发生频率较低的问题。
一种雪菜单倍体育种方法，包括以下步骤：
a.取雪菜主茎或分枝上的花序，在2～4℃诱导12～24个小时后，取花序上单核晚期至双核早期的花蕾进行灭菌；
b.将灭菌后的花蕾放入NLN-13培养液中，捣碎、过滤，离心后得到小孢子悬浮液；
c.将小孢子悬浮液置于30～32℃下热击处理2～3天后，在常温下进行黑暗恒温培养，至肉眼可见胚状体时，再在常温下进行黑暗震荡培养，得到子叶期胚状体；
d.收集子叶期胚状体，接种至分化培养基，再在组培室中光照培养，分化芽长出后接种至生根培养基，生根、炼苗后移入营养土中培养，得到单倍体植株；
e.用秋水仙碱对单倍体植株的根系进行加倍处理，植株恢复正常后移入大田进行正常栽培。
秋水仙碱的浓度最好为150～300mg/L，处理时间最好为15～30h。
本发明方法在胚状体诱导过程当中，对花蕾进行了低温诱导，对小孢子进行热击处理与适温培养，提高了胚状体发生频率和胚成活率，其胚成活率高达95％以上。
本发明利用秋水仙碱对单倍体植株的根系进行加倍处理，通过筛选秋水仙碱的浓度，其有效加倍率可达80％左右。
具体实施方式
培养基
NLN-13培养基：以配置1L培养液为例，需将100ml大量元素(溶液)、10ml微量元素(溶液)、10ml有机物(溶液)、10ml叶酸(溶液)、10ml Fe盐(溶液)、10ml肌醇(溶液)、130g蔗糖、30mg谷胱甘肽、800mg左旋谷氨酰胺、100mg丝氨酸混合，最终pH调节至6.0，过滤灭菌后放于4℃冰箱备用。
其中大量元素(溶液)、微量元素(溶液)、有机物(溶液)、Fe盐(溶液)、叶酸(溶液)、肌醇(溶液)中各组分配比如下：
| I.大量元素(溶液) | (g/L) | III.有机物(溶液) | (g/L) |
| KNO3 | 1.25 | 维生素B1 | 0.05 |
| Ca(NO3)2·4H2O | 5 | 维生素B6 | 0.05 |
| MgSO4·7H2O | 1.25 | 维生素B5 | 0.5 |
| KH2PO4 | 1.25 | 生物素 | 0.005 |
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| MnSO4·4H2O | 2.23 | 叶酸 | 0.05 |
| MnSO4·H2O | 1.56 | V.Fe盐(溶液) | 100倍(g/L) |
| ZnSO4·7H2O | 0.86 | Na2EDTA | 3.73 |
| Na2MoO4·2H2O | 0.025 | FeSO4·7H2O | 2.78 |
| CuSO4·5H2O | 0.0025 | VI.肌醇(溶液) | 100倍(g/L) |
| CoCl2·6H2O | 0.0025 | 肌醇 | 10 |
分化培养基：以配置1L培养基为例，将100ml大量元素(溶液)、10ml微量元素(溶液)、10ml有机物(溶液)、10ml Fe盐(溶液)、2mg 6-BA(溶液)、20g蔗糖、8.25g琼脂条、100mg肌醇混合，加热搅拌均匀，调节pH至6.0，120℃灭菌20分钟，冷却待用。
生根培养基：以配置1L培养基为例，将100ml大量元素(溶液)、10ml微量元素(溶液)、10ml有机物(溶液)、10ml Fe盐(溶液)、20g蔗糖、8.25g琼脂条、100mg肌醇混合，加热搅拌均匀，调节pH至6.0，120℃灭菌20分钟，冷却待用。
其中大量元素(溶液)、微量元素(溶液)、有机物(溶液)、Fe盐(溶液)配比如下：
| I.大量元素(溶液) | (g/L) | II.微量元素(溶液) | (g/L) |
| NH4NO3 | 8.25 | KI | 0.083 |
| KNO3 | 9.5 | H3BO3 | 0.62 |
| CaCl2*2H2O | 2.2 | MnSO4.4H2O | 2.23 |
| MgSO4.7H2O | 1.85 | ZnSO4.7H2O | 0.86 |
| KH2PO4 | 0.85 | Na2MoO4.2H2O | 0.025 |
| III.有机物(溶液) | (g/L) | CuSO4.5H2O | 0.0025 |
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分离小孢子
采用雪菜优良品种七星鸡冠菜作为供体材料，供体植株生长在15℃/10℃(昼/夜)的条件下。
(1)在清晨或傍晚，从上述雪菜主茎和分枝上摘取健康的花序，放入4℃低温冰箱中，低温诱导24小时，温度也可调节至2℃，从而把处理时间调整为12小时。
(2)在无菌室内，选取上述花序上单核晚期至双核早期的雪菜花蕾10个放入培养皿，用5.6％NaClO溶液灭菌，放于摇床上震荡15分钟后，用4℃无菌水冲洗5次。
(3)将上述雪菜花蕾放入小烧杯中，加入少量4℃无菌NLN-13培养液，用玻璃棒轻轻捣碎。
(4)将击碎的雪菜花蕾连同NLN-13培养液用40μm尼龙网过滤，倒入50ml离心管，然后用NLN-13多次冲洗烧杯和玻璃棒，并将其一并倒入离心管中，共约10ml。
(5)快速将离心管放入低速离心机进行离心5分钟，转速为800r/min，离心完毕后，倒出上清液，加NLN-13培养液至10ml，再次快速将离心管放入离心机进行离心5分钟，离心完毕后，倒出上清液，加NLN-13培养液至40ml，然后加入活性碳溶液(以配50ml活性炭溶液为例：活性炭1g、琼脂糖0.125g、用无菌NLN-13溶液定容至50ml，然后分瓶高压灭菌，灭菌后放入4℃冰箱)3-4滴。活性炭主要是为了吸附悬浮液中某些小孢子产生的有毒物质，可以让小孢子胚状体更加健康地生长。
培育单倍体植物
(1)用5ml移液枪吸取4ml上述小孢子悬浮液分装于十个小培养皿中。放入30～32℃恒温培养箱热击处理两至三天，再移至组培室黑暗恒温培养，温度控制在24～26℃。
(2)当肉眼可见胚状体时(约一个星期)，将培养皿转移至摇床继续震荡培养(转速60r/min，24～26℃，黑暗，约两个星期左右)，得到子叶期胚状体。
(3)收集子叶期胚状体，转移至分化培养基继续在24～26℃、16h光周期下(光照强度约100μmol/m2s1)进行光培养。
(4)分化芽长出后接种至生根培养基，待植株发育良好开瓶炼苗2d，然后移入含水量为60％的营养土(体积比为3∶1的泥炭土和珍珠岩的混合物)中培养。
加倍处理
(5)利用美国BD公司的BD FACSCalibur流式细胞仪对所有幼苗新长出的叶片进行倍性分析，如果是单倍体则进行秋水仙碱加倍处理。在幼苗健壮时采用150mg/L秋水仙碱溶液进行根系浸根处理30h，也可以采用300mg/L秋水仙碱溶液进行根系浸根处理15h。
(6)雪菜植株恢复正常后移入大田进行正常栽培管理。
胚成活率的检验
在分离得到小孢子一个星期后，转移至24℃、16h光照、60r/min条件下振荡培养至胚状体转绿。把已转绿的子叶期胚状体，移入分化固体培养基中，在22℃、16h光周期下(光照强度约100μmol/m2s1)光照培养。胚成活率：即在分化培养基上可健康萌发生长的胚状体数与移入培养基的胚状体总数的比率。本发明的胚状体成活率达到95％。
加倍成功率的检验
经秋水仙碱处理所获得的小植株，重新移入含水量为60％的营养土(体积比为3∶1的泥炭土和珍珠岩的混合物)，1～2周后取新长出叶，用美国BD公司的BD FACSCalibur流式细胞分析仪进行倍性检测，以区分是单倍体、双单倍体及四倍体等。双单倍体加倍成功率为检测所得为双单倍体的植株数与所测再生植株总数的比率。本发明的加倍成功率达到80％。
Claims (1)
1.一种雪菜单倍体育种方法，包括以下步骤：
a.取雪菜主茎或分枝上的花序，在2～4℃诱导12～24个小时后，取花序上单核晚期至双核早期的花蕾进行灭菌；
b.将灭菌后的花蕾放入NLN-13培养液中，捣碎、过滤，滤液离心后，所得沉淀重悬于NLN-13培养液中，得到小孢子悬浮液；
c.将小孢子悬浮液置于30～32℃下热击处理2～3天后，在常温下进行黑暗恒温培养，至肉眼可见胚状体时，再进行黑暗震荡培养，得到子叶期胚状体；
d.收集子叶期胚状体，接种至分化培养基，在常温下光照培养，分化芽长出后接种至生根培养基，生根、炼苗后移入营养土中培养，得到单倍体植株；
e.用浓度为150～300mg/L的秋水仙碱对单倍体植株的根系进行加倍处理15～30h，植株恢复正常后移入大田进行正常栽培。
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