CN101812517B - 一种小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性的分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物抗病育种领域，具体涉及一种小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性的分子标记的制备及应用。本发明的特征是，通过自行设计的一对引物，从小麦基因组扩增出CYP709C1基因的特异片段，以该基因的特异性片段制备小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性的分子标记。检测分析表明，该基因的相对表达量与植物的抗赤霉病和苗腐病抗性紧密相关。本发明仅仅采用一个分子标记，即可鉴定不同小麦品种的在苗期和花期的小麦赤霉病穗腐和苗腐的抗性水平。本发明的分子标记可应用于小麦抗赤霉病苗腐和穗腐材料的筛选及分子育种上。

Description

一种小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性的分子标记

技术领域

本发明属于植物分子标记技术领域，具体涉及一种小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性的分子标记。

背景技术

由镰刀菌在花期和苗期分别引起的赤霉病穗腐(Fusarium head blight，FHB)和苗腐(Fusarium seedling blight，FSB)是在世界范围内严重危害麦类作物的重要病害之一。它不仅造成产量损失和质量下降，而且产生单端孢霉烯毒素严重危害人畜健康。赤霉病发病时，穗子上产生红色霉层，聚集大量的镰刀菌毒素。同时，镰刀菌真菌在种子萌发后会侵染幼苗，引起苗腐，并在幼苗发育的各个时期持续发生，但是症状较花期轻。苗腐可以为花期赤霉病穗腐提供病原菌，同种的F.graminearum或F.culmorum都可以引起小麦赤霉病穗腐或苗腐。

赤霉病没有天然抗源，传统的赤霉病抗性品种筛选主要集中在花期接种鉴定，受季节限制，工作量大且受自然条件影响较大。离体接种鉴定较花期接种更为简便，但是其结果往往不稳定。随着分子生物学的发展，赤霉病抗病小麦育种在传统育种的基础上以得到了很好的发展，例如利用分子标记技术可以用来检测不同品种的抗性QTL位点，并将这些分子标记用于抗病材料育种，但是一个分子标记往往只能代表一个发育时期的抗性，即有报道表明花期赤霉病穗腐抗性与苗腐抗性QTL不在同一位点，说明赤霉病穗腐和苗腐的抗病途径并不一致。因此需要发明一种更为快速，稳定且受环境影响小的花期和苗期通用抗性分子标记，为抗赤霉病穗腐及苗腐小麦育种提供基础。

小麦幼苗与禾谷镰刀菌互作的机制与花期的抗性机制不一致，而且还存在着抗性转换，即花期表现为赤霉病穗腐抗性的品种在苗期却表现为感病，例如苏麦3号(来源于中国江苏省农业科学院)，而苗期的抗苗腐品种在花期可能表现为感穗腐，例如安农8455(来源于中国安徽农业大学)。这种现象给苗腐及穗腐双抗材料的筛选带来了一定的困难。目前的研究主要单独集中在花期抗性或苗期抗性，例如研究表明花期赤霉病穗腐抗性QTL位点位于染色体的3BS，5AS，3AS(Anderson J.A.et al.2007.Marker-assisted selection for Fusarium head blightresistance in wheat.International Journal of Food Microbiology.119：51-53)，苗期苗腐抗性位点则位于染色体5B，在花期抗病QTL定位中则没有发现过该位点(Tamburic-Ilincic，L.et al.2009.Different quantitative trait loci for Fusarium resistance in wheat seedlings and adult stage in theWuhan/Nyubai wheat population.Euphytica 165：453-458)。因此花期的赤霉病穗腐抗病QTL位点不能用于苗期的抗病育种中去。基于以上的研究发现还不能满足全生育期抗赤霉病穗腐和苗腐小麦育种的要求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺限和不足，制备一种小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性的分子标记，以适用于小麦稳定的花期和苗期通用抗赤霉病分子标记，用于检测及辅助选择小麦抗苗腐和穗腐的双抗品种。

本发明是这样实现的：利用Genbank中已经公开发表的小麦CYP709C1基因序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY641449.1？ordinalpos＝1&itool＝EntrezSystem2.PEntrez.Sequence.Sequence_ResultsPanel.Sequence_RVDocSum)，设计一对特异性引物(该引物对的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：2-3所示，或参阅《具体实施方式》的描述)，经过实时定量PCR分析分别比较不同小麦品种在接种过镰刀菌或脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，简称DON)处理的幼苗和穗子中CYP709C1基因的表达量差异。具体步骤如下：

CYP709C1基因片段作为一种鉴定小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性的分子标记的应用，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，序列全长为171bp。

扩增上述CYP709C1基因的引物对的核苷酸序列如下(以序列表SEQ ID NO：2-3表示)：

正向引物：5’-3’TGGCATCAAAGTGACCGAAGG，

反向引物：5’-3’GGCCCACTGGAGAAAGACAAT。

上述CYP709C1基因片段的内参β-actin基因的引物对的核苷酸序列如下(以序列表SEQ IDNO：4-5所示)。

正向引物：5’-3’GCTGTTCCAGCCATCTCATGT，

反向引物：5’-3’CGATCAGCAATTCCAGGAAAC。

申请人提供了一种小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性的分子标记，其步骤包括：

1)在温室中分别用镰刀菌或脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒素接种扬花期的小麦以及苗龄为3天的小麦幼苗的胚芽鞘，镰刀菌接种72h取材，DON毒素处理的为24h取材；

2)将步骤1)得到的材料在液氮中研磨成粉末，用Trizol法抽提RNA，去除基因组DNA，逆转录为cDNA样品；

2)用序列表SEQ ID NO：2-5所示的引物对对步骤2)所述的cDNA样品进行实时定量PCR分析，扩增获得CYP709C1基因的特异片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；

4)根据实时定量PCR数据分析在接种镰刀菌的穗子和幼苗中CYP709C1基因相对水处理对照的表达量，用来辅助鉴定小麦品种的赤霉病穗腐或苗腐抗性水平。

上述步骤4)的PCR具体步骤是：

1)扩增反应体系：在25μl PCR反应液中，含有12.5μl含Sybr Green I染料的PCR预混缓冲液(购自日本Toyobo公司))，10μl模板cDNA，体积比为1∶10稀释；10pmol/μl的SEQ ID NO：2-3或SEQ ID NO：4-5所示的引物对各0.5μl，补水至25μl；

2)实时定量PCR反应条件：95℃4min；94℃15s，62℃20s，72℃20s，40个循环，读板温度72℃30s.并通过绘制融解曲线来分析PCR反应中的非特异性扩增，反应程序如下：95℃20s，55℃10s，以0.5℃/10s的速率升温到95℃；

3)反应完成后，利用IQ5(购自美国伯乐公司)软件及2^-ΔΔC _T相对定量分析方法(Livak，K.J.，and Schmittgen，T.D.2001.Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR and the 2^-ΔΔC _T Method.Methods 25：402-408)分析基因相对表达量。

很显然，应用上面的技术方案，本发明可以作为一种鉴定小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性的分子标记，并可以应用于小麦抗病材料育种的辅助选择上。

更详细的技术方案如下所述：

1.1孢子液制备

将由华中农业大学麦类作物分子生物技术实验室从湖北武汉分离的亚洲镰刀菌菌株5035(Qu，B等.2008.Geographic distribution and genetic diversity of Fusarium graminearum andF-asiaticum on wheat spikes throughout China.Plant Pathology 57(1)：15-24)接种到CMC液体培养基(配方：羧甲基纤维素7.5g，硝酸铵0.5g，磷酸氢二钾0.5g，七水硫酸镁0.25g，酵母膏0.5g，加蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌15min后使用，pH 7.0)中振荡培养(25℃，150r/min)5天，产生分生孢子后，10000r/min离心10min，弃上清，用无菌水洗去残留的CMC，血球计数板计数将分生孢子的浓度调为5×10⁵个/ml左右，用于接种试验。

1.2胚芽鞘及小穗接种

按武爱波等(Wu，A.B..2005.Comparative pathogenicity of Fusarium graminearum isolatesfrom China revealed by wheat coleoptile and floret inoculations.Mycopathologia 160：75-83.)描述方法用新鲜孢子液即上述CMC液体培养基培养的孢子接种小麦胚芽鞘，同时每一品种都以同样的方法接种，对照不接种上述含有新鲜孢子液的CMC液体培养基，只接种无菌水。具体操作步骤是：将小麦的种子用0.1％升汞消毒5min，无菌水洗三次后再浸泡2h，均匀置于铺有双层滤纸(无菌)的塑料盒中，每盒放置25-35粒种子，在培养温度25℃，相对湿度为90％-100％，每天用12h光照培养，光照强度为7000勒克斯，3天后用灭菌剪刀快速剪去芽尖，将蘸有上述孢子液(5×10⁵个/ml)、20μg/ml脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒素或无菌水的滤纸片分别接于去掉芽尖的胚芽鞘上，孢子液及无菌水接种72h揭掉纸片取整株，DON毒素及无菌水处理24h同样揭掉纸片取整株，立即至于-80℃冰箱保存。

采用单小花定位定量分生孢子悬浮液注射接种，即在小麦扬花初期，用不锈钢剪刀剪去麦芒及麦穗中部小穗的内外颖顶部少许，用微量注射器注入10μl，5×10⁵个/ml的孢子液、15μl 1.5mg/ml的DON毒素或10μl无菌水对照，每株接种1个小穗，套透明塑料袋保湿，孢子液及无菌水接种72h后取接种小穗，DON毒素及无菌水处理24h后取接种小穗，立即至于液氮中保存，取回后置于-80℃冰箱保存。

1.3总RNA提取及逆转录

利用Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司)提取总RNA，10个小穗或幼苗为一组，液氮研磨后每管分约0.1g，加入1ml的Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司)，摇匀室温静置10min；加入200μl的三氯甲烷后立即剧烈摇晃30s，室温静置5min；4℃，12000r/m离心10min；取上清溶液转移置新的离心管中，并加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min，4℃，12000r/m离心10min；弃上清，沉淀用70％乙醇溶液洗一次，4℃，12000r/m离心5min收集沉淀；室温干燥后溶于20μl的以1∶1000体积比稀释的焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。提取的总RNA首先用0.8％的琼脂糖凝胶电泳初步检测其完整性，然后用紫外分光光度法测定RNA的得率(OD260/OD280，Ratio，R)，R值介于1.8-2.2之间时，说明提取的RNA质量良好。利用DNA酶I(购自宝生物工程(大连)有限公司)除去总RNA中的基因组DNA。反应体系如下：购自宝生物工程(大连)有限公司的10倍的DNA酶I缓冲液5μl，DNA酶I 2μl，RNA酶抑制剂(40U/ml)1μl，总RNA 20μl(约40μg)补水至50μl。37℃反应30min后，加入50μl的DEPC水，再加入等量的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25∶24∶1)，充分混匀，12000r/m离心10min，取上层移至新的离心管中，加入等量的氯仿/异戊醇(体积比为24∶1)，充分混匀，12000r/m离心10min，取上层移至新的离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的冷无水乙醇，-20℃放置60min，12000r/m离心10min回收沉淀，每管加入1ml 70％的冷乙醇清洗沉淀，12000r/m离心10min收集沉淀，室温干燥后用20μl的DEPC水溶解并进行凝胶电泳确认是否除去基因组DNA。确定获得高质量的RNA后，利用SuperScript^TM Reverse Transcriptase试剂盒(购自美国Invitrogen公司)进行cDNA第一链的合成，简述如下：Oligo(dT)_15-18(100mg/μl)3μl，dNTPs(10mM)1μl，总RNA 6μl(约5μg)，补无菌超纯水至13μl，65℃水浴5min，立即置于冰上至少1min；快速离心几秒后，再加入SuperScript^TM Reverse Transcriptase试剂盒中的以下反应混合液：5倍第一链合成缓冲液4μl，二硫苏糖醇(0.1M)1μl，逆转录酶(200U/μl)1μl，以及购自宝生物工程(大连)有限公司的RNA酶抑制剂(40U/μl)1μl，轻轻混匀，50℃温浴45min后70℃加热15min使酶失活。

1.4荧光定量-PCR(qRT-PCR)

以β-actin(序列登录号：AB181991)作为内参基因，实时定量PCR反应分析CYP709C1基因相对表达倍数(CYP709C1基因及扩增引物对的核苷酸序列信息见序列表SEQ ID NO：1和序列表SEQ ID NO：2-3所示)。扩增反应体系：在25μl PCR反应液中，含有12.5μl含SybrGreeen I染料的PCR预混缓冲液(购自日本Toyobo公司)，10μl模板cDNA(体积比为1∶10稀释)，10pmol/μl的SEQ ID NO：2-3或SEQ ID NO：4-5所示的引物对各0.5μl，补水至25μl。扩增条件：95℃4min；94℃15s，62℃20s，72℃20s，40个循环，读板温度72℃30s.并通过绘制融解曲线来分析PCR反应中的非特异性扩增，反应程序如下：95℃20s，55℃10s，以0.5℃/10s的速率升温到95℃。

1.5数据分析

利用IQ5(bio-rad，USA)软件和2^-ΔΔC _T相对定量分析方法(Livak，K.J.et al.2001.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^-ΔΔC _TMethod.Methods 25：402-408)通过比较同一处理条件下小麦中的CYP709C1基因与β-actin基因的表达倍数差异来达到比较CYP709C1基因在接种亚洲镰刀菌菌株5035小穗或幼苗相对接水对照小穗或幼苗样品中的相对表达倍数。花期CYP709C1基因在接种镰刀菌的小穗后相对与接水小穗中的相对表达量高于200倍的定义为赤霉病穗腐抗性，而在苗期接种镰刀菌的幼苗相对与接水幼苗中的相对表达量高于30倍的定义为赤霉病苗腐抗性。

本发明的有益的效果

本发明通过设计一对特异引物，即可以用于小麦赤霉病穗腐和苗腐的通用分子标记。附图2A显示，亚洲镰刀菌菌株5035侵染花期抗赤霉病穗腐品种苏麦3号(来源于中国江苏省农业科学院)小穗72h后，CYP709C1基因的表达量是接水对照的464倍，而在同样条件下，该CYP709C1基因在花期感赤霉病穗腐品种安农8455(来源于中国安徽农业大学)小穗中的表达量是接水对照的66倍。在小麦胚芽鞘接种后进行相似的比较，如附图2B所示苗期抗苗腐品种安农8455在接种72h后的相对表达量为接水对照的58倍，然而在相同的接种时间点，苗期感苗腐品种苏麦3号中该基因的相对水对照的表达量为0.7倍。进一步分析发现花期抗赤霉病穗腐品种苏麦3号相对于花期感赤霉病穗腐品种安农8455，CYP709C1基因的相对表达量的倍数变化为7.1倍，而苗期抗苗腐品种安农8455中，CYP709C1基因的相对表达量变化是苗期感苗腐品种苏麦3号的83.9倍(见表1)。图2C显示花期抗赤霉病穗腐品种苏麦3号中CYP709C1基因在DON诱导24h后相对于水对照的诱导表达量达2229倍，CYP709C1基因在花期感赤霉病穗腐品种安农8455中相对与水对照的表达量为995倍。在DON毒素处理小麦幼苗后，CYP709C1基因在苗期抗苗腐品种安农8455相对水处理的转录聚集量为158倍，而在苗期感苗腐品种苏麦3号中，该基因的相对聚集量则为68倍。同样，DON诱导CYP709C1基因的模式与抗性反应显著相关。因此CYP709C1基因的快速和大量诱导与赤霉病穗腐和苗腐抗性紧密相关。

表1本发明中所用到的抗感小麦品种中CYP709C1基因的诱导表达量

表1说明：利用定量PCR分析在受亚洲镰刀菌菌株(5035)或DON处理24h后的小穗和幼苗中的RNA样品相对于对照的转录量。^a表示接种后72h；^b表示处理后24h，^*P＜0.05.，^**P＜0.01。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的小麦CYP709C1基因的特异片段的核苷酸序列，序列全长为171bp。

序列表SEQ ID NO：2-5是扩增小麦CYP709C1基因的特异片段的引物对的核苷酸序列。

图1：是本发明的技术流程图。

图2：定量PCR分析亚洲镰刀菌菌株5035接种或毒素处理的小穗和幼苗中的CYP709C1基因的相对表达倍数。A和B，在接种亚洲镰刀菌菌株5035后CYP709C1基因在小穗和幼苗中的相对表达倍数；C，DON处理小穗和幼苗24h以后CYP709C1基因的相对表达倍数。相对表达倍数是指相对于水处理中表达倍数。

具体实施方式

实施例1花期抗赤霉病穗腐病品种苏麦3号和花期感赤霉病穗腐品种安农8455的抗性鉴定

利用Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司)提取总RNA，10个小穗或幼苗为一组，液氮研磨后每管分约0.1g，加入1ml的Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司)，摇匀室温静置10min；加入200μl的三氯甲烷后立即剧烈摇晃30s，室温静置5min；4℃，12000r/m离心10min；取上清溶液转移置新的离心管中，并加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min，4℃，12000r/m离心10min；弃上清，沉淀用70％乙醇溶液洗一次，4℃，12000r/m离心5min收集沉淀；室温干燥后溶于20μl的以1∶1000体积比稀释的焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。提取的总RNA首先用0.8％的琼脂糖凝胶电泳初步检测其完整性，然后用紫外分光光度法测定RNA的得率(OD260/OD280，Ratio，R)，R值介于1.8-2.2之间时，说明提取的RNA质量良好。利用DNA酶I(购自宝生物工程(大连)有限公司)除去总RNA中的基因组DNA。反应体系如下：10倍的DNA酶I缓冲液5μl，DNA酶I 2μl，RNA酶抑制剂(40U/ml)1μl，总RNA 20μl(约40μg)补水至50μl。37℃反应30min后，加入50μl的DEPC水，再加入等量的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25∶24∶1)，充分混匀，12000r/m离心10min，取上层移至新的离心管中，加入等量的氯仿/异戊醇(体积比为24∶1)，充分混匀，12000r/m离心10min，取上层移至新的离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的冷无水乙醇，-20℃放置60min，12000r/m离心10min回收沉淀，每管加入1ml70％的冷乙醇清洗沉淀，12000r/m离心10min收集沉淀，室温干燥后用20μl的DEPC水溶解并进行凝胶电泳确认是否除去基因组DNA。确定获得高质量的RNA后，利用SuperScript^TMReverse Transcriptase试剂盒(购自美国Invitrogen公司)进行cDNA第一链的合成，简述如下：Oligo(dT)_15-18(100mg/μl)3μl，dNTPs(10mM)1μl，总RNA 6μl(约5μg)，补无菌超纯水至13μl，65℃水浴5min，立即置于冰上至少1min；快速离心几秒后，再加入以下反应混合液：SuperScript^TMReverse Transcriptase试剂盒内的5倍第一链合成缓冲液4μl，二硫苏糖醇(0.1M)1μl，逆转录酶(200U/μl)1μl以及购自宝生物工程(大连)有限公司的RNA酶抑制剂(40U/μl)1μl，轻轻混匀，50℃温浴45min后70℃加热15min使酶失活。以β-actin(序列登录号：AB181991)作为内参照，实时荧光定量PCR检测CYP709C1基因的相对表达量。扩增反应体系：在25μl PCR反应液中，含有12.5μl Sybr Greeen I PCR预混缓冲液(购自日本Toyobo公司)，10μl模板cDNA(原液按1∶10体积比稀释)，10pmol/lul序列表SEQ ID NO：2-3或4-5所示的引物对各0.5μl，补水至25μl，反应条件如下：95℃4min；94℃15s，62℃20s，72℃20s，40个循环，读板温度72℃30s。并通过绘制融解曲线来分析PCR反应中的非特异性扩增，反应程序如下：95℃20s，55℃10s，以0.5℃/10s的速率升温到95℃。利用IQ5(购于美国伯乐公司)软件和2^-ΔΔCt相对定量分析方法分析CYP709C1基因在接种亚洲镰刀菌菌株503572h后以及DON处理24h后相对于水对照的表达量。其发明效果如附图2A显示。亚洲镰刀菌菌株5035侵染花期抗赤霉病穗腐品种苏麦3号小穗72h后，CYP709C1基因表达量是水对照的464倍，而在同样条件下，该基因在花期感赤霉病穗腐品种安农8455小穗中的表达量是接水对照的66倍。花期抗赤霉病穗腐品种苏麦3号相对于花期感赤霉病穗腐品种安农8455，CYP709C1基因的相对表达量的倍数变化为7.1倍。附图2C显示花期抗赤霉病穗腐品种苏麦3号经过DON处理24h后CYP709C1基因相对于水对照的诱导表达量达2229倍，花期感赤霉病穗腐品种安农8455的表达量为995倍。很明显CYP709C1表达量在赤霉病穗腐抗病品种更高。

实施例2苗期抗苗腐品种安农8455和苗期感苗腐品种苏麦3号的抗性鉴定

将苏麦3号及安农8455小麦种子用0.1％升汞消毒5min，无菌水洗三次后浸泡2h，均匀置于铺有双层无菌滤纸的塑料盒中，每盒放置25-35粒种子，培养温度为25℃，相对湿度为90％-100％，每天进行12h光照培养，光照强度为7000勒克斯，培养3天后用灭菌剪刀快速剪去芽尖，将蘸有孢子液、DON毒素或无菌水的滤纸片接于去掉芽尖的胚芽鞘上，孢子液及无菌水接种72h后揭掉纸片取整株，用DON毒素及无菌水处理24h后同样揭掉纸片取整株，立即置于-80℃冰箱保存。RNA的提取，逆转录及实时荧光定量PCR分析同实施例1。如附图2C显示，苗期抗苗腐品种安农8455在接种72h后的相对表达量为水对照的58倍，然而在相同的接种时间点，苗期感苗腐品种苏麦3号中该基因的相对表达量为水对照的0.7倍，苗期抗苗腐品种安农8455中，CYP709C1基因的相对表达量变化是苗期感苗腐品种苏麦3号的83.9倍(表1)，苗期抗苗腐品种安农8455在DON处理24h后相对水处理的转录聚集量为158倍，苗期感苗腐品种苏麦3号的相对聚集量则为68倍。很明显CYP709C1表达量在苗腐抗病品种更高。发明效果如图2B显示。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性的分子标记

<130>

<141>2010-01-12

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>171

<212>DNA

<213>赤霉病菌(Fusarium head blight)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(171)

<223>

<400>1

tggcatcaaa gtgaccgaag gcacgttcct aacgatcccc atcgcgacga tacatcgcga   60

caaggaggtc tggggagaag atgccaacaa attcaagcct atgaggttcg agaatggagt  120

gacaagggcc ggaaagcacc ccaatgcatt attgtctttc tccagtgggc c           171

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>赤霉病菌(Fusarium head blight)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(21)

<223>

<400>2

tggcatcaaa gtgaccgaag g                                             21

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>赤霉病菌(Fusarium head blight)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(21)

<223>

<400>3

ggcccactgg agaaagacaa t                                     21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>赤霉病菌(Fusarium head blight)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(21)

<223>

<400>4

gctgttccag ccatctcatg t                                    21

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>赤霉病菌(Fusarium head blight)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(21)

<223>

<400>5

cgatcagcaa ttccaggaaa c                                   21

Claims (4)

1.小麦CYP709C1基因的特异片段作为小麦赤霉病苗腐及穗腐分子标记的应用，所述CYP709C1基因的特异片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，序列全长为171bp。

2.用于扩增权利要求1所述基因的特异片段的引物对，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：2和3所示。

3.一种鉴定小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性水平的分子标记的方法，其步骤包括：

1)在温室中分别用亚洲镰刀菌或脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素接种扬花期的小麦以及苗龄为3天的小麦幼苗的胚芽鞘，亚洲镰刀菌接种的72h取材，脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素接种的24h取材；

2)将步骤1)得到的材料在液氮中研磨成粉末，用Trizol法抽提RNA，去除基因组DNA，逆转录得到cDNA样品；

2)用序列表SEQ ID NO：2-5所示的引物对对步骤2)所述的cDNA样品进行实时定量PCR分析，扩增获得CYP709C1基因的特异片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；

4)根据实时定量PCR数据分析在接种镰刀菌的穗子和幼苗中CYP709C1基因相对于水处理对照的表达量，用来辅助鉴定小麦品种的赤霉病或苗腐病的抗性水平；

上述步骤4)的PCR步骤是：

1)扩增反应体系：在25μl PCR反应液中，含有12.5μl的Sybr Greeen I染料PCR预混缓冲液，10μl模板cDNA，按体积比为1∶10稀释；10pmol/μl的SEQ ID NO：2-3或SEQ ID NO：4-5所示的引物对各0.5μl，补水至25μl；

2)实时定量PCR反应条件：95℃4min；94℃15s，62℃20s，72℃20s，40个循环，读板温度72℃30s.绘制融解曲线分析PCR反应中的非特异性扩增，反应程序如下：95℃20s，55℃10s，以0.5℃/10s的速率升温至95℃；

3)反应完成后，利用IQ5软件及

相对定量分析方法分析CYP709C1基因的相对表达量。

4.检测小麦品种赤霉病苗腐及穗腐抗性水平的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述。

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