CN111417302A - 霜霉病抗性卷心菜及其培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及对霜霉病具有抗性的卷心菜或其子代。本发明还涉及霜霉病抗性卷心菜的培育方法，其包括从对霜霉病具有抗性的甘蓝植物将霜霉病抗性导入所期望的卷心菜。根据本发明，能够培育对霜霉病显示高抗性、并且作为卷心菜具有高商品价值的新型卷心菜株系及这样的卷心菜。

Description

霜霉病抗性卷心菜及其培育方法

对相关申请的引用

本申请基于作为在先日本专利申请的日本特愿2017-173823号(申请日：2017年9月11日)主张优先权权益，日本特愿2017-173823号的全部公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及赋予了霜霉病抗性的卷心菜及其培育方法。详细而言，本发明涉及具有位于序列号1～序列号7所示基因座的附近区域的霜霉病抗性基因的卷心菜、及其培育方法。

背景技术

十字花科作物中的霜霉病(Downy mildew)是由作为丝状菌之一的Hyaloperonospora brassicae(寄生霜霉菌芸薹属变种)引起的病害，其使以卷心菜、抱子甘蓝、花椰菜、西兰花、苤蓝等为代表的甘蓝(Brassica oleracea)种、白菜、芜菁、小松菜等芜菁(Brassica rapa)种、及油菜等油菜(Brassica napus)种等多种作物受害。

该病害的症状主要见于叶片，形成黄色至淡褐色的边界模糊的病斑，逐渐扩大，最终叶片枯萎掉落，因此对生长发育造成不良影响(图1)。另外，感染西兰花、花椰菜的花蕾、芜菁、萝卜的根部时，在组织内外引起褐色或黑色的变色，严重降低商品价值。尤其是在湿度高的环境中，病害扩散快而发展成大规模的受害，因此，通常利用灭菌剂等药剂来进行防治。

作为甘蓝中最重要的作物之一的卷心菜(B.oleracea var.capitata)存在各种各样的品种类群，在世界各国都栽培有适合其土壤、气候的品种。

然而，虽然卷心菜中存在针对霜霉病以不明遗传方式显示出中等程度抗性(推测其是由量化因素导致的)的株系，但尚未知晓存在基于单显性抗性因子的霜霉病抗性品种。

因此，在霜霉病高发的地区，为了减轻病害而需要利用药剂进行防治，为此耗费了大量的劳力、成本。因此，期望抗性育种材料的开发、及抗性品种的开发。

但是，尽管存在如上所述的强烈期望，据本申请的发明人所知，迄今为止仍未在卷心菜中培育出霜霉病抗性的品种。认为这是由于在卷心菜的遗传资源中不存在有用的霜霉病抗性因子。

另一方面，就作为卷心菜近缘物种的西兰花(B.oleracea var.italica)而言，关于霜霉病的抗性因子的遗传分析已有多篇报道(例如J.Amer Soc Hort Sci(2001)vol126p727(非专利文献1)、Euphytica(2002)vol128 p405(非专利文献2)、及Euphytica(2003)vol131 p65(非专利文献3))。

然而，迄今为止，这些西兰花中的抗性因子并未被用于卷心菜的育种。认为这是由于卷心菜与西兰花这两者的形态特征相差颇远。其原因在于，虽然西兰花与卷心菜同为甘蓝种，因而能够交配，但从卷心菜一方来看，由于存在很多无用的性状，因此极难作为育种材料操作。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：M.Wang等，J.Amer Soc Hort Sci(2001)vol.126 pp727-，“Inheritance of True Leaf Stage Downy Mildew Resistance in Broccoli”

非专利文献2：M.W.Farnham等，Euphytica(2002)vol.128pp405-，“A singledominant gene for downy mildew resistance in broccoli”.

非专利文献3：P.S.Coelho等，Euphytica(2003)vol.131pp65-，“Inheritance ofdowny mildew resistance in mature broccoli plants”

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供对霜霉病具有优异抗性的新型卷心菜及这样的卷心菜的培育方法。

用于解决课题的手段

本申请的发明人本次通过开发与霜霉病抗性因子连锁的标记并对其加以利用，从而成功地从西兰花和卷心菜的组合中培育出具有霜霉病抗性因子、并且作为卷心菜具有高商品价值的株系。

由本申请的发明人通过西兰花与卷心菜的交配得到的甘蓝植物在杂交当代、回交第一代中呈现如野生种那样的形态。然后，本申请的发明人通过筛选与霜霉病抗性连锁的标记、以及应用全基因组标记，经过重复回交而将与霜霉病不相关的基因组区域置换为卷心菜型的基因型，由此成功培育了对霜霉病显示高抗性的卷心菜。

即，本申请的发明人发现了具有针对多种变种的霜霉病抗性的西兰花株系，并且开发了与该株系所具有的霜霉病抗性因子连锁的标记，证明了通过利用这些标记能够培育产业利用价值高的卷心菜株系。通过利用由本发明提供的霜霉病抗性卷心菜、或霜霉病抗性卷心菜的培育方法，能够将霜霉病抗性赋予以往对霜霉病呈感病性的卷心菜。

本发明是基于上述见解而得的发明。

即，根据本发明，可提供以下的发明。

<1>对霜霉病具有抗性的卷心菜或其子代。

<2>前述<1>的霜霉病抗性卷心菜或其子代，其具有位于序列号1～序列号7中任意一者以上所示的基因座附近的霜霉病抗性基因。

<3>前述<1>或<2>的霜霉病抗性卷心菜或其子代，其具有霜霉病抗性基因，所述霜霉病抗性基因能利用具有序列号8～序列号21所示碱基序列的引物中的任意一种以上进行检测。

<4>前述<1>～<3>中任一项的霜霉病抗性卷心菜或其子代，其中，霜霉病为由Hyaloperonospora brassicae引起的病害。

<5>前述<1>～<4>中任一项的霜霉病抗性卷心菜或其子代，其中，霜霉病抗性基因是在由保藏编号FERM BP-22343确定的西兰花品种中发现的。

<6>前述<1>～<4>中任一项的霜霉病抗性卷心菜或其子代，其中，霜霉病抗性基因是在由保藏编号FERM BP-22344确定的卷心菜品种中发现的。

<7>前述<1>～<6>中任一项的卷心菜或其子代的植物体的一部分。

<8>前述<1>～<6>中任一项的卷心菜或其子代的种子。

<9>由保藏编号FERM BP-22344确定的对霜霉病具有抗性的杂交第一代卷心菜或其一部分、或者所述卷心菜的种子。

<10>霜霉病抗性卷心菜的培育方法，其包括从对霜霉病具有抗性的甘蓝植物将霜霉病抗性导入所期望的卷心菜。

<11>霜霉病抗性卷心菜的培育方法，其包括从对霜霉病具有抗性的甘蓝植物将霜霉病抗性导入所期望的卷心菜，所述霜霉病抗性源自位于序列号1～序列号7中任意一者以上所示的基因座附近的霜霉病抗性基因。

<12>前述<10>或<11>的霜霉病抗性卷心菜的培育方法，其中，对霜霉病具有抗性的甘蓝植物为卷心菜以外的甘蓝植物。

<13>前述<10>～<12>中任一项的培育方法，其中，对霜霉病具有抗性的甘蓝植物为由保藏编号FERM BP-22343确定的西兰花品种。

<14>前述<10>或<11>的培育方法，其中，对霜霉病具有抗性的甘蓝植物为由保藏编号FERM BP-22344确定的卷心菜品种。

<15>前述<10>～<14>中任一项的培育方法，其中，霜霉病抗性向所期望的卷心菜的导入是通过将该卷心菜连续回交来进行的。

<16>前述<10>～<15>中任一项的培育方法，其包括使用序列号1～序列号7所示的DNA序列中任意一者以上、或者能使该DNA序列扩增的一种以上引物或引物对来检验霜霉病抗性基因的存在。

<17>前述<16>的培育方法，其中，所述引物为序列号8～序列号21中任意一者以上所示的引物。

<19>能检测甘蓝植物中的霜霉病抗性基因座的标记，所述标记具有序列号1～序列号7所示碱基序列中的任意一者。

<20>能检测甘蓝植物中的霜霉病抗性基因座的引物组，所述引物组包含具有序列号8～序列号21所示碱基序列的引物中的任意一种以上。

<21>甘蓝植物中的霜霉病抗性的检测方法，其包括使用具有序列号1～序列号7所示碱基序列的标记中的任意一种以上、或具有序列号8～序列号21所示碱基序列的引物中的任意一种以上。

发明效果

本发明的霜霉病抗性卷心菜对由Hyaloperonospora brassicae引起的霜霉病具有优异的抗性。另外，通过将根据本发明的霜霉病抗性卷心菜作为材料，能够进一步培育新型霜霉病抗性卷心菜株系。此外，通过利用根据本发明的与霜霉病抗性连锁的标记，即使不实施接种试验，也能够进行霜霉病抗性的检测或筛选。通过栽培按照本发明培育而成的卷心菜株系，能够实现在因发生霜霉病而认为难以栽培的地区的卷心菜栽培，能够削减在以往所需的栽培中散布药剂的劳力、成本。另外，利用根据本发明的霜霉病抗性卷心菜，能够向市场供给抑制了药剂散布次数的蔬果，还能够抑制病害的发病率，因此能够收获优品率高的蔬果。

附图说明

[图1]表示由霜霉病接种试验导致的病征(左侧为感病性株系、右侧为抗性株系)。图中，左侧的感病性株系中，能够观察到在叶片的表面形成有黄色至褐色的病斑的情况。

[图2]表示在霜霉病抗性因子附近连锁的DNA标记的电泳图(实施例2)。

[图3]表示霜霉病抗性因子附近的连锁图谱(实施例3)。

[图4]表示实施例5的场圃试种中的发病评分的基准。

[图5]表示通过本发明(实施例5)培育的卷心菜株系的场圃试种结果。示出了“CB-20”(原始亲本株系)、和导入了霜霉病抗性因子的等基因系(isogenic line)的情况。

[图6]表示通过本发明(实施例5)培育的3个卷心菜株系的场圃试种结果。

[图7]表示使用了通过本发明培育的卷心菜亲本株系“DMR-CB-20”的杂交第1代(F1)品种的试种结果(实施例6)。

[图8-1]图8表示标记(DMTLR-1～DMTLR-7)的碱基序列。

[图8-2]图8表示标记(DMTLR-1～DMTLR-7)的碱基序列。

[图8-3]图8表示标记(DMTLR-1～DMTLR-7)的碱基序列。

[图8-4]图8表示标记(DMTLR-1～DMTLR-7)的碱基序列。

[图8-5]图8表示标记(DMTLR-1～DMTLR-7)的碱基序列。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

霜霉病抗性卷心菜

本发明如前文所述，涉及对霜霉病具有抗性的卷心菜(霜霉病抗性卷心菜)或其子代。

本说明书中，“子代”也包含使根据本发明的霜霉病抗性卷心菜、与能与该植物交配的甘蓝植物进行交配而得的杂交种。因此，“子代”也包含例如将根据本发明的霜霉病抗性卷心菜作为花粉亲本(父本)、将能与该植物交配的甘蓝植物作为种子亲本(母本)进行交配而得的子代。另外，“子代”也包含例如通过根据本发明的霜霉病抗性卷心菜、与能与该卷心菜融合的植物的细胞融合而得的植物、种属间杂交植物。

另外，此处所谓“甘蓝植物”，为十字花科的植物，是指芸薹属植物的甘蓝种的植物，其中包括B.oleracea var.capitata(卷心菜)、B.oleracea var.italica(西兰花)、B.oleracea var.botrytis(花椰菜)、B.oleracea var.gemmifera(抱子甘蓝)、B.oleraceavar.gongyloides(苤蓝)、B.oleracea var.acephara(叶牡丹、羽衣甘蓝)、及B.oleraceavar.albograbra(芥蓝)等。

此处所谓“卷心菜”，是属于甘蓝种、并且被分类为B.oleracea var.capitata的植物种。

本说明书中，“霜霉病”表示由卵菌之中属于霜霉(Peronosporaceae)科的菌导致的病害，优选表示由Hyaloperonospora brassicae导致的病害。因此，此处所谓对霜霉病的抗性，表示对由如上所述的菌导致的病害的抗性。

由此，根据本发明的霜霉病抗性卷心菜对霜霉病菌(优选为Hyaloperonospora brassicae)显示抗性，且呈单显性表达。通过以该植物作为材料，能够实现具有霜霉病抗性的新型卷心菜亲本株系的培育。

此处，“亲本株系”是为了繁育杂交品种而培育的株系，通常以表型不同的2种以上亲本株系作为材料，使它们交配而繁育杂交品种。

因此，本发明中的“霜霉病抗性”表示对作为霜霉病菌的Hyaloperonospora brassicae的抗性，更具体而言，是基于位于序列号1～序列号7附近的因子的抗性。

即，根据本发明的优选方式，根据本发明的霜霉病抗性卷心菜或其子代具有位于序列号1～序列号7中任意一者以上所示的基因座附近的霜霉病抗性基因。

此处，“序列号1～序列号7中任意一者以上所示”包含下述情况：序列号1～序列号7所示的碱基序列在一定的序列同一性的范围内，或者是具有部分突变的范围的碱基序列。本领域技术人员能够容易地理解可以视作与序列号1～序列号7自身等同的范围的序列。

因此，例如“序列号1～序列号7中任意一者以上所示”以也包括以下(a)～(c)的碱基序列中任意一者以上所示的情况的含义使用。

(a)序列号1～序列号7所示的、任意一者以上的碱基序列；

(b)与序列号1～序列号7所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的、任意一者以上的碱基序列；及

(c)将序列号1～序列号7所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入、及/或添加而得的、任意一者以上的碱基序列。

因此，根据本发明的一个优选方式，可认为根据本发明的霜霉病抗性卷心菜或其子代具有位于前述的(a)～(c)所示的任意一者以上的碱基序列所示的基因座附近的霜霉病抗性基因。

此处，前述(b)中，“与序列号1～序列号7所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性”是指包含下述这样的序列号，所述序列号在使用BLAST、FASTA等用于同源性检索的已知算法(例如，使用缺省即初始设定的参数)计算时，与序列号1～序列号7所示的碱基序列具有至少95％、优选至少96％、进一步优选至少97％、进一步更优选98％、特别优选至少99％的序列同一性。

此处，“序列同一性”是指例如将2条碱基(核苷酸)序列进行比对时(其中可以引入空位，也可以不引入空位)、一致的碱基数量相对于包括空位在内的碱基总数的比例(％)。

另外，前述(c)中，“将序列号1～序列号7所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入、及/或添加而得的”记载中的“多个”是指例如10个左右，优选为8个，更优选为6个，进一步优选为5个，进一步更优选为4个，较之前述而言更优选为3个，较之前述而言进一步优选为2个，特别优选为1个。

根据本发明的一个优选方式，序列号1～序列号7可以分别是序列号22～28。此处，序列号22～28包含被引物夹持的序列号1～7的序列(也包含引物的序列)的外侧的序列，是本申请的发明人在后述的实施例2中首次发现的。

因此，在“序列号22～28中任意一者以上所示”这样的情况下，仅就包含在这些序列中的序列号1～7的部分而言，使用包括前述(a)～(c)的碱基序列中任意一者以上所示序列的含义，此外，就序列号22～28而言，使用还包括以下(a’)～(c’)的碱基序列中任意一者以上所示的情况的含义。

(a’)序列号22～序列号28所示的、任意一者以上的碱基序列；

(b’)与序列号22～序列号28所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的、任意一者以上的碱基序列；及

(c’)将序列号22～序列号28所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入、及/或添加而得的、任意一者以上的碱基序列。

此处，前述(b’)中，“与序列号22～序列号28所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性”是指包含下述这样的序列号，所述序列号在使用BLAST、FASTA等用于同源性检索的已知算法(例如，使用缺省即初始设定的参数)计算时，与序列号22～序列号28所示的碱基序列具有至少95％、优选至少96％、进一步优选至少97％、进一步更优选98％、特别优选至少99％的序列同一性。

另外，前述(c’)中，“将序列号22～序列号28所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入、及/或添加而得的”记载中的“多个”是指例如10个左右，优选为8个，更优选为6个，进一步优选为5个，进一步更优选为4个，较之前述而言更优选为3个，较之前述而言进一步优选为2个，特别优选为1个。

另外，本发明中所谓“附近”，本领域技术人员可根据标记的位置与霜霉病抗性基因的关系、及本领域技术人员的常识而容易地理解其可以是何种程度的距离。若举例而言，虽然也取决于分析条件，但可以是例如10cM左右的距离、或10cM以下(例如7cM)。

另外，使用序列号1～序列号7所示的碱基序列作为标记，从能由它们表示的基因座出发，能够推定或确认位于基因座附近的霜霉病抗性基因的存在。

因此，根据本发明的其他方式，可提供能检测甘蓝植物中的霜霉病抗性基因座的标记，所述标记具有序列号1～序列号7所示碱基序列中的任意一者。

另外，也可提供甘蓝植物中的霜霉病抗性的检测方法，其包括使用序列号1～序列号7所示的DNA序列中任意一者以上的标记来检验霜霉病抗性基因的存在。

并且，此处，只要能够确定霜霉病抗性基因，则“序列号1～序列号7所示碱基序列中的任意一者”也可包含前述的(a)～(c)所示碱基序列中的任意一者。

这些标记的检测可按照例如PCR法、实时PCR法、RFLP法、LAMP法、SNPs基因分型芯片法等这样本领域技术人员公知的方法实施。

如上所述，通过利用这样的标记及检测方法，能够确认是否为根据本发明的“具有位于序列号1～序列号7中任意一者以上所示的基因座附近的霜霉病抗性基因的、霜霉病抗性卷心菜或其子代”。

根据本发明的优选方式，具有能利用1种以上引物或引物对检测的霜霉病抗性基因，所述1种以上引物或引物对能扩增序列号1～序列号7所示的DNA序列。

根据本发明的更优选方式，根据本发明的霜霉病抗性卷心菜或其子代具有能利用具有序列号8～序列号21所示碱基序列的引物中任意一者以上检测的霜霉病抗性基因。需要说明的是，这些引物在下文中有时称为“DMTLR标记”。

此处，所谓DNA标记“具有”碱基序列，是指该标记具有该碱基序列。本发明中，DNA标记可以意指将对应的碱基序列内的碱基中的任意一个或数个(例如，1个、2个或3个，优选为1个或2个，更优选为1个)进行取代、缺失、添加或删除，或者，可以是包含对应的碱基序列作为一部分、且保持规定的性质的序列。这样的情况下，用语“具有”可语义转换为“包含”。另外，针对允许取代、缺失、添加或删除1个碱基的情况，可将“具有”语义转换为“实质上由......组成”。

此处所谓的霜霉病抗性可通过使用上述碱基序列8～21所示的引物实施PCR来检测、确认。

因此，根据本发明的其他方式，可提供能检测甘蓝植物中的霜霉病抗性基因座的引物组，所述引物组包含具有序列号8～序列号21所示碱基序列的引物中的任意一种以上。

另外，根据本发明的其他方式，可提供检测甘蓝植物中的霜霉病抗性的方法，其包括使用具有序列号1～序列号7所示碱基序列的标记中的任意一种以上、或具有序列号8～序列号21所示碱基序列的引物中的任意一种以上。

若使用这些DNA标记，则即使不进行基于接种试验的筛选，也能够高效地培育具有霜霉病抗性的新型卷心菜株系。

根据本发明的霜霉病抗性卷心菜具有如下所述的特征。

(1)具体而言，是在霜霉病抗性基因座附近具有序列号1～序列号7所示的DNA序列的植物，是通过具有其等位基因而显示霜霉病抗性的植物。

(2)通过将具有上述序列的株系用于交配材料，能够培育具有霜霉病抗性的新型卷心菜亲本株系。在导入霜霉病抗性时，可基于接种试验进行确认，但也可选出基于序列号1～序列号7制备的DNA标记、根据公共信息位于该序列号1～序列号7附近的DNA序列，设计新的标记，用于抗性植物的筛选。此外，也可通过使用霜霉病抗性基因座附近的标记，来筛选将与霜霉病抗性基因座连锁的非目标性状分离的个体。

(3)如此开发的本发明的卷心菜对作为霜霉病菌的Hyaloperonospora brassicae具有抗性，因此，能够削减栽培期间为防治病害而散布灭菌剂的劳力、成本。

根据本发明的一个优选方式，根据本发明的霜霉病抗性卷心菜或其子代可以是下述中的任一者：

1)霜霉病抗性卷心菜或其子代，其中，霜霉病抗性基因是在由保藏编号FERM BP-22343确定的西兰花品种中发现的；

2)霜霉病抗性卷心菜或其子代，其中，霜霉病抗性基因是在由保藏编号FERM BP-22344确定的卷心菜品种中发现的；及

3)由保藏编号FERM BP-22344确定的对霜霉病具有抗性的杂交第一代卷心菜。

此处所谓“发现”霜霉病抗性基因，是指霜霉病抗性卷心菜或其子代具有存在于其特定品种中的基因。即，所谓“霜霉病抗性卷心菜或其子代，其中，霜霉病抗性基因是在由保藏编号FERM BP-22343确定的西兰花品种中发现的”，意味着只要具有在由保藏编号FERMBP-22343确定的西兰花品种中发现的霜霉病抗性基因即可，不限于由保藏编号FERM BP-22343确定的西兰花品种，而是包含任何品种。

根据本发明的其他方式，本发明也涉及根据本发明的霜霉病抗性卷心菜或其子代的植物体的一部分、或者它们的种子。

此处，“植物体的一部分”包含花、叶、茎、根等器官或它们的一部分或者组织、或者来自这些器官或组织的细胞、细胞的聚集体等。

霜霉病抗性卷心菜的培育方法

根据本发明的霜霉病抗性卷心菜的培育方法如前文所述，包括从对霜霉病具有抗性的甘蓝植物将霜霉病抗性导入所期望的卷心菜。

此处，“对霜霉病具有抗性的甘蓝植物”表示针对霜霉病、优选由Hyaloperonospora brassicae导致的霜霉病，对发病、感染后的病害发展具有抗性的甘蓝植物，例如，可实施所准备的霜霉病菌(优选为Hyaloperonospora brassicae菌)的接种试验，判定是否对其具有抗性从而得到。更优选为在该接种试验中、植物所保持的抗性因子呈单显性表达的甘蓝植物。更具体而言，例如，可以按照后述实施例1来实施接种试验，确认是否为能在本发明的培育方法中使用的“对霜霉病具有抗性的甘蓝植物”。

“对霜霉病具有抗性的甘蓝植物”优选为卷心菜以外的甘蓝植物。

“对霜霉病具有抗性的甘蓝植物”更优选为由保藏编号FERM BP-22343确定的西兰花品种、或由保藏编号FERM BP-22344确定的卷心菜品种。

另外，本发明的培育方法中，所谓“将霜霉病抗性导入所期望的卷心菜”，表示将“对霜霉病具有抗性的甘蓝植物”所具有的霜霉病抗性因子导入所期望的卷心菜，以使卷心菜具有霜霉病抗性。

另外，所谓“所期望的卷心菜”，表示不具有霜霉病抗性并且能与“对霜霉病具有抗性的甘蓝植物”交配的、希望导入霜霉病抗性的卷心菜。这样的卷心菜具有作为卷心菜的有用的性状。

此处所谓的“霜霉病抗性”可利用如霜霉病的接种试验这样的已知手段进行确认，但是更详细而言，其源自位于序列号1～序列号7中任意一者以上所示的基因座附近的霜霉病抗性基因。

霜霉病抗性的导入表示将能表达霜霉病抗性的基因导入所期望的卷心菜。本发明中，典型而言，这样的导入可以如下实施：使“对霜霉病具有抗性的甘蓝植物”与所期望的卷心菜交配，从得到的杂交子代中筛选具有所期望的霜霉病抗性的卷心菜，进一步将该卷心菜作为回交亲本进行回交。

作为在交配后确认杂交子代中的霜霉病抗性的手段，可以是霜霉病的接种试验(例如可参见实施例1)，也可选出基于序列号1～序列号7制备的DNA标记、根据公共信息位于该序列号1～序列号7附近的DNA序列，设计新的标记，用于抗性植物的筛选。作为这样的标记，包含前述的具有序列号1～序列号7所示碱基序列中的任意一者的标记、具有序列号8～序列号21所示碱基序列的引物。在进行回交的过程中也可同样地利用这些确认手段，进行霜霉病抗性子代的筛选。

由此，根据本发明的一个优选方式，本发明的培育方法中，包括使用序列号1～序列号7所示的DNA序列中任意一者以上的标记、或者能使该DNA序列扩增的1种以上引物或引物对来检验霜霉病抗性基因的存在。此外，前述引物更优选为序列号8～序列号21中任意一者以上所示的引物。

因此，根据本发明的优选方式，本发明的培育方法通过将所期望的卷心菜连续回交来向该卷心菜导入霜霉病抗性。更详细而言，本发明的培育方法包括：使对霜霉病具有抗性的甘蓝植物与所期望的卷心菜交配，筛选具有霜霉病抗性的杂交子代，进一步将所期望的卷心菜作为回交亲本进行连续回交。

需要说明的是，进行回交时，一般期望进行5～7次左右的回交。

进行高效的回交时，也可使用全基因组DNA标记从而在早期接近回交亲本。

例如，回交第一代(BC1F1)为分离世代，因此各个个体所具有的基因组置换率不同，若扩大群体的规模，因个体而异，也可能获得90％以上的基因组区域显示与回交亲本相同的基因型的个体。通过筛选这样的个体，能够在早期、以较少的世代数使霜霉病抗性的基因座以外的区域具备与回交亲本相同的基因型。

关于作为全基因组DNA标记可利用的具体手段，在具有回交亲本的基因组序列信息的情况下，可制备基于该信息的DNA标记，进行各基因座的基因分型。

另外，即使在没有回交亲本的基因组序列信息的情况下，也可通过利用RAPD(随机扩增多态性DNA，Random Amplified Polymorphic DNA)法、SRAP(相关序列扩增多态性，sequence-related amplified polymorphism)法、AFLP(扩增片段长度多态性，Amplifiedfragment length polymorphism)法等随机PCR法，从分离世代中筛选具有与回交亲本相近的基因型的个体。除此以外，如果是以能综合性分析基因组中分散存在的大量SNPs的方式设计而成的SNPs基因分型芯片(affymetrix公司制品、Illumina公司制品等)，则也可使用这样的手段进行分析。

如此培育的霜霉病抗性株系不仅可用作直接的品种，也可用作F1采种体系中的亲本双方或亲本之一。

因此，根据本发明的其他方式，还可提供使用通过本发明的培育方法得到的霜霉病抗性株系作为双亲本株系或一方的亲本株系的、F1株系的繁育方法及这样的F1株系种子的采种方法。

实施例

通过下述的实施例具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。

实施例1：

将坂田种苗株式会社持有的西兰花的遗传资源作为材料，发现了2个对2种霜霉病菌株(菌株Dm-A、及菌株Dm-B(其中，菌株Dm-B感染更多的品种))这两者显示抗性的西兰花株系(“BR-23”、及“BR-35”)。

为了鉴定这些抗性株系所具有的霜霉病抗性基因座，首先使用“BR-23”株系作为材料，与对前述2种菌株显示感病性的2个株系(“BR-4”、及“BR-24”)交配，制备表1所示的F2群体及BC1F1群体。

需要说明的是，作为世代标示，F1表示杂交第1代，BC1表示进行了1次回交的世代。即，“BC1F1”表示经过杂交第1代后、进一步进行了1次回交的世代。

对上述得到的群体实施了利用多寄主型寄生性菌株Dm-B的接种试验。

接种试验中，就发病的程度(发病度)而言，按照以下的发病评分对各个体的第1～3片叶子进行评价。

0：无病征；

1：形成褐色病斑，不形成孢子；

2：在褐色病斑上形成少数孢子；

3：形成中等程度的孢子；

4：形成大量孢子。

结果如表1所示。

如结果所示，F2群体分离成抗性：感病性为3∶1，另一方面，与感病性株系交配得到的BC1F1群体分离成1∶1。由此表明，本病害的抗性因子以单显性方式发挥作用。

[表1]

使用了西兰花“BR-23”的遗传分析(小规模群体)

实施例2：

将表1中观察到抗性与感病性分离的F2群体(作图群体-1、-2)、BC1F1群体(作图群体-3、-4)作为材料，利用混合分组分析法(BSA法)检索RAPD标记。

RAPD引物使用了OPERON公司设计的1180种10mer的引物、和BEX公司设计的460种12mer的引物。

对于混合池DNA而言，从作图群体-4的群体中选出4个抗性个体、4个感病性个体，使用它们的DNA，制备抗性个体的混合池DNA、和感病性个体的混合池DNA。

作为RAPD标记的一次筛选，针对前述的2种混合池DNA实施利用1640种引物的RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA)法，筛选了245种显示多态性的标记。

二次筛选中，从作图群体-4的群体中选出显示抗性的2个个体、和显示感病性的2个个体，将它们用做模板，筛选了36种显示出与在一次筛选中显示的多态性同样的模式(pattern)的标记。

三次筛选中，从作图群体-4的群体中选出显示抗性的4个个体、和显示感病性的4个个体，将它们用做模板，筛选了11种显示出与在二次筛选中显示的多态性同样的模式的标记。

针对在该阶段中表型和标记的分离模式大致一致的情况，面向作图群体-1～作图群体-4中的全部个体，确认标记和表型的评分产生了何种程度的矛盾，筛选与表型具有强相关性的标记。

针对在上述试验中确认了与霜霉病抗性因子的连锁的11种标记之中的7种标记，分析扩增后的DNA片段的碱基序列，设计序列特异性引物，由此尝试了SCAR(序列特异性扩增区，Sequence Characterized Amplified Region)化。

首先，将利用RAPD扩增得到的DNA片段从琼脂糖凝胶中切出，进行克隆后，分析碱基序列。由此，确定了前述的7种标记(DMTLR-1～DMTLR-7)的碱基序列(分别为序列号1～序列号7)(图8)。需要说明的是，对序列进行确定时，首先确定了序列号22～28的序列，这些序列具有分别被SCAR引物夹持的序列号1～7的序列(也包含SCAR引物的序列)。图8中，下划线部分所示的序列为SCAR引物，被SCAR引物夹持的序列(包含SCAR引物)分别相当于序列号1～7。

需要说明的是，此处，在克隆时，作为载体，使用pBluescriptII SK(-)(自Stratagene公司获得)，感受态细胞使用了JM109(E.coli JM109，自东洋纺株式会社获得)。碱基序列的分析使用了DNA测序仪ABI3130(Applied Biosystems公司制)。

关于已解码碱基序列的标记，为了能使目标序列特异性地扩增，使用“Primer3”软件(聚合酶链式反应(PCR)用引物的设计辅助软件，开源软件)，设计了引物(序列号8～21)(表2)。

另外，上述各引物(标记)的电泳试验的结果(电泳图)示于图2。

需要说明的是，本说明书中，将如此开发的标记称为“DMTLR标记”。

[表2]

实施例3：

使用与实施例2中所用的作图群体-2相同的F2群体，对针对霜霉病菌株Dm-A的抗性反应也进行了调查。

F2群体的规模设为240个个体(作为作图群体-5)，调查了各个体针对Dm-A的反应，结果显示了如表3那样的分离。需要说明的是，关于利用菌株Dm-A的接种试验，与实施例1的接种试验同样地实施并进行评价。

[表3]

使用了西兰花“BR-23”的遗传分析(大规模群体)

与利用实施例2中制备的SCAR标记得到的基因型进行比较，结果，能够确认与表型的高度相关。根据该结果，推测株系“BR-23”所具有的霜霉病抗性因子为单基因、且针对2种菌株显示抗性反应。

基于上述分析结果，使用用于分析标记的连锁关系的软件“Mapmaker 2.0”(Whitehead Institute)，分析该群体中的表型与各标记的连锁关系。

结果如图3的连锁图谱所示。

如结果所示，推测抗性因子位于序列号1～7的附近、尤其是与序列号4、序列号5非常接近的位置。

实施例4：

针对与实施例2中分析的抗性株系“BR-23”不同的株系“BR-35”，为了确认是否具有与株系“BR-23”相同的抗性因子，制备与感病性株系“BR-13”之间的F2分离群体，实施了利用菌株Dm-A的接种试验(表4)。需要说明的是，关于利用菌株Dm-A的接种试验，与实施例1的接种试验同样地实施并进行评价。

[表4]

进一步地，使用序列号8及9实施PCR，调查各个体的基因型，结果，该基因座呈抗性纯合型的42个个体、及呈杂合型的83个个体全部显示抗性(表5)。

[表5]

需要说明的是，表5示出将表4的作图群体-6的180个个体按DNA标记DMTLR-1的基因型进行分类得到的结果。

如上所述，标记所显示的多态性与表型呈极高度相关，由此推测，2种西兰花霜霉病抗性株系“BR-23”及“BR-35”具有相同的抗性因子。

需要说明的是，“BR-35”所具有的霜霉病抗性基因可以在以“BR-35”作为亲本之一的西兰花F1品种“Sawayutaka(日文：沢ゅたか)”中发现。

前述西兰花F1品种“Sawayutaka”的种子已于2017年8月18日在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(千叶县木更津市上总镰足2-5-8 120号室)进行了国际保藏(原始保藏)(保藏人添加的识别用标示：SSC-BRO-17-001，保藏编号：FERM BP-22343)。

实施例5：

将坂田种苗株式会社持有的西兰花的株系“BR-23”和“BR-35”作为霜霉病抗性的材料，作为要导入该抗性的卷心菜，从4个品种组(叶深系、寒玉系、春系、球系)中分别选定各1个株系“CB-20”、“CB-35”、“CB-23”、或“CB-97”作为回交亲本株系，实施交配试验。

高效地进行回交(BC)时，基本而言，利用开发的DMTLR标记实施DNA检验，筛选该霜霉病抗性基因座分别呈杂合型的个体，在确认表型的同时，与“CB-20”、“CB-35”、“CB-23”及“CB-97”的各卷心菜株系连续回交。

首先，将西兰花株系“BR-23”及“BR-35”、与卷心菜株系“CB-20”、“CB-35”、“CB-23”及“CB-97”交配，采集F1种子，实施利用DMTLR标记的DNA筛选、和连续回交。

为了高效地进行回交，利用20种RAPD引物实施筛选，在各回交株系中，筛选出显示与各回交亲本株系“CB-20”、“CB-35”、“CB-23”及“CB-97”相近的基因型的个体。

结果，在“CB-20”中的BC2F1世代、其他的“CB-35”、“CB-23”及“CB-97”中的BC3F1世代，筛选出其RAPD标记与各自的回交亲本株系完全一致的个体。

另外，在BC2F1世代或BC3F1世代中，利用DMTLR标记判别抗性和感病性，分别针对每一种基因型，与各自的回交亲本株系一同在坂田种苗挂川综合研究中心及坂田种苗君津育种场中的任一处或两处的场圃中进行试种。

结果示于表6及图4～7。

表6示出向卷心菜株系“CB-20”中导入霜霉病抗性因子而得的株系在场圃中的试种结果及霜霉病的发病程度的评价结果。在回交中途的分离世代中，利用DMTLR标记判定为具有霜霉病抗性因子的个体即使是杂合体也显示抗性，判定为不具有霜霉病抗性因子的个体显示感病性。另外，关于表型，也显示出与作为回交亲本株系的叶深系的“CB-20”极为相近的植株外形(grass figure)。

[表6]

表6所示的各评分的病征示于图4。作为发病评分的基准，各发病程度表示以下的状态。

发病程度

0：无病斑；

1：病斑数量少；

2：病斑数量为中等程度；

3：病斑数量多。

另外，表6所示的“CB-20”(原始亲本株系)、和导入了霜霉病抗性因子的等基因系的照片示于图5。如图所示，相对于原始亲本株系“CB-20”而言，导入了霜霉病抗性因子的等基因系的霜霉病的发病得到了抑制。

此外，针对与其他3个卷心菜株系“CB-35”、“CB-23”及“CB-97”回交而得的株系，也同样地在场圃中实施了试种调查。

结果如图6所示。

如结果所示，确认到导入了抗性基因座的株系即使是杂合体，仍然在真叶及叶球中表达了抗性，并且，与寒玉系、春系、球系的亲本株系“CB-35”、“CB-23”及“CB-97”为同等水平。即，由图6可知，相对于原始亲本株系而言，导入了霜霉病抗性因子的等基因系的霜霉病的发病得到了抑制。

然后，针对对霜霉病的抗性尤其弱的叶深系的卷心菜“CB-20”株系，实施数次回交，从在挂川综合研究中心的场圃中栽培的株系中筛选20个个体，从花药·花粉培养得到霜霉病抗性的同型结合体，首次成功培育了作为F1品种的亲本兼具实用性性状的霜霉病抗性的卷心菜亲本株系。

实施例6：

此外，将赋予了霜霉病抗性的“DMR-CB-20”(上文中培育的DM卷心菜株系)作为花粉亲本，将另一有希望的卷心菜株系“CB-5”细胞质雄性不育株系作为种子亲本，繁育F1(品种试种名：SK3-005)。

将该F1株系在坂田种苗君津育种场中连续试种，确认了霜霉病抗性稳定地表达。

如此，完成了霜霉病抗性F1卷心菜品种的首次培育。

需要说明的是，对所培育的霜霉病抗性F1卷心菜品种进行采种得到的种子已于2017年8月18日在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(千叶县木更津市上总镰足2-5-8 120号室)进行了国际保藏(原始保藏)(保藏人添加的识别用标示：SSC-CSB-17-001，保藏编号：FERM BP-22344)。

将原始的F1品种(使用原始亲本株系“CB-20”得到的F1品种)与本次得到的赋予了霜霉病抗性的新型卷心菜F1品种(导入了霜霉病抗性的F1品种)进行比较。

结果如图7所示。

如图7所示，与原始的F1品种相比，赋予了霜霉病抗性的F1品种(左侧照片)的霜霉病的发病得到了抑制。

PCT/RO/134表

Claims (21)

1.对霜霉病具有抗性的卷心菜或其子代。

2.如权利要求1所述的霜霉病抗性卷心菜或其子代，其具有位于序列号1～序列号7中任意一者以上所示的基因座附近的霜霉病抗性基因。

3.如权利要求1或2所述的霜霉病抗性卷心菜或其子代，其具有霜霉病抗性基因，所述霜霉病抗性基因能利用具有序列号8～序列号21所示碱基序列的引物中的任意一种以上进行检测。

4.如权利要求1～3中任一项所述的霜霉病抗性卷心菜或其子代，其中，霜霉病为由Hyaloperonospora brassicae引起的病害。

5.如权利要求1～4中任一项所述的霜霉病抗性卷心菜或其子代，其中，霜霉病抗性基因是在由保藏编号FERM BP-22343确定的西兰花品种中发现的。

6.如权利要求1～4中任一项所述的霜霉病抗性卷心菜或其子代，其中，霜霉病抗性基因是在由保藏编号FERM BP-22344确定的卷心菜品种中发现的。

7.权利要求1～6中任一项所述的卷心菜或其子代的植物体的一部分。

8.权利要求1～6中任一项所述的卷心菜或其子代的种子。

9.由保藏编号FERM BP-22344确定的对霜霉病具有抗性的杂交第一代卷心菜或其一部分、或者所述卷心菜的种子。

10.霜霉病抗性卷心菜的培育方法，其包括从对霜霉病具有抗性的甘蓝植物将霜霉病抗性导入所期望的卷心菜。

11.霜霉病抗性卷心菜的培育方法，其包括从对霜霉病具有抗性的甘蓝植物将霜霉病抗性导入所期望的卷心菜，所述霜霉病抗性源自位于序列号1～序列号7中任意一者以上所示的基因座附近的霜霉病抗性基因。

12.如权利要求10或11所述的霜霉病抗性卷心菜的培育方法，其中，对霜霉病具有抗性的甘蓝植物为卷心菜以外的甘蓝植物。

13.如权利要求10～12中任一项所述的培育方法，其中，对霜霉病具有抗性的甘蓝植物为由保藏编号FERM BP-22343确定的西兰花品种。

14.如权利要求10或11所述的培育方法，其中，对霜霉病具有抗性的甘蓝植物为由保藏编号FERM BP-22344确定的卷心菜品种。

15.如权利要求10～14中任一项所述的培育方法，其中，霜霉病抗性向所期望的卷心菜的导入是通过将该卷心菜连续回交来进行的。

16.如权利要求10～15中任一项所述的培育方法，其包括使用序列号1～序列号7所示的DNA序列中任意一者以上、或者能使该DNA序列扩增的一种以上引物或引物对来检验霜霉病抗性基因的存在。

17.如权利要求16所述的培育方法，其中，所述引物为序列号8～序列号21中任意一者以上所示的引物。

18.如权利要求10～15中任一项所述的培育方法，其包括使用具有序列号8～序列号21所示碱基序列的引物中的任意一种以上来检验霜霉病抗性基因的存在。

19.能检测甘蓝植物中的霜霉病抗性基因座的标记，所述标记具有序列号1～序列号7所示碱基序列中的任意一者。

20.能检测甘蓝植物中的霜霉病抗性基因座的引物组，所述引物组包含具有序列号8～序列号21所示碱基序列的引物中的任意一种以上。

21.甘蓝植物中的霜霉病抗性的检测方法，其包括使用具有序列号1～序列号7所示碱基序列的标记中的任意一种以上、或具有序列号8～序列号21所示碱基序列的引物中的任意一种以上。

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