CN101748211A - 与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记BoRAAG/CTC112及其获得方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记BoRAAG/CTC112及其获得方法。该分子标记为SEQ ID No.1的序列，长度共191bp。其获得方法如下：将结球甘蓝的抗病亲本‘R103’和感病亲本‘S101’杂交得到F₁群体并构建相应的BC₁、F₂群体；明确该病害的病原是十字花科霜霉菌；进行抗病性调查发现在BC₁、F₂群体中对霜霉病的抗性受单基因显性控制；利用AFLP分子标记技术及改良BSA法进行与结球甘蓝霜霉病抗性相关的差异片段的筛选，得到AFLP差异片段BoRAAG/CTC并转化为SCAR标记BoR_AAG/CTC112，设计的引物为F_AAG/CTC112：5`-AT CCTACTGGTCCATACTCAC-3`和R_AAG/CTC112：5`-TAGAAAATTTGGACATTCAT-3`；该SCAR标记BoR_AAG/CTC112与抗性基因的遗传距离为5.7cM。该分子标记简单稳定，克服了常规育种方法周期长等缺点；可有目的的聚合多个抗霜霉病基因，培育出具稳定抗性的结球甘蓝品种。

Description

与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记BoRAAG/CTC112及其获得方法

技术领域

本发明涉及与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记及其获得的方法，属于生物技术领域。

背景技术

结球甘蓝在世界各地普遍栽培，也是我国的主要蔬菜作物之一。甘蓝霜霉病是由专性寄生菌寄生霜霉引起的一种世界性病害，这种真菌性病害常引起幼苗和成株叶片枯黄，导致产量降低，品质下降，给甘蓝生产上带来极大的损失。为解决上述的重大问题，挖掘新的抗源，以往育种家们大多借助形态学标记和生化标记来辅助育种，经筛选已获得一些优良的抗霜霉病自交系，但在抗病育种和抗病转育过程中用传统的方法筛选抗性植株时选育时间较长、操作程序繁琐；另一方面抗性易受环境条件的影响，难以适应育种实践需要。近年来，随着分子生物学的发展，利用分子标记辅助甘蓝抗病育种显出巨大潜力。一类基于DNA变异的分子标记技术已经被国内外许多学者应用于甘蓝抗病研究。应用分子标记技术，可以免除传统育种中繁重的选择过程，而且跟踪、检测外源基因，还可以把多个抗霜霉病基因聚合到同一优良品种中，获得持久抗性。目前，国内外对结球甘蓝霜霉病的研究较少，迄今还未有与结球甘蓝霜霉病抗性基因相连锁的分子标记的报道。因此，寻找与抗性基因紧密连锁的稳定、简单的分子标记不仅可应用到分子辅助育种中，提高甘蓝抗病育种效率，在农业上有重要的应用价值，而且还可以为进一步克隆相关的抗病基因并分析其功能奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一个与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记BoR_AAG/CTC112及其获得的方法。

本发明实现其发明目的所采取的技术手段是：该与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记BoR_AAG/CTC112为SEQ ID No.1的序列，序列的长度共191bp。

本发明所述的分子标记BoR_AAG/CTC112的获得方法主要包括以下步骤：

1)利用经过多代自交选育出的结球甘蓝的抗病亲本‘R103’和感病亲本‘S101’，将所述抗病亲本‘R103’和感病亲本‘S101’进行杂交得到F₁群体，并构建相应的BC₁、F₂群体；

2)根据田间自然发病材料的病害症状，以及病原物镜检和回接鉴定，明确该病害的病原是十字花科霜霉菌；

3)经过对BC₁、F₂群体田间自然诱发鉴定和苗期人工接种鉴定，进行抗病性调查发现在所述BC₁、F₂群体中对霜霉病的抗性受单基因显性控制；

4)利用AFLP分子标记技术，运用改良BSA法进行与结球甘蓝霜霉病抗性相关的差异片段的筛选；

5)筛选出一个AFLP差异片段BoR_AAG/CTC，将该AFLP差异片段BoR_AAG/CTC转化为SCAR标记BoR_AAG/CTC112，设计的引物为F_AAG/CTC112：5`-ATCCTACTGGTCCATACTCAC-3`和R_AAG/CTC112：5`-TAGAAAATTTGGACATTCAT-3`；经单株验证分析，该SCAR标记BoR_AAG/CTC112与抗性基因的遗传距离为5.7cM。

本发明采用AFLP分子标记方法对结球甘蓝抗、感亲本及F₂分离群体运用改良BSA法构建的抗、感池进行抗霜霉病标记的筛选，然后将得到与结球甘蓝抗霜霉病相关的差异片段，该片段实际长191 bp。将该片段转化为简单、稳定的SCAR标记BoR_AAG/CTC112。同时，经F₂代群体160个单株的SCAR验证，利用Mapmaker/EXP3.0软件进行分析，BoR_AAG/CTC112标记与抗病基因遗传连锁距离为5.7cM。该标记可用于结球甘蓝抗霜霉病的辅助选择育种。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

霜霉病是目前影响结球甘蓝生产的一种严重病害。本发明利用AFLP分子标记方法，结合改良的BSA法得到一个与结球甘蓝霜霉病抗性相关的差异片段，并通过克隆、测序、引物设计，将该片段转化成稳定简单的SCAR标记，可直接用于结球甘蓝抗霜霉病分子标记的辅助选择育种。利用该分子标记，不仅克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点，还可以有目的的聚合多个抗霜霉病基因，培育出具有稳定抗性的结球甘蓝品种。同时也可利用这个新霜霉病抗性基因的分子标记克隆抗霜霉病基因，并对其进行结构和功能分析，这对于进一步了解结球甘蓝抗霜霉病的分子遗传机理有积极意义。因此，本发明在结球甘蓝育种实践及抗病理论研究上均具有重要意义。

附图说明

图1是结球甘蓝霜霉病菌图，该霜霉病菌为寄生霜霉(Hyaloperonospora)；

图2是两个亲本和两对抗感池预扩产物1％琼脂糖凝胶电泳图；

图3是AFLP特异条带的筛选及另一对池和亲本的验证谱带图；

图4是SCAR在两亲本、两对池、F₁、BC₁中的分布谱带图；

图5是SCAR标记在抗病单株和感病单株中的分布谱带图；

图6是SCAR标记在30份材料中验证谱带图；

其中，图2-6中符号分别表示为：

1.抗病亲本；2.感病亲本；3.第一抗病池；4.第一感病池；5.第二抗病池；6.第二感病池；7.F₁群体；8.感病亲本为回交亲本的BC₁感病群体；9.感病亲本为回交亲本的BC₁抗病群体；10.抗病亲本为回交亲本的BC₁；

M：1000bp pUC mix marker；

R：有BOR_AAG/CTC112特异带的杂交后代抗病单株；

R*：没有该特异带，但表型为抗病的杂交后代单株；

S：没有BOR_AAG/CTC112特异带的杂交后代感病单株；

S*：有该特异带的感病单株，表型为感病的杂交后代单株。

具体实施方式

本发明与结球甘蓝抗霜霉病分子标记BoR_AAG/CTC112的获得方法主要包括以下步骤：

(1)利用经过多代自交选育出的结球甘蓝的抗病亲本‘R103’和感病亲本‘S101’，两者进行杂交得到F₁群体，并构建了相应的BC₁、F₂群体。根据田间发病材料的病害症状，以及病原物镜检和回接鉴定，明确该病害的病原是十字花科霜霉菌(即寄生霜霉)。利用田间自然诱发抗性鉴定和苗期人工接种抗性鉴定，表明结球甘蓝对霜霉病的抗性受单基因显性控制。

具体做法为：对经多年选育的结球甘蓝的抗病亲本‘R103’和感病亲本‘S101’整个生长过程中的霜霉病等病害发生情况进行调查，记载发病率、病情指数，并观察和描述症状。采集‘S101’的新鲜病叶，并进行处理，培养新生孢子囊产生后，制作临时镜检片，观察病菌孢囊梗和孢子囊的形态特征。另用80％α-羟基丙酸浸泡田间病叶表皮组织，在150倍显微镜下观察卵孢子形态特征，重复试验以明确病原。如图1所示：说明孢子梗和孢子囊的形态特征与十字花科寄生霜霉相一致。田间自然诱发抗性鉴定，采用五点法进行调查抗病性，对‘R103’、‘S101’、F₂和BC₁群体进行发病情况调查，调查级别分为免疫、高抗、抗病、耐病、感病和高感，并随机镜检发病植株的病原菌。田间苗期人工接种鉴定，即在结球甘蓝拉十字期，将从感病亲本材料上得到的病菌，并进行重新培养后，采用孢子悬浮液喷雾法接种，接种7天后进行抗性调查。

(2)用AFLP分子标记方法，得到与结球甘蓝霜霉病抗性相关的差异片段BOR_AAG/CTC。

具体做法是：抗病亲本多代自交系‘R103’为抗病基因供体，与多代自交系‘S101’感病材料进行杂交，并构建F₂群体用于研究，用AFLP分子标记与改良BSA方法相结合得到与结球甘蓝霜霉病相关的差异片段BOR_AAC/CTC。

1)采用CTAB法提取与纯化甘蓝基因组DNA

具体做法为：取结球甘蓝新鲜的嫩叶0.5g，在液氮中研磨成粉末，迅速加入DNA提取缓冲液2％CTAB(2％CTAB，50mmol·L^-1 Tris pH 8.0，20mmol·L^-1EDTA，1％PVP-360，1.4mol·L^-1NaCl，0.2％疏基乙醇)，充分混匀后，65℃温浴45min，其间颠倒混匀2次。在20℃下，12000rpm离心20min，取上清，加入等体积预冷的氯仿：异戊醇(24∶1)抽提，缓慢颠倒混匀。在4℃下，12000rpm离心10min，取上清液，加入上清体积2/3预冷的异丙醇，缓慢混匀。置于-20℃下培养30min。在4℃下，13000rpm离心10min，弃上清。加入1mL预冷的70％乙醇洗涤两次DNA沉淀，微干。加200μL TE，溶解DNA，加2μL 10mg·mL^-1RNAse 37℃水浴60min，加入等体积200μL预冷的氯仿∶异戊醇(24∶1)混匀，静置10min。在4℃下，12000离心10min，取上清加入1/9体积的3mol·L^-1NaAc，2倍体积冷的无水乙醇。-20℃放置30min。在4℃下13000rpm，离心15min，用70％的冷乙醇洗沉淀两次，再用无水乙醇漂洗1次，风干后，加50μL ddH₂O溶解。紫外分光光度法检测DNA样品的浓度及质量，0.8％的琼脂糖凝胶(含0.5％μg/μL Goldview)电泳检测DNA的质量。

2)抗、感基因池的构建

具体做法为：本发明采用改良的BSA法分别构建抗病池和感病池，用于AFLP引物的多态性筛选。F₂单株DNA提取后各取极端抗病和感病10个单株DNA等量混合，构建1对抗感池，采用相同的方法另选不同单株构建另1对抗感池。抗病亲本‘R103’和感病亲本‘S103’DNA采用10株混合样DNA。

(3)扩增多态性DNA(AFLP)分析

具体做法为：AFLP接头和引物由上海生物工程合成。1对EcoR I和MseI预扩引物，8个EcoR I和8个Mse I选择性引物，共构成64对选扩引物组合进行筛选。

i.酶切基因组DNA取150ng基因组DNA，采用EcoR I和Mse I进行双酶切。酶切体系：2.5U EcoRI 0.125μL，2.5UMse I 0.25μL，10×Y+/TangoBuffer(with 10×BSA)5.0μL，补dd H2O终体系为25μL。37℃酶切6h，酶切后于70℃水浴处理15min灭活酶。

ii.人工接头连接在酶切产物中加ddH₂O 0.6μL，10×连接Buffer3.0μL，EcoR I接头0.5μL，Mse I接头0.5μL，T₄DNA连接酶0.4μL，终体系为30μL。20℃或室温连接过夜。

iii.预扩增预扩增体系25μL：ddH₂O 18.1μL，连接后DNA模板2.5μL，EcoR I引物(50ng·μL^-1)0.7μL，Mse I引物(50ng·μL^-1)0.7μL，dNTPs(10mmol·L^-1)0.5μL，10×PCR reaction buffer(with Mg²⁺)2.0μL，2U Taq Polymerase 2.5μL。预扩增的PCR反应程序为94℃30s，56℃30s，72℃60s，16个循环。产物在1.2％的琼脂糖凝胶(含0.5％μg/μLGoldview)电泳检测，紫外灯下观察并拍照，表明基因组DNA酶切充分，接头连接较好，可以继续进行AFLP分析。图2是第一抗病池3、第一感病池4、第二抗病池5、第二感病池6的预扩结果，其中，图2中的M为1000bp pUC mixmarker。

iV.选择性扩增选择性扩增体系20μL：模板(预扩产物×50)0.5μL，EcoR I引物(20ng·μL^-1)0.25μL，Mse I引物(20ng·μL^-1)1.5μL，dNTPs(10mmol·L^-1)0.4μL，10×PCR reaction buffer(with Mg²⁺)2.0μL，2U Taq Polymerase 0.5μL，ddH₂O 14.85μL。选择性扩增程序为：94℃预变性120s，94℃30s，65℃30s，72℃60s，然后每个循环退火温度降低0.7℃，经13个循环后，退火温度降至56℃，再进行28个以下循环的扩增：94℃30s，56℃30s，72℃60s后72℃延伸420s。产物于6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，然后用银染方法显色。

V.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将玻璃板洗涤干净。干燥后，平板用BindingSilane擦拭，U型板用Sigmacote处理。将平板平放，取0.4mm的Space置于左右两侧，将U型板压于其上，夹子固定。配置60mL 6％聚丙烯酰胺凝胶(25.2g尿素+6.8mL 40％的胶原液+6mL 10×TBE，加水至60mL)的，灌入上述准备好的玻璃板中(灌入前胶中加入30μLTEMED和300μL10％AP)。插梳子，聚合3h以上或过夜。胶聚合后，将玻璃板安装在电泳仪上，60W恒功率预电泳30min。将AFLP选择性扩增样品加入等体积的Loading Buffer(98％甲酰胺，10mM EDTA，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青)，95℃变性5min，立即置于冰上冷却。每份样品取4μL上样，电泳至距胶底部约10cm处，终止电泳。

Vi.银染显色将电泳后的平板放入加有1L固定液(900mL ddH₂O中加入100mL冰醋酸)的托盘中，轻摇20min。然后用1L ddH₂O漂洗凝胶3次，每次2min，将玻板取出，让玻板竖直滴干10～20s，再用1L染色液(1g AgNO₃和1.5mL 37％甲醛溶于1L ddH₂O中)染色30min，随后用1L ddH₂O漂洗1次，立即将胶置于预冷的显色液(30g Na₂CO₃溶于1L ddH₂O中，冰浴至10℃，显色前加入1.5mL 37％甲醛和200μL 10mg·mL^-1Na₂S₂O₃)中，轻摇显色，直至胶上大部分条带都清晰出现。最后在显色完成后，用1L ddH₂O漂洗凝胶2次，每次2min，将玻板取出自然晾干或将胶面放于通风厨中充分干燥，可以用照相机拍照或用扫描仪进行扫描成像。

我们利用64对引物对抗、感池进行了AFLP分析，发现在引物组合EcoRl-AAG/Msel-CTC的扩增产物在抗病池中出现特异条带。图3是该引物组合扩增的结果，重复实验三次，此带仍能稳定出现，由此说明这条特异带可能与结球甘蓝霜霉病抗性存在联系。

3)AFLP差异片段转化为稳定的SCAR标记BOR_AAG/CTC112

具体做法是：为了将AFLP分析得到的差异片段BOR_AAG/CTC转化成稳定简单的SCAR标记，将该差异片段用上海生物工程公司的UNIQ-5柱离心式DNA胶回收试剂盒纯化，纯化的DNA片段与

easy Vector(Promega)连接，转化大肠杆菌Jm109，重组质粒PRC产物电泳检测，EcoRI酶切鉴定，获得阳性克隆子，送Sangon测序。将测序结果用生物信息学SMS进行分析，并通过Internet与GenBank国际基因数据库进行同源性分析。经双端测序后，该片段共由191bp组成。该序列为SEQ ID No.1的序列。由于从GenBank没有查询到相关的基因与该片段同源，该片段可以认为是结球甘蓝‘R103’中与抗霜霉病相关的新的片段。

根据克隆片段的DNA序列，我们合成了一对SCAR标记引物，该对引物序列如下：F_AAG/CTC112：5`-ATCCTACTGGTCCATACTCAC-3`

    R_AAG/CTC112：5`-TAGAAAATTTGGAAAGTTCAT-3`

用上述引物在抗感亲本、2对抗感池、F₁、BC₁群体中分别进行扩增，反应体系为：10×PCR反应缓冲液2μL(with Mg²⁺)，dNTP(10mmol·L^-1)0.4μL，引物1(10μM)0.5μL，引物2(10μM)0.5μL，5U Taq E 0.2μL，模板DNA(50ng·μL^-1)1μL，ddH₂O 15.4μL，总体积20μL；反应程序为：94℃180s，94℃30s，53℃30s，72℃30s，35个循环，72℃420s，。扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶(含0.5％μg/μL Goldview)上电泳检测，紫外反射投射分析仪观察并照相。扩增结果证明，在抗病亲本、2个抗病池、、以抗病亲本为回交亲本的BC₁和以感病亲本为回交亲本的抗病群体中均扩增出110bp左右的一条特异带，而在感病亲本、感病池和以感病亲本为回交亲本的感病群体中没有检测到这条特异带。由此说明AFLP得到的差异片段确实与结球甘蓝霜霉病抗性有关。具体可参看图4。

结球甘蓝抗病亲本‘R103’和感病亲本‘S101’杂交构建的F₂分离群体中，经田间自然鉴定后的抗、感单株分别提取总DNA，用上述同样的反应体系及程序，用上述SCAR引物进行单株的PCR扩增，统计抗、感单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用Mapmaker EXP3.0b计算标记与抗霜霉病基因之间的遗传距离。结果显示(图5所示)，96个抗病单株中有94株存在特异带，2株没有特异带；35株感病单株中5株有特异带，其他的均没有特异带。这一实验结果表明特异SCAR标记是与结球甘蓝抗病性是紧密连锁的，但在抗病和感病单株中有一定的交换，交换率为5.3％，经计算SCAR标记BOR_AAG/CTC112与抗病基因的遗传距离为5.7cM。如图5所示：R是有BOR_AAG/CTC112特异带的杂交后代抗病单株；R*是没有该特异带，但表型为抗病的杂交后代单株，表明发生了交换；S是没有BOR_AAG/CTC112特异带的杂交后代感病单株，S*是有该特异带的感病单株，表型为感病的杂交后代单株，表明也发生了交换。

为了检测这个SCAR标记的可靠性，我们用20份多代自交所得的材料进行验证。10份抗病材料中都有该特异带，10份抗病和感病杂交材料中也可以扩出该条带，在10份感病材料中有1份中得到了特异条带。如图6所示：R是有BOR_AAG/CTC112特异带的杂交后代抗病材料；S是没有BOR_AAG/CTC112特异带的杂交后代感病材料，S*是有该特异带的感病材料，表型为感病的感病材料，表明该SCAR标记可直接用于结球甘蓝霜霉病抗病育种。

上述实施用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记BoR_AAG/CTC112序列表

<110>浙江大学

     江苏省农业科学院蔬菜研究所

<120>与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记BoRAAG/CTC112及其获得方法

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>191

<212>DNA

<213>结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)

<400>1

gactgcgtac caattcaagg cttctgtgag agctcaggga taactcgaca tcctactggt    60

ccatactcac cgcagcagaa tggagtagta gagcgtcgaa acagaaccct tctcgagatg    120

actaggagca taatgaaaca tatgaatgtt ccaaattttc tatgggggga aggagttact    180

caggactcat c                                                         191

Claims (2)

1.一种与结球甘蓝抗霜霉病基因相连锁的分子标记BoR_AAG/CTC112，其特征在于：为SEQ ID No.1的序列，序列的长度共191bp。

2.一种权利要求1所述的分子标记BoR_AAG/CTC112的获得方法，其特征在于包括以下步骤：

1)利用经过多代自交选育出的结球甘蓝的抗病亲本‘R103’和感病亲本‘S101’，将所述抗病亲本‘R103’和感病亲本‘S101’进行杂交得到F₁群体，并构建相应的BC₁、F₂群体；

2)根据田间自然发病材料的病害症状，以及病原物镜检和回接鉴定，明确该病害的病原是十字花科霜霉菌；

3)经过对BC₁、F₂群体田间自然诱发鉴定和苗期人工接种鉴定，进行抗病性调查发现在所述BC₁、F₂群体中对霜霉病的抗性受单基因显性控制；

4)利用AFLP分子标记技术，运用改良BSA法进行与结球甘蓝霜霉病抗性相关的差异片段的筛选；

5)筛选出一个AFLP差异片段BoR_AAG/CTC，将该AFLP差异片段BoR_AAG/CTC转化为SCAR标记BoR_AAG/CTC112，设计的引物为F_AAG/CTC112：5`-ATCCTACTGGTCCATACTCAC-3`和R_AAG/CTC112：5`1-TAGAAAATTTGGACATTCAT-3`；经单株验证分析，该SCAR标记BoR_AAG/CTC112与抗性基因的遗传距离为5.7cM。

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