WO2019050042A1 - べと病抵抗性キャベツ及びその育成方法 - Google Patents

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cabbage
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resistance
resistant
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鈴木　隆夫
敦 泉田
哲也 平本
謙二 竹林
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株式会社サカタのタネ
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    • C12Q2600/13—Plant traits

Definitions

  • the present invention relates to cabbage which is resistant to downy mildew and a method for growing the cabbage. More specifically, the present invention relates to a cabbage having a downy mildew resistance gene which is located in the vicinity of the gene locus shown by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7, and a method for growing the same.
  • Downy mildew in cruciferous crops is caused by Hyaloperonospora brassicae, which is a kind of filamentous fungus, and includes Brassica oleracea species such as cabbage, cabbage, cauliflower, cauliflower, broccoli, kohlrabies, etc. It causes damage to many crops such as Brassica rapa species such as Chinese cabbage, turnip and Komatsuna, and Brassica napus species such as rapeseed.
  • Symptoms of this disease are mainly found in the leaves, and yellowish to pale brown border unclear lesions are formed and gradually spread, and the leaves eventually die, thus affecting the growth (Fig. 1). .
  • brown or black discoloration occurs inside and outside the tissue, which significantly reduces commercial value.
  • the spread of the disease is rapid and develops into a large damage, so that control with a drug such as a bactericide is usually performed.
  • Cabbage (B. oleracea var. Capitata), which is one of the most important crops of Brassica oleracea, has various varieties and varieties, which are grown in various countries around the world. ing.
  • Non-Patent Document 1 J. Amer Soc Hort Sci (2001) vol 126 p 727
  • Non-Patent Document 2 Euphytica (2002) vol 128 p 405
  • Euphytica (2003) vol 131 p 65 Non-Patent Document 3
  • Broccoli is crossbred because it is the same type of brassica or oleracea as cabbage, but since it has many unnecessary traits when viewed from the side of cabbage, it is very difficult to handle as a breeding material.
  • An object of the present invention is to provide a novel cabbage having excellent resistance to downy mildew and a method for cultivating such cabbage.
  • the present inventors have now developed markers linked to downy mildew resistance factors, and by using them, from a combination of broccoli and cabbage, it is a commodity that is high as a cabbage while having downy mildew resistance factors. Succeeded in nurturing a line of value.
  • the Brassica oleracea plants obtained by crossing broccoli and cabbage by the present inventors appeared as wild species in the first generation of hybrids and backcrossings. We then selected back markers linked to downy mildew resistance and applied a genome-wide marker to backcross the genome region unrelated to downy mildew to a cabbage-type genotype was successful in growing cabbage that is highly resistant to downy mildew.
  • the present inventors have found a broccoli strain having mildew resistance corresponding to a wide range of races, and developed a marker linked to the mildew resistance factor possessed by the strain and utilized them. Proved that cabbage lines with high industrial value can be grown.
  • By using the method for growing mildew-resistant cabbage or cabbage that is resistant to downy mildew provided by the present invention it is possible to reduce mildew resistance to cabbage which has conventionally been susceptible to downy mildew. It becomes possible to grant.
  • the present invention is based on these findings.
  • ⁇ 2> The downy mildew-resistant cabbage according to ⁇ 1> or a progeny thereof having a downy mildew-resistance gene which is located in the vicinity of a locus represented by any one or more of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 .
  • ⁇ 3> The downy mildew resistant cabbage according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, which has a downy mildew resistance gene detectable by any one or more of the primers having the base sequences shown in SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 21 Or later generations.
  • ⁇ 6> The downy mildew resistant cabbage according to any one of the above ⁇ 1> to ⁇ 4>, which is a downy mildew resistant gene found in a cabbage cultivar specified by Accession No. FERM BP-22344 The next generation.
  • ⁇ 7> A part of the cabbage of any one of the above ⁇ 1> to ⁇ 6> or a plant of the later generation.
  • ⁇ 8> The cabbage of any one of the above ⁇ 1> to ⁇ 6> or a seed of a progeny thereof.
  • a method for growing downy mildew resistant cabbage comprising introducing downy mildew resistance to a desired cabbage from a Brassica oleracea plant resistant to downy mildew.
  • Downy mildew caused by downy mildew resistant gene that is located in the vicinity of a locus shown in any one or more of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 from Brassica oleracea plants having resistance to downy mildew A method for growing downy mildew resistant cabbage, which comprises introducing resistance into desired cabbage.
  • ⁇ 14> The method for growing ⁇ 10> or ⁇ 11>, wherein the Brassica oleracea plant having resistance to downy mildew is a cabbage variety specified by Accession No. FERM BP-22344.
  • ⁇ 17> The method according to ⁇ 16>, wherein the primer is represented by any one or more of SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 21.
  • a marker capable of detecting downy mildew resistance loci in Brassica oleracea plants which has any one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7
  • a primer set capable of detecting downy mildew resistance loci in Brassica oleracea plants comprising any one or more of the primers having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 21.
  • a method for detecting downy mildew resistance in Brassica oleracea plants including:
  • the mildew-resistant cabbage of the present invention has excellent resistance to downy mildew caused by Hyaloperonospora brassicae . Further, by using the mildew-resistant cabbage according to the present invention as a material, it is possible to further grow a new mildew-resistant cabbage line. Furthermore, by using the marker linked to downy mildew resistance according to the present invention, downy mildew resistance can be detected or selected without carrying out a vaccination test. By cultivating cabbage lines grown according to the present invention, cabbage cultivation in areas where cultivation is considered difficult due to the occurrence of downy mildew becomes possible, and the labor and cost of drug dispersion in conventionally required cultivation are reduced. can do. In addition, the mildew-resistant cabbage according to the present invention makes it possible to ship fruits and vegetables reduced in the number of times of drug dispersion, and also to reduce the incidence of diseases, so that fruits and vegetables having a high quality rate are high. It is possible to harvest
  • Example 5 The indication of the onset disease score in the field trial manufacture of Example 5 is shown.
  • strain grown by this invention (Example 5) is shown. It shows the appearance of “CB-20” (the original parent line) and an isogenic line into which a mildew disease resistance factor has been introduced.
  • FIG. 8 shows the nucleotide sequences of markers (DMTLR-1 to DMTLR-7).
  • FIG. 8 shows the nucleotide sequences of markers (DMTLR-1 to DMTLR-7).
  • FIG. 8 shows the nucleotide sequences of markers (DMTLR-1 to DMTLR-7).
  • FIG. 8 shows the nucleotide sequences of markers (DMTLR-1 to DMTLR-7).
  • FIG. 8 shows the nucleotide sequences of markers (DMTLR-1 to DMTLR-7).
  • FIG. 8 shows the nucleotide sequences of markers (DMTLR-1 to DMTLR-7).
  • the present invention relates to cabbage which is resistant to downy mildew (dwarf disease resistant cabbage) or its progeny.
  • progeny also includes crosses obtained by crossing the downy mildew-resistant cabbage according to the present invention with a Brassica oleracea plant that can be crossed with the plant. Therefore, for example, by using the downy mildew-resistant cabbage according to the present invention as a pollen parent (male parent) and crossing the plant with a Brassica oleracea plant as a seed parent (female parent), as "progeny”. What is obtained is also included.
  • progeny also includes, for example, plants by cell fusion of a mildew-resistant cabbage according to the present invention and a plant that can be fused with the cabbage, and interspecific hybrid plants.
  • Brusha oleracea plant means a plant of the family Brassicaceae, which is a plant of the genus Brassica oleracea, and here, B. oleracea var. Capitata (cabbage), B. Oleracea var. Italica (broccoli), B. oleracea var. Botrytis (cauliflower), B. oleracea var. Gemmifera (male cabbage), B. oleracea var. Gongyloides (callrabies), B. oleracea var. Acephara (haboticales) And B. oleracea var. Albograbra (Kyran) and the like.
  • “cabbage” is a plant species belonging to the Brassica oleracea species and is a plant species classified into B. oleracea var. Capitata.
  • downy mildew means a disease caused by a fungus belonging to the family Peronosporaceae among oomycetes, preferably a disease caused by Hyaloperonospora brassicae . Therefore, resistance to downy mildew here means resistance to diseases caused by such fungi.
  • the mildew-resistant cabbage according to the present invention is resistant to downy mildew (preferably Hyaloperonospora brassicae ), and exhibits single factor dominant expression.
  • downy mildew preferably Hyaloperonospora brassicae
  • the “parental line” is a line grown to produce a hybrid variety, and a hybrid variety is usually prepared by combining two or more parent strains having different phenotypes as materials. .
  • the "downy mildew resistance" in the present invention means resistance to the downy mildew fungus Hyaloperonospora brassicae , and more specifically, based on a factor which is located in the vicinity of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 is there. That is, according to a preferred embodiment of the present invention, the downy mildew-resistant cabbage or the progeny thereof according to the present invention is located near the locus shown in any one or more of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7. It has a disease resistance gene.
  • the base sequences represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 are within a certain range of sequence identity, or It includes cases where it is in a range having partial mutations.
  • Those skilled in the art can easily understand the equivalent sequence coverage of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 itself. Therefore, for example, “shown in any one or more of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7” is used in a meaning which also includes the case where it is shown in any one or more of the base sequences of (a) to (c) below: Be done.
  • A any one or more of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7,
  • B any one or more base sequences having a sequence identity of 95% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7, and
  • c the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 Any one or more base sequences in which one or more bases of S are deleted, substituted, inserted and / or added.
  • the downy mildew-resistant cabbage or the progeny thereof according to the present invention is a gene represented by any one or more of the nucleotide sequences shown in (a) to (c) described above It can be said that it has a downy mildew resistance gene that sits in the vicinity of the locus.
  • “having a sequence identity of 95% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7” means the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 and BLAST , At least 95%, preferably at least 96%, more preferably at least 97%, as calculated using known algorithms for homology searches such as FASTA (eg, using default or default parameters) Even more preferably, it comprises a SEQ ID NO having a sequence identity of 98%, particularly preferably at least 99%.
  • sequence identity means, for example, when two base (nucleotide) sequences are aligned (however, gaps may or may not be introduced), the same as the total number of bases including gaps. It refers to the percentage (%) of the number of bases.
  • a plurality of one or more bases of the base sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 are deleted, substituted, inserted and / or added”. Is, for example, about 10, preferably 8, more preferably 6, more preferably 5, still more preferably 4, more preferably 3, more preferably 2, more preferably 2. It is preferably one, particularly one.
  • SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 can be SEQ ID NO: 22 to 28, respectively.
  • SEQ ID NOs: 22 to 28 contain sequences outside the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 7 (including the sequences of the primers) sandwiched by the primers, and the present inventors found for the first time in Example 2 described later It is
  • SEQ ID NOs: 22 to 28 only the portion of SEQ ID NOs: 1 to 7 contained in these sequences is the base sequence of (a) to (c) described above.
  • SEQ ID NOs: 22 to 28 are also used in the meaning including the case represented by any one or more of the nucleotide sequences of (a ′) to (c ′) below: Ru.
  • a ' any one or more of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 22 to SEQ ID NO: 28,
  • B ' any one or more base sequences having a sequence identity of 95% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 to SEQ ID NO: 28, and
  • c' shown in SEQ ID NO: 22 to SEQ ID NO: 28 Any one or more base sequences in which one or more bases of the base sequence are deleted, substituted, inserted and / or added.
  • “having a sequence identity of 95% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 22 to SEQ ID NO: 28” means the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 22 to SEQ ID NO. At least 95%, preferably at least 96%, more preferably at least 97 as calculated using known algorithms for homology searches such as BLAST, FASTA etc. (eg using default or default parameters) %, Even more preferably 98%, particularly preferably at least 99% of SEQ ID NO.
  • nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 22 to SEQ ID NO: 28 have been deleted, substituted, inserted and / or added”.
  • a plurality of is, for example, about 10, preferably 8, more preferably 6, more preferably 5, still more preferably 4, more preferably 3, more preferably 3. Two, particularly preferably one.
  • “nearby” refers to the relationship between the position of the marker and the disease resistance gene, and the ordinary knowledge of those skilled in the art, to what extent the distance can be easily achieved by those skilled in the art. It is understandable. For example, depending on analysis conditions, it may be, for example, a distance of about 10 cM or less (e.g., 7 cM).
  • a marker capable of detecting downy mildew resistance loci in Brassica oleracea plants which has any one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 Provided. Furthermore, downy mildew resistance in Brassica oleracea plants, which comprises assaying for the presence of downy mildew resistance genes using any one or more markers of the DNA sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 Also provided is a method of detecting
  • any one of the base sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 is the above-mentioned (a) to (c) as long as downy mildew resistance genes can be identified. It may also include any one of the nucleotide sequences shown in
  • the detection of these markers can be performed according to methods known to those skilled in the art, such as PCR method, real-time PCR method, RFLP method, LAMP method, SNPs genotyping chip method and the like.
  • the DNA sequences represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 have a downy mildew resistance gene detectable with one or more primers or primer pairs capable of amplification.
  • the downy mildew-resistant cabbage or progeny thereof according to the present invention can be detected with any one or more of the primers having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 21 It has a resistance gene.
  • These primers are hereinafter sometimes referred to as "DMTLR markers".
  • the DNA marker "having" the nucleotide sequence means that the marker has the nucleotide sequence.
  • the DNA marker is substituted for any one or several (for example, 1, 2 or 3, preferably 1 or 2, more preferably 1) of the bases in the corresponding base sequence, It means that it may be deleted, added or deleted, or it may be a sequence that includes the corresponding base sequence as a part and retains a predetermined property. In such a case, the word “having” may be restated as "including.” In addition, in the case where substitution, deletion, addition or deletion of one base is permitted, "having" may be reworded as "consisting essentially of".
  • the resistance to downy mildew mentioned here can be detected and confirmed by performing PCR using the primers shown by these nucleotide sequences 8 to 21.
  • downy mildew resistance loci in Brassica oleracea plants can be detected, which comprises any one or more of the primers having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 21 Primer sets are provided.
  • a primer having any one or more of the markers having the base sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 or the base sequences shown in SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 21 There is provided a method of detecting downy mildew resistance in B. oleracea plants comprising using any one or more of If these DNA markers are used, it is possible to efficiently grow new cabbage lines resistant to downy mildew without performing selection by inoculation test.
  • the mildew-resistant cabbage according to the present invention has the following features. (1) Specifically, a plant having the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 in the vicinity of a downy mildew resistance locus, and a plant exhibiting downy mildew resistance by having the allele thereof is there. (2) By using a line having the above sequence as a mating material, it becomes possible to grow a new cabbage parent line having mildew disease resistance.
  • the DNA sequence located in the vicinity of may be selected, and a new marker may be designed and used for selection of resistant plants. Furthermore, by using markers near the downy mildew resistance locus, it is also possible to select individuals from which non-target traits linked to the downy disease resistance locus have been removed. (3) The cabbage of the present invention thus developed is resistant to the downy mildew, Hyaloperonospora brassicae, and thus reduces the labor and cost of disinfectant application for disease control during cultivation. be able to.
  • the mildew-resistant cabbage or progeny thereof may be any of the following: 1) Downy mildew resistant cabbage, or progeny thereof, which is a downy mildew resistant gene is found in a broccoli cultivar specified by Accession No. FERM BP-22343; 2) A downy mildew resistant cabbage, or a progeny thereof, wherein the downy mildew resistance gene is found in a cabbage cultivar specified by Accession No. FERM BP-22344; and 3) under Accession No. FERM BP-22344 Hybrid first generation cabbage having resistance to downy mildew identified.
  • the downy mildew resistance gene is "to be found” means that the downy mildew resistant cabbage or a progeny has the gene present in the specific cultivar. That is, the downy mildew resistant gene is found in the broccoli cultivar specified by accession number FERM BP-22343, and the downy mildew resistant cabbage, or the progeny thereof is specified by accession number FERM BP-22343 As long as it has a downy mildew resistance gene found in the broccoli cultivar to be used, it is a meaning including not only the broccoli cultivar specified by Accession No. FERM BP-22343 but any one.
  • the present invention also relates to the downy mildew-resistant cabbage according to the present invention or a part of the progeny plants or their seeds.
  • part of plant body includes organs such as flowers, leaves, stems and roots, or parts or tissues thereof, cells from these organs or tissues, and aggregates of cells.
  • a method for growing downy mildew-resistant cabbage According to the present invention, the method for growing downy mildew-resistant cabbage according to the present invention is desired to be used for downy mildew resistance from Brassica oleracea plants having resistance to downy mildew. Including the introduction of cabbage.
  • the "Brushka oleracea plant having resistance to downy mildew” is resistant to downy mildew, preferably downy mildew caused by Hyaloperonospora brassicae , against the onset of the disease and the progression of the disease after infection. It means a Brassica oleracea plant having, for example, an inoculation test of a prepared downy mildew (preferably Hyaloperonospora brassicae ) can be performed to determine whether it has resistance or not. More preferably, in this inoculation test, the plant-held resistance factor is a Brassica oleracea plant that exhibits single factor dominant expression.
  • Example 1 an inoculation test is performed according to Example 1 to be described later, and it is confirmed whether it is a "Brushka oleracea plant having resistance to downy mildew" that can be used in the growing method of the present invention. Can.
  • the "Brushka oleracea plant having resistance to downy mildew" is a Brassica oleracea plant other than cabbage.
  • the “Brushka oleracea plant having resistance to downy mildew” is a broccoli variety specified by Accession No. FERM BP-22343 or a cabbage variety specified by Accession No. FERM BP-22344.
  • introducing downy mildew resistance to a desired cabbage means downy mildew resistance possessed by the "Brushka oleracea plant having resistance to downy mildew”. Is introduced into the desired cabbage so that the cabbage becomes resistant to downy mildew.
  • the “desired cabbage” is a cabbage which is not resistant to downy mildew, and can be crossed with the "Brushka oleracea plant having resistance to downy mildew", which is resistant to downy mildew It means cabbage that you want to introduce. Such cabbages have useful traits as cabbages.
  • the downy mildew resistance referred to herein can be confirmed by a known means such as a downy mildew inoculation test, more specifically, it is shown in any one or more of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 It is due to downy mildew resistance genes that are located near the gene locus.
  • downy mildew resistance means that a gene capable of developing downy mildew resistance is introduced into a desired cabbage.
  • introduction is carried out by crossing the "bristula oleracea plant having resistance to downy mildew" with the desired cabbage, and the desired crossbreeding from the cross progeny obtained. It can be carried out by selecting those having disease resistance and further conducting backcrossing with the cabbage as a backcrossing parent.
  • SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 Based on the DNA marker prepared based on the public information, DNA sequences located in the vicinity of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 may be selected, and markers may be newly designed and used for selection of resistant plants. Such markers include markers having any one of the base sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 described above, and primers having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 21 . These confirmation means can also be used in the process of backcrossing to select for downy mildew resistant progeny.
  • any one or more markers of any one of the DNA sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 or one or more markers capable of amplifying the DNA sequence Using the following primers or primer pairs to assay for the presence of downy mildew resistant genes. Furthermore, more preferably, the primer is any one or more of SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 21.
  • the breeding method of the present invention carries out the introduction of downy mildew-resistant cabbage by continuously backcrossing the cabbage. More specifically, the breeding method of the present invention comprises crossing a Brassica oleracea plant having resistance to downy mildew with a desired cabbage, selecting a cross progeny having downy mildew resistance, and further selecting the desired cabbage. As a backcross parent, includes continuous backcrossing.
  • backcrossing When backcrossing is performed, it is generally desirable to perform about 5 to 7 backcrossings.
  • genome-wide DNA markers can be used to approach the backcrossing parent early.
  • BC1F1 first generation of backcross
  • the genome substitution rate of individuals is different, and if the size of the population is expanded, 90% or more of the genomic region may be the same gene as the return parent in some individuals. It is also possible to obtain individuals exhibiting a type. By selecting such individuals, it becomes possible to align regions other than the mildew disease resistance locus at the early stage with the same number of generations as the parent with a small number of generations.
  • a DNA marker based on the information may be prepared to perform genotyping of each locus .
  • RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
  • SRAP sequence-related amplified polymorphism
  • AFLP Amplified fragment length polymorphism
  • the downy mildew-resistant lines thus grown can be used not only as direct varieties, but also as parents or one-parent in the F1 seeding system.
  • a method of producing an F1 strain which uses a mildew-resistant strain obtained by the breeding method of the present invention as a parent strain or a strain of one parent, and such Also provided is a method of seeding F1 seed.
  • Example 1 Two species of downy mildew strains (strain Dm-A and strain Dm-B (of which strain Dm-B affects more varieties), using the broccoli genetic resources owned by Sakata seed, Inc. as materials Two lines (“BR-23" and "BR-35") of broccoli showing resistance to both were found.
  • F1 means a hybrid first generation
  • BC1 means a generation in which backcrossing is performed once. That is, “BC1F1” means a generation in which backcrossing was further performed once through hybrid first generation.
  • the degree of onset was evaluated according to the following onset score for the first to third leaves of each individual. 0: no symptoms, 1: no brown spots, no sporulation, 2: slight sporulation on brown lesions, 3: Moderate sporulation, 4: abundant sporulation.
  • Example 2 In Table 1, the F2 population (Mapping population -1, -2) and the BC1 F1 population (Mapping population -3, -4) in which resistance and sensitivity were found to be separated were used as materials by the Bulked Segregant Analysis method (BSA method) We searched for RAPD markers.
  • BSA method Bulked Segregant Analysis method
  • RAPD primers 1180 types of 10-mer primers designed by Operon and 460 types of 12-mer primers designed by BEX were used.
  • For bulk DNA 4 resistant individuals and 4 susceptible individuals are selected from the population of Mapping population-4, and using those DNAs, bulk DNA of resistant individuals and bulk DNA of susceptible individuals was produced.
  • RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA
  • a DNA fragment amplified by RAPD was excised from an agarose gel and cloned, and then the nucleotide sequence was analyzed.
  • the base sequences of the seven markers (DMTLR-1 to DMTLR-7) described above were identified (SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7, respectively) (FIG. 8).
  • the sequences of SEQ ID NOs: 22 to 28 are first specified, and these sequences each have the sequence of SEQ ID NOs: 1 to 7 (including the sequence of the SCAR primer) sandwiched between SCAR primers. there were.
  • the underlined sequences in FIG. 8 are the SCAR primers, and the sequences (including the SCAR primers) sandwiched by the SCAR primers correspond to SEQ ID NOs: 1 to 7, respectively.
  • pBluescript II SK obtained from Stratagene
  • JM109 E. coli JM109, obtained from Toyobo Co., Ltd.
  • a DNA sequencer ABI3130 manufactured by Applied Biosystems was used for the analysis of the base sequence.
  • Primers were designed using “Primer 3” software (Primer design support software for polymerase chain reaction (PCR), open source software) so that the target sequence can be specifically amplified for markers whose nucleotide sequences have been decoded. (SEQ ID NOS: 8 to 21) (Table 2). Moreover, the result (electrophoresis figure) of the electrophoresis test of these each primer (marker) is shown in FIG. In addition, the marker developed in this way is called "a DMTLR marker" in this specification.
  • Example 3 Using the same F2 population as Mapping population-2 used in Example 2, the resistance response to downy mildew strain Dm-A was also investigated. The size of the F2 population was 240 individuals (mapping population-5), and the responses of each individual to Dm-A were examined. As a result, separation as shown in Table 3 was shown. The inoculation test with strain Dm-A was carried out and evaluated in the same manner as the inoculation test of Example 1.
  • Mapmaker 2.0 (Whitehead Institute), which is software for analyzing the linkage relation of markers, was used to analyze the linkage relation between phenotypes in the group and each marker.
  • Example 4 In order to confirm whether or not the strain "BR-35" different from the resistant strain "BR-23" analyzed in Example 2 has the same resistance factor as the strain "BR-23”, a sensitive strain An F2 segregating population with “BR-13” was generated and an inoculation test with strain Dm-A was performed (Table 4). The inoculation test with strain Dm-A was carried out and evaluated in the same manner as the inoculation test of Example 1.
  • Table 5 shows the results of classifying 180 individuals of mapping population-6 in Table 4 according to the genotype of the DNA marker DMTLR-1.
  • the downy mildew resistance gene possessed by "BR-35” can be found in broccoli F1 cultivar "Sawa Yutaka” having "BR-35" as one parent.
  • Example 5 Broccoli lines "BR-23” and “BR-35” owned by Sakata Seeds are used as materials for resistance to downy mildew, and four varieties of cabbage are used as cabbage to introduce the resistance
  • One line each “CB-20”, “CB-35”, “CB-23” or “CB-97” is selected from each line, cold ball, spring line, ball line), and is used as a backcross parent line The mating test was done.
  • BC backcrossing
  • the broccoli lines "BR-23” and “BR-35” are crossed with cabbage lines “CB-20”, “CB-35”, “CB-23” and “CB-97” to produce F1 And DNA selection with DMTLR markers and continuous backcrossing were performed.
  • selection with 20 types of RAPD primers was carried out, and in each backcross line, each back parent line “CB-20”, “CB-35”, “CB-23” And individuals showing a genotype close to "CB-97" were selected.
  • these RAPD markers are backcross parent lines in BC2F1 generation in “CB-20” and BC3F1 generation in other “CB-35”, “CB-23” and “CB-97”. Individuals that matched completely with were selected.
  • resistance and sensitivity are determined by the DMTLR marker, and for each genotype, either the Sakae Kakegawa Research Center or the Sakata Tanimitsu Breeding Center along with the respective back parent lines.
  • the prototype was made in the field of either or both.
  • Table 6 shows the result of trial manufacture in the field of a line in which downy mildew resistance factor was introduced to cabbage line "CB-20" and the evaluation result of the onset degree of downy mildew.
  • An individual who is determined to have a downy mildew resistance factor by a DMTLR marker in a separated generation during backcrossing is determined to be resistant even if it is heterozygous and not to have a downy mildew resistance factor. The individual showed sensitivity.
  • the phenotype also showed a grass figure very close to the back parent line "CB-20" of the deep leaf system.
  • each disease level means the following condition. Disease onset degree 0: no lesion, 1: Fewer spots, 2: Medium number of lesions, 3: There are many lesions.
  • Example 6 Furthermore, "DMR-CB-20" (the DM cabbage line grown above) which has been conferred with downy mildew resistance is used as a pollen parent in another promising cabbage line "CB-5" cytoplasmic male sterile line As a seed parent, F1 (breed trial name: SK3-005) was produced. The F1 strain was continuously manufactured at Sakata's Seed Kimitsu Breeding Station, and it was confirmed that downy mildew resistance was stably expressed. Thus, the first breeding of downy mildew resistant F1 cabbage cultivars was achieved.
  • Patent Organism Depositary Center Korean, Kisarazu City, Chiba Prefecture 2-5 -8 Room 120
  • original deposit International Deposited (Kiza, Kisarazu City, Chiba Prefecture 2-5 -8 Room 120) has been internationally deposited (original deposit) (Indication for identification given by the depositor: SSC-CSB-17-001, Accession No .: FERM BP-22344).
  • the original F1 cultivar (the F1 cultivar obtained using the original parent line "CB-20") and the newly obtained cabbage F1 cultivar having the downy mildew resistance obtained (the downy mildew resistant)
  • the introduced F1 varieties were compared.

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Abstract

本発明は、べと病に対する抵抗性を有するキャベツ、またはその後代に関する。また本発明は、べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物から、べと病抵抗性を、所望のキャベツに導入することを含む、べと病抵抗性キャベツの育成方法に関する。本発明によれば、べと病に対して高い抵抗性を示しつつ、キャベツとして高い商品価値を有する新規なキャベツ系統およびそのようなキャベツを育成することができる。

Description

べと病抵抗性キャベツ及びその育成方法 関連出願の参照
　本願は、先行する日本国特許出願である特願２０１７－１７３８２３号（出願日：２０１７年９月１１日）に基づくものであって、その優先権の利益を主張するものであり、その開示内容全体は参照することによりここに組み込まれる。
　本発明は、べと病抵抗性を付与したキャベツ及びその育成方法に関する。詳しくは、本発明は、配列番号１～配列番号７で示される遺伝子座の近傍領域に座乗するべと病抵抗性遺伝子を有するキャベツ、及びその育成方法に関する。
　アブラナ科作物におけるべと病（Downy mildew）は、糸状菌の一種であるHyaloperonospora brassicaeにより引き起こされる病害であり、キャベツ、メキャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、コールラビー等をはじめとするブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea）種、ハクサイ、カブ、コマツナ等のブラシカ・ラパ（Brassica rapa）種、及び、ナタネ等のブラシカ・ナプス（Brassica napus）種など、多くの作物に対して被害をもたらす。
　この病害の症状は、主に葉で見られ、黄色から淡褐色の境界不明瞭な病斑が形成され、次第に拡大し、やがて葉は枯れ落ちてしまうため、生育に悪影響を及ぼす（図１）。また、ブロッコリーやカリフラワーの花蕾や、カブやダイコンの根部に感染すると、組織内外に褐色または黒色の変色を引き起こし、商品価値を著しく低下させる。特に湿度の高い環境では病気の広がりが早く大きな被害に発展するため、通常は殺菌剤等の薬剤による防除が行われている。
　ブラシカ・オレラセアの中で最も重要な作物の一つであるキャベツ（B. oleracea var. capitata）には、様々な品種群が存在し、世界各国で、その土壌や気候にあった品種が栽培されている。
　しかしながら、キャベツには、べと病に対して、遺伝様式が不明で量的因子によると推察される中程度の抵抗性を示す系統は存在していたものの、単因子優性の抵抗性因子によるべと病抵抗性品種の存在は知られていなかった。
　このため、べと病が多発する地域では、病害を低減させるために薬剤による防除を行う必要があり、そのために多大な労力やコストが費やされていた。このため、抵抗性育種素材の開発、及び抵抗性品種の開発が望まれていた。
　ところが、このような強い要望があったにもかかわらず、キャベツにおいてべと病抵抗性の品種は、本発明者等の知る限りこれまで作出されてこなかった。これは、キャベツの遺伝資源の中に、有用なべと病抵抗性の因子が存在しなかったことによると考えられる。
　一方で、キャベツの近縁種であるブロッコリー（B. oleracea var. italica）については、べと病の抵抗性因子の遺伝解析に関して複数報告されている（例えば、J.Amer Soc Hort Sci (2001) vol126 p727（非特許文献１）、Euphytica (2002) vol128 p405（非特許文献２）、及びEuphytica (2003) vol131 p65（非特許文献３））。
　しかしながら、これらのブロッコリーにおける抵抗性因子は、これまで、キャベツの育種に利用されてこなかった。これは、キャベツとブロッコリーの両者の形態的特徴がかけ離れていることによると考えられる。ブロッコリーはキャベツと同じブラシカ・オレラセア種であるため交配可能ではあるが、キャベツの側から見ると不要な形質を多々有しているため、育種素材としては非常に扱い難いものであったからである。
M. Wang et al., J.Amer Soc Hort Sci (2001) vol.126 pp727-, "Inheritance of True Leaf Stage Downy Mildew Resistance in Broccoli" M. W. Farnham et al., Euphytica (2002) vol.128 pp405-, "A single dominant gene for downy mildew resistance in broccoli". P. S. Coelho et al., Euphytica (2003) vol.131 pp65-, "Inheritance of downy mildew resistance in mature broccoli plants"
　本発明は、べと病に対する優れた抵抗性を有する新規キャベツ及びそのようなキャベツの育成方法を提供することをその目的とする。
　本発明者らは今般、べと病抵抗性因子に連鎖するマーカーを開発し、それを利用することによって、ブロッコリーとキャベツの組み合わせから、べと病抵抗性因子を有しつつ、キャベツとして高い商品価値を有する系統を育成することに成功した。
　本発明者等によるブロッコリーとキャベツの交配により得られたブラシカ・オレラセア植物は、雑種当代や戻し交配第一代では野生種のような姿をしていた。本発明者らはその後、べと病抵抗性に連鎖したマーカーの選抜、及び、ゲノムワイドなマーカーの適用により、べと病とは無関係なゲノム領域をキャベツ型の遺伝子型に置き換えるための戻し交配を繰り返すことによって、べと病に対して高い抵抗性を示すキャベツを育成することに成功した。
　すなわち、本発明者らは、幅広いレースに対応したべと病抵抗性を有するブロッコリー系統を見出し、且つ、その系統が有するべと病抵抗性因子に連鎖するマーカーを開発し、それらを利用することによって、産業的利用価値の高いキャベツ系統が育成できることを証明した。本発明により提供されるべと病抵抗性のキャベツ、若しくはべと病抵抗性キャベツの育成方法を利用することで、従来、べと病に対して感受性であったキャベツにべと病抵抗性を付与することが可能となる。
　本発明はこれらの知見に基づくものである。
　すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　べと病に対する抵抗性を有するキャベツ、またはその後代。
＜２＞　配列番号１～配列番号７のいずれか１以上で示される遺伝子座の近傍に座乗するべと病抵抗性遺伝子を有する、前記＜１＞のべと病抵抗性キャベツ、またはその後代。
＜３＞　配列番号８～配列番号２１に示される塩基配列を有するプライマーのいずれか１以上で検出可能なべと病抵抗性遺伝子を有する、前記＜１＞または＜２＞のべと病抵抗性キャベツ、またはその後代。
＜４＞　べと病が、Hyaloperonospora brassicaeにより引き起こされる病害である、前記＜１＞～＜３＞のいずれかのべと病抵抗性キャベツ、またはその後代。
＜５＞　べと病抵抗性遺伝子が、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４３で特定されるブロッコリー品種に見出されるものである、前記＜１＞～＜４＞のいずれかのべと病抵抗性キャベツ、またはその後代。
＜６＞　べと病抵抗性遺伝子が、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４４で特定されるキャベツ品種に見出されるものである、前記＜１＞～＜４＞のいずれかのべと病抵抗性キャベツ、またはその後代。
＜７＞　前記＜１＞～＜６＞のいずれかのキャベツまたはその後代の植物体の一部。
＜８＞　前記＜１＞～＜６＞のいずれかのキャベツまたはその後代の種子。
＜９＞　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４４で特定される、べと病に対する抵抗性を有する雑種第一代キャベツもしくはその一部、またはそのキャベツの種子。
＜１０＞　べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物から、べと病抵抗性を、所望のキャベツに導入することを含む、べと病抵抗性キャベツの育成方法。
＜１１＞　べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物から、配列番号１～配列番号７のいずれか１以上で示される遺伝子座の近傍に座乗するべと病抵抗性遺伝子によるべと病抵抗性を、所望のキャベツに導入することを含む、べと病抵抗性キャベツの育成方法。
＜１２＞　べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物が、キャベツ以外のブラシカ・オレラセア植物である、前記＜１０＞または＜１１＞のべと病抵抗性キャベツの育成方法。
＜１３＞　べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物が、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４３で特定されるブロッコリー品種である、前記＜１０＞～＜１２＞のいずれかの育成方法。
＜１４＞　べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物が受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４４で特定されるキャベツ品種である、前記＜１０＞または＜１１＞の育成方法。
＜１５＞　べと病抵抗性の所望のキャベツへの導入を、該キャベツを連続戻し交雑することにより行う、前記＜１０＞～＜１４＞のいずれかの育成方法。
＜１６＞　配列番号１～配列番号７で示したＤＮＡ配列のいずれか１以上、または該ＤＮＡ配列を増幅しうる１以上のプライマーもしくはプライマー対を用いて、べと病抵抗性遺伝子の存在を検定することを含む、前記＜１０＞～＜１５＞のいずれかの育成方法。
＜１７＞　前記プライマーが、配列番号８～配列番号２１のいずれか１以上で示されるものである、前記＜１６＞の育成方法。
＜１９＞　配列番号１～配列番号７に示される塩基配列のいずれか１つを有する、ブラシカ・オレラセア植物におけるべと病抵抗性遺伝子座を検出可能なマーカー。
＜２０＞　配列番号８～配列番号２１に示される塩基配列を有するプライマーをいずれか１以上含む、ブラシカ・オレラセア植物におけるべと病抵抗性遺伝子座を検出可能なプライマーセット。
＜２１＞　配列番号１～配列番号７に示される塩基配列を有するマーカーのいずれか１以上、または、配列番号８～配列番号２１に示される塩基配列を有するプライマーのいずれか１以上を用いることを含む、ブラシカ・オレラセア植物におけるべと病抵抗性の検出方法。
　本発明のべと病抵抗性キャベツは、Hyaloperonospora brassicaeにより引き起こされるべと病に対して優れた抵抗性を有する。また、本発明によるべと病抵抗性キャベツを材料とすることにより、新規のべと病抵抗性キャベツ系統のさらなる育成が可能となる。さらに、本発明によるべと病抵抗性に連鎖したマーカーを利用することにより、接種試験を実施しなくても、べと病抵抗性の検出または選抜が可能となる。本発明に従い育成されたキャベツ系統を栽培することによって、べと病の発生により栽培が困難とされた地域でのキャベツ栽培が可能となり、従来必要とされた栽培における薬剤散布の労力やコストを削減することができる。また、本発明によるべと病抵抗性のキャベツにより、薬剤散布回数を抑えた青果物を出荷することが可能となり、さらに、病害の発生率を抑えることが可能となるため、秀品率の高い青果物を収穫することが可能となる。
べと病接種試験による病徴（左側は感受性系統、右側は抵抗性系統）を示す。図中、左の感受性系統では、葉の表面に黄色から褐色の病斑が形成されている様子を観察することができる。 べと病抵抗性因子近傍に連鎖したＤＮＡマーカーの電気泳動図を示す（実施例２）。 べと病抵抗性因子近傍の連鎖地図を示す（実施例３）。 実施例５の圃場試作における発病評点の目安を示す。 本発明（実施例５）により育成されたキャベツ系統の圃場試作結果を示す。「ＣＢ－２０」（元の親系統）と、べと病抵抗性因子を導入したアイソジェニック・ライン（ｉｓｏｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅ）の様子を示す。 本発明（実施例５）により育成された３系統のキャベツ系統の圃場試作結果を示す。 本発明により育成されたキャベツ親系統「ＤＭＲ－ＣＢ－２０」を使用した雑種第１代（Ｆ１）品種の試作結果を示す（実施例６）。 図８はマーカー（ＤＭＴＬＲ－１～ＤＭＴＬＲ－７）の塩基配列を示す。 図８はマーカー（ＤＭＴＬＲ－１～ＤＭＴＬＲ－７）の塩基配列を示す。 図８はマーカー（ＤＭＴＬＲ－１～ＤＭＴＬＲ－７）の塩基配列を示す。 図８はマーカー（ＤＭＴＬＲ－１～ＤＭＴＬＲ－７）の塩基配列を示す。 図８はマーカー（ＤＭＴＬＲ－１～ＤＭＴＬＲ－７）の塩基配列を示す。
　以下、本発明について詳細に説明する。
べと病抵抗性キャベツ
　本発明は、前記したように、べと病に対する抵抗性を有するキャベツ（べと病抵抗性キャベツ）、またはその後代に関する。
　本明細書において「後代」とは、本発明によるべと病抵抗性キャベツと、該植物と交配可能なブラシカ・オレラセア植物とを交配させて得られる交雑種も包含される。したがって、「後代」には、例えば、本発明によるべと病抵抗性キャベツを花粉親（雄親）とし、該植物と交配可能なブラシカ・オレラセア植物を種子親（雌親）として交配することによって得られるものも含まれる。また、「後代」には、例えば本発明によるべと病抵抗性キャベツと、該キャベツと融合可能な植物との細胞融合による植物や、種属間交雑植物も含まれる。
　またここで、「ブラシカ・オレラセア植物」とは、アブラナ科の植物であって、ブラシカ属植物のブラシカ・オレラセア種の植物を意味し、ここには、B. oleracea var. capitata (キャベツ)、B. oleracea var. italica (ブロッコリー)、B. oleracea var. botrytis (カリフラワー)、B. oleracea var. gemmifera (メキャベツ)、B. oleracea var. gongyloides (コールラビー)、B. oleracea var. acephara (ハボタン、ケール)、およびB. oleracea var. albograbra (カイラン)等が包含される。
　ここで「キャベツ」とは、ブラシカ・オレラセア種に属する植物種であって、B. oleracea var. capitataに分類される植物種である。
　本明細書において「べと病」とは、卵菌のうちPeronosporaceae科に属する菌による病害、好ましくはHyaloperonospora brassicaeによる病害を意味する。したがって、ここでいうべと病に対する抵抗性とは、このような菌による病害に対する抵抗性を意味する。
　よって、本発明によるべと病抵抗性のキャベツは、べと病菌（好ましくは、Hyaloperonospora brassicae）に対する抵抗性を示し、単因子優性的な発現を示すものである。当該植物を材料とすることによって、べと病抵抗性を有した新規キャベツ親系統の育成が可能となる。
　ここで「親系統」とは、交雑品種を作製するために育成された系統であり、通常は表現型が相違する２種類以上の親系統を材料として、これらを掛け合わせた交雑品種を作製する。
　したがって、本発明における「べと病抵抗性」は、べと病菌Hyaloperonospora brassicaeに対する抵抗性を意味し、より具体的には、配列番号１～配列番号７の近傍に座乗する因子に基づくものである。
　すなわち、本発明の好ましい態様によれば、本発明によるべと病抵抗性キャベツまたはその後代は、配列番号１～配列番号７のいずれか１以上で示される遺伝子座の近傍に座乗するべと病抵抗性遺伝子を有する。
　ここで、「配列番号１～配列番号７のいずれか１以上で示される」には、配列番号１～配列番号７で示される塩基配列が、一定の配列同一性の範囲内であるか、または部分的な変異を有する範囲のものとなっている場合を包含する。配列番号１～配列番号７のそれ自体と同等に扱いうる範囲の配列については、当業者であれば容易に理解し得るものである。
　したがって、例えば、「配列番号１～配列番号７のいずれか１以上で示される」は、以下の（ａ）～（ｃ）の塩基配列のいずれか１以上で示される場合も包含する意味で使用される。
　（ａ）　配列番号１～配列番号７に示される、いずれか１以上の塩基配列、
　（ｂ）　配列番号１～配列番号７に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する、いずれか１以上の塩基配列、および
　（ｃ）　配列番号１～配列番号７に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された、いずれか１以上の塩基配列。
　したがって、本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明によるべと病抵抗性キャベツまたはその後代は、前記した（ａ）～（ｃ）で示されるいずれか１以上の塩基配列で示される遺伝子座の近傍に座乗するべと病抵抗性遺伝子を有する、といえる。
　ここで前記（ｂ）において、「配列番号１～配列番号７に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する」とは、配列番号１～配列番号７に示される塩基配列と、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの相同性検索のための公知のアルゴリズム（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを使用する）を用いて計算したときに、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、さらに好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列番号を包含する。
　ここで「配列同一性」とは、例えば２つの塩基（ヌクレオチド）配列をアラインメントしたとき（ただしギャップを導入してもよいしギャップを導入しなくてもよい）、ギャップを含む塩基の総数に対する同一塩基の数の割合（％）を指す。
　また前記（ｃ）において、「配列番号１～配列番号７に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された」とあるところの「複数個」とは、例えば、１０個程度であり、好ましくは８個、より好ましくは６個、さらに好ましくは５個、さらにより好ましくは４個、前記より好ましくは３個、前記よりさらに好ましくは２個、特に好ましくは１個である。
　本発明の一つの好ましい態様によれば、配列番号１～配列番号７はそれぞれ、配列番号２２～２８であることができる。ここで配列番号２２～２８は、プライマーに挟まれた配列番号１～７の配列（プライマーの配列も含む）の外側の配列を含むもので、後述する実施例２において本発明者等がはじめて見出したものである。
　したがって、「配列番号２２～２８のいずれか１以上で示される」という場合には、これら配列に含まれる配列番号１～７の部分についてのみ、前記した（ａ）～（ｃ）の塩基配列のいずれか１以上で示されるものを包含する他、配列番号２２～２８について、以下の（ａ’）～（ｃ’）の塩基配列のいずれか１以上で示される場合も包含する意味で使用される。
　（ａ’）　配列番号２２～配列番号２８に示される、いずれか１以上の塩基配列、
　（ｂ’）　配列番号２２～配列番号２８に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する、いずれか１以上の塩基配列、および
　（ｃ’）　配列番号２２～配列番号２８に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された、いずれか１以上の塩基配列。
　ここで前記（ｂ’）において、「配列番号２２～配列番号２８に示される塩基配列と９５％以上の配列同一性を有する」とは、配列番号２２～配列番号２８に示される塩基配列と、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの相同性検索のための公知のアルゴリズム（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを使用する）を用いて計算したときに、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、さらに好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列番号を包含する。
　また前記（ｃ’）において、「配列番号２２～配列番号２８に示される塩基配列の１個または複数個の塩基が、欠失、置換、挿入、および／または付加された」とあるところの「複数個」とは、例えば、１０個程度であり、好ましくは８個、より好ましくは６個、さらに好ましくは５個、さらにより好ましくは４個、前記より好ましくは３個、前記よりさらに好ましくは２個、特に好ましくは１個である。
　また本発明でいう「近傍」とは、マーカーの位置とベと病抵抗性遺伝子との関係、および当業者の通常の知識から、当業者であればどのような程度の距離でありうるか容易に理解可能である。例を挙げれば、分析条件にもよるが、例えば、１０ｃＭ程度の距離、またはそれ以下（例えば、７ｃＭ）でありうる。
　また、配列番号１～配列番号７で示される塩基配列をマーカーとして使用して、これらから示されうる遺伝子座からその近傍に座乗するべと病抵抗性遺伝子の存在を、推定または確認することができる。
　したがって、本発明の別の態様によれば、配列番号１～配列番号７に示される塩基配列のいずれか１つを有する、ブラシカ・オレラセア植物におけるべと病抵抗性遺伝子座を検出可能なマーカーが提供される。
　また、配列番号１～配列番号７で示したＤＮＡ配列のいずれか１以上のマーカーを用いて、べと病抵抗性遺伝子の存在を検定することを含む、ブラシカ・オレラセア植物におけるべと病抵抗性の検出方法も提供される。
　さらにここで、「配列番号１～配列番号７に示される塩基配列のいずれか１つ」には、べと病抵抗性遺伝子を特定することができる限りにおいて、前記した（ａ）～（ｃ）で示される塩基配列のいずれか一つをも包含しうる。
　これらマーカーの検出は、例えば、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＦＬＰ法、ＬＡＭＰ法、ＳＮＰｓジェノタイピングチップ法等のように、当業者に周知の方法にしたがって実施することができる。
　以上のように、このようなマーカーおよび検出方法を利用することで、本発明による「配列番号１～配列番号７のいずれか１以上で示される遺伝子座の近傍に座乗するべと病抵抗性遺伝子を有する、べと病抵抗性キャベツ、またはその後代」であるか否かを確認することができる。
　本発明の好ましい態様によれば、配列番号１～配列番号７で示したＤＮＡ配列を増幅可能な１以上のプライマーもしくはプライマー対で検出可能なべと病抵抗性遺伝子を有する。
　本発明のより好ましい態様によれば、本発明によるべと病抵抗性キャベツまたはその後代は、配列番号８～配列番号２１に示される塩基配列を有するプライマーのいずれか１以上で検出可能なべと病抵抗性遺伝子を有する。なおこれらプライマーは、以下において、「ＤＭＴＬＲマーカー」ということがある。
　ここで、ＤＮＡマーカーが塩基配列を「有する」とは、該マーカーがその塩基配列を有していることをいう。本発明においては、ＤＮＡマーカーは、対応する塩基配列内の塩基のいずれかの１又は数個（例えば、１、２もしくは３個、好ましくは１又は２個、より好ましくは１個）が置換、欠失、付加もしくは削除されていてもよいことを意味し、あるいは、対応する塩基配列を一部として含みかつ所定の性質を保持する配列であってもよい。このような場合、「有する」という語は、「含む」に言い換えてもよい。また、１個の塩基の置換、欠失、付加もしくは削除が許容される場合については、「有する」を「から実質的になる」と言い換えても良い。
　ここでいうべと病抵抗性は、これらの塩基配列８～２１で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを実施することによって、検出し、確認することができる。
　したがって、本発明の別の態様によれば、配列番号８～配列番号２１に示される塩基配列を有するプライマーをいずれか１以上含む、ブラシカ・オレラセア植物におけるべと病抵抗性遺伝子座を検出可能なプライマーセットが提供される。
　また、本発明の別の態様によれば、配列番号１～配列番号７に示される塩基配列を有するマーカーのいずれか１以上、または、配列番号８～配列番号２１に示される塩基配列を有するプライマーのいずれか１以上を用いることを含む、ブラシカ・オレラセア植物におけるべと病抵抗性を検出する方法が提供される。
　これらＤＮＡマーカーを使用すれば、接種試験による選抜を行わなくても、効率的にべと病抵抗性を有する新規キャベツ系統を育成することが可能となる。
　本発明によるべと病抵抗性キャベツは、次のような特徴を有する。
　（１）　具体的には、配列番号１～配列番号７で示したＤＮＡ配列をべと病抵抗性遺伝子座近傍に有する植物であり、そのアレルを有することによってべと病抵抗性を示す植物である。
　（２）　上記配列を有する系統を交配材料に利用することで、べと病抵抗性を有した新規キャベツ親系統の育成が可能となる。べと病抵抗性の導入に際しては、接種試験による確認も可能であるが、配列番号１～配列番号７に基づいて作製されたＤＮＡマーカーや、公的な情報から当該配列番号１～配列番号７の近傍に位置するＤＮＡ配列を選び出し、新たにマーカーを設計して抵抗性植物の選抜に用いてもよい。更に、べと病抵抗性遺伝子座近傍のマーカーを用いることによって、べと病抵抗性遺伝子座に連鎖する非目的形質を切り離した個体を選抜することも可能である。
　（３）　このようにして開発された本発明のキャベツは、べと病菌Hyaloperonospora brassicaeに対する抵抗性を有しているため、栽培期間中における病害防除のための殺菌剤散布の労力やコストを削減することができる。
　本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明によるべと病抵抗性キャベツまたはその後代は、下記のいずれかのものであることができる：
　1)　べと病抵抗性遺伝子が、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４３で特定されるブロッコリー品種に見出されるものである、べと病抵抗性キャベツ、またはその後代； 
　2)　べと病抵抗性遺伝子が、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４４で特定されるキャベツ品種に見出されるものである、べと病抵抗性キャベツ、またはその後代；および
　3)　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４４で特定される、べと病に対する抵抗性を有する雑種第一代キャベツ。
　ここでべと病抵抗性遺伝子が「見出されるものである」とは、その特定の品種に存在する遺伝子を、べと病抵抗性キャベツ、またはその後代が有していることを意味する。すなわち、べと病抵抗性遺伝子が、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４３で特定されるブロッコリー品種に見出されるものである、べと病抵抗性キャベツ、またはその後代とは、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４３で特定されるブロッコリー品種に見出されるべと病抵抗性遺伝子を有していれば、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４３で特定されるブロッコリー品種に限らず、いずれのものも包含する意味である。
　本発明の別の態様によれば、本発明は、本発明によるべと病抵抗性キャベツもしくはその後代の植物体の一部、または、それらの種子にも関する。
　ここで、「植物体の一部」とは、花、葉、茎、根等の器官もしくはその部分または組織、或いは、これら器官または組織からの細胞、細胞の集合体等を包含する。
べと病抵抗性キャベツの育成方法
　本発明によるべと病抵抗性キャベツの育成方法は、前記したように、べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物から、べと病抵抗性を、所望のキャベツに導入することを含む。
　ここで、「べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物」は、べと病、好ましくはHyaloperonospora brassicaeによるべと病に対して、発病や、感染後の病害の進行に対して抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物を意味し、例えば、用意したべと病菌（好ましくはHyaloperonospora brassicae菌）の接種試験を行い、これによる抵抗性を有するか否かで判定し、得ることができる。より好ましくは、この接種試験において、植物が保持する抵抗性の因子が、単因子優性的な発現を示すブラシカ・オレラセア植物である。より具体的には、例えば、後述する実施例１にしたがって接種試験を行い、本発明の育成方法において使用可能な「べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物」であるかを確認することができる。
　好ましくは、「べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物」は、キャベツ以外のブラシカ・オレラセア植物である。
　より好ましくは、「べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物」は、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４３で特定されるブロッコリー品種、または、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４４で特定されるキャベツ品種である。
　また本発明の育成方法において、「べと病抵抗性を、所望のキャベツに導入する」とは、「べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物」が有しているべと病抵抗性の因子を、所望のキャベツに、キャベツがべと病抵抗性を有するようになるように、導入することを意味する。
　また「所望のキャベツ」とは、べと病抵抗性を有していないキャベツであって、「べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物」と交配が可能である、べと病抵抗性を導入させたいと希望するキャベツを意味する。このようなキャベツは、キャベツとしての有用な形質を有するものである。
　ここでいう「べと病抵抗性」は、べと病の接種試験のような公知の手段により確認できるものであるが、より詳しくは、配列番号１～配列番号７のいずれか１以上で示される遺伝子座の近傍に座乗するべと病抵抗性遺伝子によるものである。
　べと病抵抗性の導入は、べと病抵抗性を発現し得る遺伝子を所望のキャベツに導入することを意味する。本発明では、典型的には、このような導入は、「べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物」と、所望のキャベツとを交配させ、得られた交雑後代から、所望のべと病抵抗性を有するものを選抜し、さらに、該キャベツを戻し交配親として戻し交配を行うことによって、行うことができる。
　交配後に、交雑後代でのべと病抵抗性を確認する手段としては、べと病の接種試験（例えば、実施例１を参照することができる）でもよいが、配列番号１～配列番号７に基づいて作製されたＤＮＡマーカーや、公的な情報から当該配列番号１～配列番号７の近傍に位置するＤＮＡ配列を選び出し、新たにマーカーを設計して抵抗性植物の選抜に用いてもよい。このようなマーカーとしては、前記した配列番号１～配列番号７に示される塩基配列のいずれか１つを有するマーカーや、配列番号８～配列番号２１に示される塩基配列を有するプライマーが包含される。これらの確認手段は、戻し交配を行う過程でも同様に利用して、べと病抵抗性の後代の選抜を行うことができる。
　よって、本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明の育成方法において、配列番号１～配列番号７で示したＤＮＡ配列のいずれか１以上のマーカー、または該ＤＮＡ配列を増幅しうる１以上のプライマーもしくはプライマー対を用いて、べと病抵抗性遺伝子の存在を検定することを含む。さらに、より好ましくは、前記プライマーは、配列番号８～配列番号２１のいずれか１以上で示されるものである。
　したがって、本発明の好ましい態様によれば、本発明の育成方法は、べと病抵抗性の所望のキャベツへの導入を、該キャベツを連続戻し交雑することにより行う。より詳しくは、本発明の育成方法は、べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物と、所望のキャベツを交配させ、べと病抵抗性を有する交雑後代を選抜し、さらに所望のキャベツを戻し交配親として、連続戻し交雑することを含む。
　なお戻し交配を行う際には、一般的には、５～７回程度の戻し交配を行うことが望ましい。
　効率的な戻し交配を行う場合には、ゲノムワイドなＤＮＡマーカーを用いて早期に戻し交配親に近づけることも可能である。
　例えば、戻し交配第一世代（ＢＣ１Ｆ１）は分離世代であるために個々体が有するゲノム置換率は異なり、集団の規模を拡大すれば、個体によっては９０％以上のゲノム領域が戻し親と同じ遺伝子型を示す個体を獲得することも可能である。このような個体を選抜することで、べと病抵抗性の遺伝子座以外の領域を早期に、少ない世代数で戻し親と同じ遺伝子型に揃えることが可能となる。
　ゲノムワイドなＤＮＡマーカーとして利用可能な具体的手段として、戻し親のゲノム配列情報を有している場合には、その情報に基づくＤＮＡマーカーを作製して各遺伝子座のジェノタイピングを行ってもよい。
　また、戻し親のゲノム配列情報が無い場合であっても、ＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）法、ＳＲＡＰ（sequence-related amplified polymorphism）法、ＡＦＬＰ（Amplified fragment length polymorphism）法などのランダムＰＣＲ法を利用することでによって、分離世代の中から、戻し親に近い遺伝子型を有した個体を選抜することが可能である。その他にも、ゲノム中に散在する多数のＳＮＰｓを網羅的に解析できるよう設計されたＳＮＰｓジェノタイピングチップ（affymetrix社製品やIllumina社製品等）があれば、そのような手段を用いて解析してもよい。
　このようにして育成されたべと病抵抗性の系統は、直接的な品種としての利用のみならず、Ｆ１採種体系における両親もしくは片親としても利用することができる。
　したがって、本発明の別の態様によれば、本発明の育成方法により得られたべと病抵抗性の系統を、両親系統または一方の親の系統として用いる、Ｆ１系統の作出方法、およびそのようなＦ１系統種子の採種方法も提供される。
　下記の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１：
　株式会社サカタのタネが保有するブロッコリーの遺伝資源を材料とし、２種類のべと病菌株（菌株Ｄｍ－Ａ、及び菌株Ｄｍ－Ｂ（このうち、菌株Ｄｍ－Ｂはより多くの品種を侵す））の両方に対して抵抗性を示すブロッコリーを、２系統（「ＢＲ－２３」、及び「ＢＲ－３５」）見出した。
　これらの抵抗性系統が有するべと病抵抗性遺伝子座を同定するため、まず「ＢＲ－２３」系統を材料に用いて、前記２種類の菌株に対して感受性を示す２系統（「ＢＲ－４」、及び「ＢＲ－２４」）を交配して、表１に示す通りのＦ２集団及びＢＣ１Ｆ１集団を作製した。
　なお、世代表示として、Ｆ１は雑種第１代を意味し、ＢＣ１は、戻し交配を１回行った世代を意味する。すなわち、「ＢＣ１Ｆ１」とは、雑種第１代を経てさらに戻し交配を１回行った世代を意味する。
　これら得られた集団に対して多犯性の菌株Ｄｍ－Ｂによる接種試験を実施した。
　接種試験において、発病の程度（発病度）は、各個体の第１～３本葉について以下の発病評点にしたがって評価した。
　　　０：　無病徴、
　　　１：　褐色病斑を形成、胞子形成はない、
　　　２：　褐色病斑上に僅かな胞子形成、
　　　３：　中程度の胞子形成、
　　　４：　多量の胞子形成。
　結果は表１に示されるとおりであった。
　結果のとおり、Ｆ２集団は抵抗性：感受性が３：１に分離した一方、感受性系統を交配したＢＣ１Ｆ１集団は１：１に分離した。これらのことから、本病害の抵抗性因子は単因子優性的に働くことが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
実施例２：
　表１において、抵抗性と感受性の分離が見られたＦ２集団（Mapping population－１，－２）やＢＣ１Ｆ１集団（Mapping population－３，－４）を材料として、Bulked Segregant Analysis法（ＢＳＡ法）によるＲＡＰＤマーカーの検索を行った。
　ＲＡＰＤプライマーには、オペロン社が設計した１０ｍｅｒのプライマーを１１８０種類と、ＢＥＸ社が設計した１２ｍｅｒのプライマー４６０種類を用いた。
　バルクＤＮＡには、Mapping population－４の集団より、抵抗性の個体を４個体、感受性の個体を４個体選び、それらのＤＮＡを使用して、抵抗性個体のバルクＤＮＡと、感受性個体のバルクＤＮＡを作製した。
　ＲＡＰＤマーカーの１次スクリーニングとして、前述の２種類のバルクＤＮＡに対して１６４０種類のプライマーによるＲＡＰＤ（Randomly Amplified Polymorphic DNA）法を実施し、多型を示したマーカーを２４５種類選抜した。
　２次スクリーニングでは、Mapping population-４の集団より、抵抗性を示した２個体と、感受性を示した２個体とを選んで、これらをテンプレートに使用して、１次スクリーニングにおいて示した多型と同様なパターンを示したマーカーを３６種類選抜した。
　３次スクリーニングでは、Mapping population-４の集団より、抵抗性を示した４個体と、感受性を示した４個体とを選んで、これらをテンプレートに使用して、２次スクリーニングにおいて示した多型と同様なパターンを示したマーカーを１１種類選抜した。
　この段階で表現型とマーカーの分離パターンがほぼ一致したものについては、mapping population－１～mapping population－４の全個体に当てて、マーカーと表現型のスコアにどの程度矛盾が生じているのか確認し、表現型と強い相関を持つマーカーを選抜した。
　上記試験において、べと病抵抗性因子との連鎖が確認された１１種類のマーカーのうち７種類のマーカーについて、増幅したＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、配列特異的なプライマーを設計することによりＳＣＡＲ（Sequence Characterized Amplified Region）化を試みた。
　まずＲＡＰＤにより増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出し、クローニングした後、塩基配列を解析した。これにより、前記した７種類のマーカー（ＤＭＴＬＲ－１～ＤＭＴＬＲ－７）の塩基配列を特定した（それぞれ、配列番号１～配列番号７）（図８）。なお配列を特定する際、配列番号２２～２８の配列がまず特定されており、これら配列はそれぞれＳＣＡＲプライマーに挟まれた配列番号１～７の配列（ＳＣＡＲプライマーの配列も含む）を有するものであった。図８において下線部で示した配列がＳＣＡＲプライマーであり、ＳＣＡＲプライマーに挟まれた配列（ＳＣＡＲプライマーを含む）がそれぞれ配列番号１～７に相当する。
　なおここで、クローニングに際しては、ベクターとしてpBluescriptII SK(-)（Stratagene社より入手）を用い、コンピテントセルにはＪＭ１０９（E.coli JM109、東洋紡株式会社より入手）を用いた。塩基配列の解析には、ＤＮＡシーケンサーＡＢＩ３１３０（Applied Biosystems社製）を用いた。
　塩基配列を解読したマーカーについて、目的配列を特異的に増幅させることができるよう「Ｐｒｉｍｅｒ３」ソフトウェア（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用のプライマーの設計支援ソフトウェア、オープンソースソフトウェア）を用いて、プライマーを設計した（配列番号８～２１）（表２）。
　またこれら各プライマー（マーカー）の電気泳動試験の結果（電気泳動図）を図２に示した。
　なお、このようにして開発したマーカーを、本明細書では「ＤＭＴＬＲマーカー」と称する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
実施例３：
　実施例２で使用したMapping population－２と同じＦ２集団を使用して、べと病菌株Ｄｍ－Ａに対する抵抗性反応についても調査した。
　Ｆ２集団の規模は２４０個体とし（mapping population－５とする）、Ｄｍ－Ａに対する各個体の反応を調査した結果、表３のような分離を示した。なお、菌株Ｄｍ－Ａによる接種試験については、実施例１の接種試験と同様に実施し評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　実施例２で作製したＳＣＡＲマーカーによる遺伝子型と比較した結果、表現型との高い相関を確認することができた。この結果より、系統「ＢＲ－２３」が有するべと病抵抗性因子は、単一の遺伝子で２種類の菌株に対して抵抗性反応を示すと推測された。
　上記解析結果をもとに、マーカーの連鎖関係を解析するためのソフトウェアである「Ｍａｐｍａｋｅｒ 2.0」（Whitehead Institute）を使用し、当該集団における表現型と各マーカーとの連鎖関係を解析した。
　結果は、図３の連鎖地図に示される通りであった。
　結果のように、配列番号１～７の近傍、特に配列番号４、配列番号５の極近傍に抵抗性因子が座乗すると推測された。
実施例４：
　実施例２で解析した抵抗性系統「ＢＲ－２３」とは異なる系統「ＢＲ－３５」について、系統「ＢＲ－２３」と同じ抵抗性因子を有しているか否かを確認するため、感受性系統の「ＢＲ－１３」とのＦ２分離集団を作製し、菌株Ｄｍ－Ａによる接種試験を実施した（表４）。なお、菌株Ｄｍ－Ａによる接種試験については、実施例１の接種試験と同様に実施し評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　更に、配列番号８及び９を用いてＰＣＲを実施し、各個体の遺伝子型を調査した結果、当該遺伝子座が抵抗性ホモ型を示した４２個体、及びヘテロ型を示した８３個体については、全て抵抗性を示した（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　なお表５は、表4のmapping population－６の１８０個体を、ＤＮＡマーカーＤＭＴＬＲ－１の遺伝子型別に分類した結果を示す。
　このように、マーカーが示す多型と表現型は極めて高い相関を示したことから、２種類のブロッコリーべと病抵抗性系統「ＢＲ－２３」及び「ＢＲ－３５」は、同一の抵抗性因子を有しているものと推測された。
　なお、「ＢＲ－３５」が有するべと病抵抗性遺伝子は、「ＢＲ－３５」を片親とするブロッコリーＦ１品種「沢ゆたか」に見出すことが可能である。
　前記ブロッコリーＦ１品種「沢ゆたか」の種子は、２０１７年８月１８日付けで独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２０号室）に国際寄託（原寄託）されている（寄託者が付した識別のための表示：ＳＳＣ－ＢＲＯ－１７－００１、受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４３）。
実施例５：
　株式会社サカタのタネが保有するブロッコリーの系統である「ＢＲ－２３」と「ＢＲ－３５」を、べと病抵抗性の素材とし、当該抵抗性を導入するキャベツとして４つの品種群（葉深系、寒玉系、春系、ボール系）からそれぞれ各１系統「ＣＢ－２０」、「ＣＢ－３５」、「ＣＢ－２３」、または「ＣＢ－９７」を選定し、戻し交配親系統として交配試験を行った。
　戻し交配（ＢＣ）を効率的に進めるにあたって、基本的に、開発したＤＭＴＬＲマーカーによるＤＮＡ検定を行い、当該べと病抵抗性遺伝子座がそれぞれヘテロとなった個体を選抜し、表現型を確認しながら「ＣＢ－２０」、「ＣＢ－３５」、「ＣＢ－２３」及び「ＣＢ－９７」の各キャベツ系統を連続戻し交配した。
　まず、ブロッコリー系統「ＢＲ－２３」及び「ＢＲ－３５」と、キャベツ系統「ＣＢ－２０」、「ＣＢ－３５」、「ＣＢ－２３」及び「ＣＢ－９７」とを交配してＦ１を採種し、ＤＭＴＬＲマーカーでのＤＮＡ選抜と、連続戻し交配を行った。
　戻し交配を効率的に進めるため、２０種類のＲＡＰＤプライマーによる選抜を行い、それぞれの戻し交配系統において、それぞれの戻し親系統である「ＣＢ－２０」、「ＣＢ－３５」、「ＣＢ－２３」及び「ＣＢ－９７」に近い遺伝子型を示す個体を選抜した。
　その結果、「ＣＢ－２０」においてはＢＣ２Ｆ１世代で、その他の「ＣＢ－３５」、「ＣＢ－２３」及び「ＣＢ－９７」においてはＢＣ３Ｆ１世代で、これらのＲＡＰＤマーカーがそれぞれの戻し交配親系統と完全に一致する個体を選抜した。
　また、ＢＣ２Ｆ１世代またはＢＣ３Ｆ１世代において、ＤＭＴＬＲマーカーによって抵抗性と感受性を判別し、それぞれの遺伝子型毎に、それぞれの戻し親系統と共に、サカタのタネ掛川総合研究センター及びサカタのタネ君津育種場のいずれかまたは双方の圃場にて試作した。
　結果は、表６および図４～７に示した。
　表６は、キャベツ系統「ＣＢ－２０」に、べと病抵抗性因子を導入した系統の圃場における試作結果およびべと病の発病程度の評価結果を示す。戻し交配途中の分離世代において、ＤＭＴＬＲマーカーによりべと病抵抗性因子を有すると判定された個体は、ヘテロであっても抵抗性を示し、べと病抵抗性因子を有していないと判定された個体は感受性を示した。また、表現型についても、戻し親系統である葉深系の「ＣＢ－２０」に極めて近い草姿を示していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
　表６で示した各評点の病徴については、図４に示した。発病評点の目安として、各発病程度は以下の状態を意味する。
　　発病程度
　　　　０：病斑なし、
　　　　１：病斑数少、
　　　　２：病斑数中程度、
　　　　３：病斑数多。
　また、表６で示した「ＣＢ－２０」（元の親系統）と、べと病抵抗性因子を導入したｉｓｏｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅの写真は、図５に示した。図のように、元の親系統「ＣＢ－２０」に対し、べと病抵抗性因子を導入したｉｓｏｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅは、べと病の発病が抑えられた。
　さらに、その他のキャベツの３系統「ＣＢ－３５」、「ＣＢ－２３」及び「ＣＢ－９７」を戻し交配した系統についても、同様に圃場にて試作調査を行った。
　結果は図６に示されるとおりであった。
　結果に示されるように、抵抗性の遺伝子座を導入した系統は、ヘテロであっても抵抗性が本葉及び玉においても発現し、且つ、寒玉系、春系、ボール系の親系統「ＣＢ－３５」、「ＣＢ－２３」及び「ＣＢ－９７」と同等になったことを確認した。すなわち、図６から分かるように、元の親系統に対し、べと病抵抗性因子を導入したｉｓｏｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅは、べと病の発病が抑えられた。
　その後、特にべと病に弱い葉深系のキャベツ「ＣＢ－２０」系統については数回の戻し交配を実施し、掛川総合研究センターの圃場で栽培していた系統の中から２０個体を選抜し、べと病抵抗性のホモ接合体を、葯・花粉培養から得て、Ｆ１品種の親として実用的な形質を兼ね備えたべと病抵抗性のキャベツ親系統を初めて育成することに成功した。
実施例６：
　さらに、べと病抵抗性を付与した「ＤＭＲ－ＣＢ－２０」（前記で育成されたＤＭキャベツ系統）を花粉親に、他の有望なキャベツ系統である「ＣＢ－５」細胞質雄性不稔系統を種子親として、Ｆ１（品種試作名：ＳＫ３－００５）を作出した。
　このＦ１系統をサカタのタネ君津育種場で継続的に試作し、べと病抵抗性が、安定的に発現していることを確認した。
　このようにしてべと病抵抗性Ｆ１キャベツ品種の初めての育成に至った。
　なお、育成されたべと病抵抗性Ｆ１キャベツ品種について採種された種子は、２０１７年８月１８日付けで独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２０号室）に国際寄託（原寄託）されている（寄託者が付した識別のための表示：ＳＳＣ－ＣＳＢ－１７－００１、受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４４）。
　元のＦ１品種（元の親系統である「ＣＢ－２０」を用いて得られたＦ１品種）と、今回得られた、べと病抵抗性を付与した新規キャベツＦ１品種（べと病抵抗性導入Ｆ１品種）とを比較した。
　結果は図７に示されるとおりであった。
　図７に示されるとおり、べと病抵抗性を付与したF1品種（左写真）は、元のＦ１品種に比べて、べと病の発病が抑えられた。
 

Claims (21)

  1. 　べと病に対する抵抗性を有するキャベツ、またはその後代。
  2. 　配列番号１～配列番号７のいずれか１以上で示される遺伝子座の近傍に座乗するべと病抵抗性遺伝子を有する、請求項１に記載のべと病抵抗性キャベツ、またはその後代。
  3. 　配列番号８～配列番号２１に示される塩基配列を有するプライマーのいずれか１以上で検出可能なべと病抵抗性遺伝子を有する、請求項１または２に記載のべと病抵抗性キャベツ、またはその後代。
  4. 　べと病が、Hyaloperonospora brassicaeにより引き起こされる病害である、請求項１～３のいずれか一項に記載のべと病抵抗性キャベツ、またはその後代。
  5. 　べと病抵抗性遺伝子が、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４３で特定されるブロッコリー品種に見出されるものである、請求項１～４のいずれか一項に記載のべと病抵抗性キャベツ、またはその後代。
  6. 　べと病抵抗性遺伝子が、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４４で特定されるキャベツ品種に見出されるものである、請求項１～４のいずれか一項に記載のべと病抵抗性キャベツ、またはその後代。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載のキャベツまたはその後代の植物体の一部。
  8. 　請求項１～６のいずれか一項に記載のキャベツまたはその後代の種子。
  9. 　受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４４で特定される、べと病に対する抵抗性を有する雑種第一代キャベツもしくはその一部、またはそのキャベツの種子。
  10. 　べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物から、べと病抵抗性を、所望のキャベツに導入することを含む、べと病抵抗性キャベツの育成方法。
  11. 　べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物から、配列番号１～配列番号７のいずれか１以上で示される遺伝子座の近傍に座乗するべと病抵抗性遺伝子によるべと病抵抗性を、所望のキャベツに導入することを含む、べと病抵抗性キャベツの育成方法。
  12. 　べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物が、キャベツ以外のブラシカ・オレラセア植物である、請求項１０または１１に記載のべと病抵抗性キャベツの育成方法。
  13. 　べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物が、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４３で特定されるブロッコリー品種である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の育成方法。
  14. 　べと病に対する抵抗性を有するブラシカ・オレラセア植物が受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２３４４で特定されるキャベツ品種である、請求項１０または１１に記載の育成方法。
  15. 　べと病抵抗性の所望のキャベツへの導入を、該キャベツを連続戻し交雑することにより行う、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の育成方法。
  16. 　配列番号１～配列番号７で示したＤＮＡ配列のいずれか１以上、または該ＤＮＡ配列を増幅しうる１以上のプライマーもしくはプライマー対を用いて、べと病抵抗性遺伝子の存在を検定することを含む、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の育成方法。
  17. 　前記プライマーが、配列番号８～配列番号２１のいずれか１以上で示されるものである、請求項１６に記載の育成方法。
  18. 　配列番号８～配列番号２１に示される塩基配列を有するプライマーのいずれか１以上を用いて、べと病抵抗性遺伝子の存在を検定することを含む、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の育成方法。
  19. 　配列番号１～配列番号７に示される塩基配列のいずれか１つを有する、ブラシカ・オレラセア植物におけるべと病抵抗性遺伝子座を検出可能なマーカー。
  20. 　配列番号８～配列番号２１に示される塩基配列を有するプライマーをいずれか１以上含む、ブラシカ・オレラセア植物におけるべと病抵抗性遺伝子座を検出可能なプライマーセット。
  21. 　配列番号１～配列番号７に示される塩基配列を有するマーカーのいずれか１以上、または、配列番号８～配列番号２１に示される塩基配列を有するプライマーのいずれか１以上を用いることを含む、ブラシカ・オレラセア植物におけるべと病抵抗性の検出方法。
     
     


     
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