CN103749293B - 芦笋与兴安天门冬种间杂交f1代花药培养再生植株的方法 - Google Patents

芦笋与兴安天门冬种间杂交f1代花药培养再生植株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种芦笋栽培种与兴安天门冬种间杂交F1代花药诱导培养再生植株的方法，属于植物生物技术范畴，该方法包括：选取芦笋种间杂交F1代的花蕾作为花药培养的供体、前处理、消毒花蕾、剥取、接种和培养花药、获得胚状体、接种到再生培养基中培养直接形成再生芽、切取丛生芽接种至生根培养基中进行生根培养、移栽得到再生植株、倍性鉴定等步骤。本方法首次公开了芦笋种间杂交后代花培再生植株的培养方法，首次培育出芦笋种间杂交后代小孢子来源的双单倍体群体，为后代快速稳定、纯化奠定基础。

Description

芦笋与兴安天门冬种间杂交F1代花药培养再生植株的方法
技术领域
本发明涉及一种芦笋种间杂交后代花药培养诱导获得再生植株的培养方法。
背景技术
芦笋（Asparagus officinalis L.），又名石刁柏，属百合科天门冬属宿根性多年生草本植物，是一种深受消费者喜爱的营养保健型高档蔬菜，享有“蔬菜之王”的美誉。目前，我国芦笋产业发展迅速，种植和销售量均跃居世界首位。因许多产区湿热气候和引进品种的生态适应性问题，芦笋茎枯病在我国发病最为严重，全国各芦笋产区都有发生，且南方重于北方，常导致成片绝收，已成为制约中国芦笋产业发展的主要瓶颈之一。当前，国内外所有芦笋栽培品种均无一例外感染茎枯病，广泛搜集与筛选抗源后，发现芦笋近缘野生种兴安天门冬高抗茎枯病，利用其与芦笋栽培品种进行种间杂交，产生的F1对茎枯病具有抗性，其回交后代和F2群体对茎枯病的抗性则有分离，因此，开展芦笋生物技术育种工作对我国芦笋育种体系进一步完善意义重大，而芦笋种间杂交后代花药诱导培养获得再生植株是一项加速芦笋种间杂交后代稳定纯化的有效方法，能明显缩短芦笋抗病育种的进程，具备巨大的市场应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种芦笋栽培种与兴安天门冬种间杂交F1代花药诱导培养获得再生植株的方法，它具有提高育种效率和操作简单方便的优点。
本发明是这样来实现的，一种芦笋栽培种与兴安天门冬种间杂交F1代花药诱导培养获得再生植株的方法，所述方法包括以下步骤：（1）取芦笋种间杂交后代的花蕾作为花药培养的供体，于黑暗条件下4℃处理1-7d，待用；（2）将灭菌后的芦笋种间杂交后代花蕾小心剥开，取花药接入装有添加激素和蔗糖的MS液体培养基的培养皿中，将培养皿在黑暗条件下于30℃～32℃恒温热激处理2～3d后，在黑暗条件下于23℃～28℃培养20～30d，至肉眼可见时，在黑暗条件下于23℃～28℃再振荡培养20～25d，得到需要的胚状体；（3）将所述胚状体接种到含有细胞分裂素的再生培养基中，在每天10～16 h光照和23℃～28℃下培养，形成再生芽；（4）切取丛生芽接种至生根培养基中，将生长健壮的有根苗炼苗后移栽至基质中，得到再生植株。（5）取再生植株的茎尖或根尖进行倍性鉴定。
上述培养基配方分别为：几种培养基所用的基本培养基均为MS，所用的碳源为蔗糖；配制液体培养基即在MS中，添加0.5～0.8 mg﹒L-1的6-苄氨基腺嘌呤6-BA，0.5～1.0 mg﹒L-1的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D，0.1～0.2 mg﹒L-1萘乙酸NAA，6%～7%的蔗糖，pH5.8；固体培养基添加的凝固剂为琼脂，其浓度为0.7%～0.8%，再生培养基即在MS培养基中，添加0.2～0.3 mg﹒L-1的6-苄氨基腺嘌呤6-BA， 3%～4%的蔗糖，pH5.8；生根培养基即在MS培养基中，添加0.05～0.1 mg﹒L-1的萘乙酸NAA，3%～4%的蔗糖，pH5.8。
本发明的技术效果是：（1）选具有优良性状的芦笋种间杂交后代，取其花蕾作为试材，通过花蕾前处理、无菌状态剥取花药、接种花药、培养花药、诱导胚状体再生形成再生植株等关键技术点，高效快速地获得芦笋种间杂交后代小孢子来源的再生植株；（2）本发明首次获得芦笋种间杂交后代花培胚状体，并诱导生根形成再生植株，从开始培养到获得胚状体一般仅用6～8周时间，显著提高选择效率，节省大量人力、物力，为加速芦笋种间杂交后代稳定、纯化及高效选育芦笋抗病品种等提供了新途径。
具体实施方式
通过以下实例，对本发明作进一步的详细说明；
实例一
（1）取芦笋种间杂交后代的花蕾作为花药培养的供体，于黑暗条件下4℃处理1～3d，待用；
（2）将灭菌后的芦笋种间杂交后代花蕾小心剥开，取花药接入装有添加激素和蔗糖的MS液体培养基的培养皿中，将培养皿在黑暗条件下于30℃～31℃恒温热激处理2d后，在黑暗条件下于23℃～28℃培养20～23d，至肉眼可见时，在黑暗条件下于23℃～28℃再振荡培养20～22d，得到需要的胚状体，诱导率达到23.5%；
（3）将所述胚状体接种到含有细胞分裂素的再生培养基中，在每天10～16 h光照和23℃～28℃下培养，形成再生芽；
（4）切取丛生芽接种至生根培养基中，将生长健壮的有根苗炼苗后移栽至基质中，得到再生植株。
（5）取再生植株的茎尖或根尖进行倍性鉴定。
MS液体培养基的基本培养基均为MS，再添加0.5mg﹒L-1的6-苄氨基腺嘌呤6-BA，0.5 mg﹒L-1的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D，0.1 mg﹒L-1萘乙酸NAA和占总质量6%的蔗糖，pH5.8；
再生培养基是在MS培养基中添加0.2mg﹒L-1的6-苄氨基腺嘌呤6-BA，占总质量3%的蔗糖，pH5.8；生根培养基是在MS培养基中添加0.05～0.1 mg﹒L-1的萘乙酸NAA，占总质量3%的蔗糖，pH5.8；再生培养基和生根培养基还添加有作为凝固剂为琼脂，其占总质量的0.7%。
实例二
（1）取芦笋种间杂交后代的花蕾作为花药培养的供体，于黑暗条件下4℃处理4～5d，待用；
（2）将灭菌后的芦笋种间杂交后代花蕾小心剥开，取花药接入装有添加激素和蔗糖的MS液体培养基的培养皿中，将培养皿在黑暗条件下于31℃～32℃恒温热激处理2d后，在黑暗条件下于23℃～28℃培养20～25d，至肉眼可见时，在黑暗条件下于23℃～28℃再振荡培养20～23d，获得需要的胚状体，诱导率达到22%；
（3）将所述胚状体接种到含有细胞分裂素的再生培养基中，在每天10～16 h光照和23℃～28℃下培养，形成再生芽；
（4）切取丛生芽接种至生根培养基中，将生长健壮的有根苗炼苗后移栽至基质中，得到再生植株。
（5）取再生植株的茎尖或根尖进行倍性鉴定。
MS液体培养基的基本培养基均为MS，再添加0.7 mg﹒L-1的6-苄氨基腺嘌呤6-BA，0.8 mg﹒L-1的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D，0.15 mg﹒L-1萘乙酸NAA和占总质量6%的蔗糖，pH5.8；
再生培养基是在MS培养基中添加0.2 mg﹒L-1的6-苄氨基腺嘌呤6-BA，占总质量～4%的蔗糖，pH5.8；生根培养基是在MS培养基中添加0.08 mg﹒L-1的萘乙酸NAA，占总质量4%的蔗糖，pH5.8；再生培养基和生根培养基还添加有作为凝固剂为琼脂，其占总质量的0.8%。
实例三
（1）取芦笋种间杂交后代的花蕾作为花药培养的供体，于黑暗条件下4℃处理6～7d，待用；
（2）将灭菌后的芦笋种间杂交后代花蕾小心剥开，取花药接入装有添加激素和蔗糖的MS液体培养基的培养皿中，将培养皿在黑暗条件下于31℃～32℃恒温热激处理3d后，在黑暗条件下于23℃～28℃培养25～30d，至肉眼可见时，在黑暗条件下于23℃～28℃再振荡培养22～25d，获得需要的胚状体，诱导率达到20.5%；
（3）将所述胚状体接种到含有细胞分裂素的再生培养基中，在每天10～16 h光照和23℃～28℃下培养，形成再生芽；
（4）切取丛生芽接种至生根培养基中，将生长健壮的有根苗炼苗后移栽至基质中，得到再生植株。
（5）取再生植株的茎尖或根尖进行倍性鉴定。
MS液体培养基的基本培养基均为MS，再添加0.8 mg﹒L-1的6-苄氨基腺嘌呤6-BA， 1.0 mg﹒L-1的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D， 0.2 mg﹒L-1萘乙酸NAA和占总质量7%的蔗糖，pH5.8；
再生培养基是在MS培养基中添加0.3 mg﹒L-1的6-苄氨基腺嘌呤6-BA，占总质量4%的蔗糖，pH5.8；生根培养基是在MS培养基中添加0.1 mg﹒L-1的萘乙酸NAA，占总质量4%的蔗糖，pH5.8；再生培养基和生根培养基还添加有作为凝固剂为琼脂，其占总质量的0.7%。

Claims (1)

1.一种芦笋与兴安天门冬种间杂交F1代花药培养再生植株的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
（1）花蕾前处理：
取芦笋种间杂交优良后代的花蕾作为花药培养的供体，于黑暗条件下4℃处理1～7d，待用；
（2）花药的剥取和培养：
将灭菌后的芦笋种间杂交后代花蕾小心剥开，取花药接入装有添加激素和蔗糖的MS液体培养基的培养皿中，将培养皿在黑暗条件下于30℃～32℃恒温热激处理2～3d后，在黑暗条件下于23℃～28℃培养20～30d，至肉眼可见时，在黑暗条件下于23℃～28℃再振荡培养20～25d，获得胚状体；
（3）胚状体的再生：
将所述胚状体接种到含有细胞分裂素的再生培养基中，在每天10～16 h光照和23℃～28℃下培养，形成再生芽；
（4）再生植株的获得：
切取丛生芽接种至生根培养基中，将生长健壮的有根苗炼苗后移栽至基质中，得到再生植株；
（5）倍性鉴定：
  采用去壁低渗火焰干燥法处理再生植株的茎尖或根尖，进行染色体计数，以确定再生植株的倍性；
所述MS液体培养基的基本培养基为MS，再添加0.5～0.8 mg﹒L-1的6-苄氨基腺嘌呤6-BA，0.5～1.0 mg﹒L-1的2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D，0.1～0.2 mg﹒L-1萘乙酸NAA和占总质量6%～7%的蔗糖，pH5.8；
所述再生培养基是在MS培养基中添加0.2～0.3 mg﹒L-1的6-苄氨基腺嘌呤6-BA，占总质量3%～4%的蔗糖，pH5.8；
所述生根培养基是在MS培养基中添加0.05～0.1 mg﹒L-1的萘乙酸NAA，占总质量3%～4%的蔗糖，pH5.8；
所述再生培养基和生根培养基还添加有作为凝固剂的琼脂，其占总质量的0.7%～0.8%。
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