CN108244059A

CN108244059A - 一种利用离体叶片饲养繁殖棉蚜的方法及棉蚜的鉴定方法

Info

Publication number: CN108244059A
Application number: CN201810204784.8A
Authority: CN
Inventors: 张帅; 崔金杰; 雒珺瑜; 王丽
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-03-13
Filing date: 2018-03-13
Publication date: 2018-07-06

Abstract

本发明公开了一种利用离体叶片饲养繁殖棉蚜的方法及棉蚜的鉴定方法。本发明首先通过PCR方法鉴定棉蚜的类型和是否被病毒感染；然后田间采集棉花倒3叶或黄瓜倒3‑5叶，保留1‑3厘米的叶柄后平铺在MS培养基+琼脂糖+萘乙酸+马来酰肼组合的培养皿中，对挑选的未被病毒感染且已明确棉蚜类型的棉蚜进行饲养繁殖。本发明的方法能够长期稳定饲养棉蚜，可为棉蚜研究提供生长一致、健康的棉蚜个体。

Description

一种利用离体叶片饲养繁殖棉蚜的方法及棉蚜的鉴定方法

技术领域

本申请涉及植物保护技术领域，具体涉及一种棉蚜的饲养繁殖方法，本发明还涉及棉蚜的类型以及是否被病毒感染的鉴定方法。

背景技术

棉蚜Aphis gossypii Glover是广泛分布于世界各国的一种常见害虫，其植物寄主广泛。据记载，全世界棉蚜的寄主植物76科285种，主要通过取食植物汁液和传播病毒给农业生产造成严重损失。木槿、石榴和花椒是已报道的棉蚜在黄河流域地区的主要越冬寄主；棉花和葫芦科瓜类为棉蚜的主要侨居寄主。棉蚜的繁殖能力很强，平均气温稳定在12℃以上就开始繁殖，在夏季一个世代只需4-5天，每龄期只需1天。一头雌蚜一生可产若蚜60-70头，多者100头。

对于棉蚜的控制，长期以来一直以化学防治为主。农药的高频率大剂量使用，加上棉蚜自身生物学特点，使得棉蚜对农药的抗性问题越来越严重。目前，棉蚜对有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、新烟碱类等多种杀虫药剂已经产生了抗性。解析棉蚜对对各种农药的抗性机制和筛选新型农药是棉蚜防治工作的重点，而开展这些研究工作需有大量棉蚜作为试验材料，支撑试验的进行。现阶段还没有成熟的棉蚜人工饲料来进行棉蚜饲养，主要还是依靠利用植株或离体叶片来进行饲养。使用植株饲养的棉蚜个体发育差异较大，个体较小，无法满足试验需要。使用离体叶片饲养时要经常更换叶片，工作量十分巨大。

棉蚜在长期的进化和取食过程中，种群间出现明显的遗传多样性，最明显的例子就是不同国家或地区的棉蚜已分化形成了明显的寄主专化型。在我国，棉蚜表现出了瓜类和棉花寄主上的显著分化，二者可以分别取食黄瓜和棉花，交换寄主后不能存活，而二者外形几乎没有差异。在棉蚜饲养时田间采集的初始种有必要鉴定出是棉花型还是黄瓜型。

在棉蚜饲养时田间采集的初始种的采集质量也关系到饲养繁殖能否顺利进行。田间蚜虫种类较多，形态相近，对种的鉴定需要专业的技术人员才能完成，且需要使用有翅棉蚜进行鉴定，而棉蚜主要以无翅状态存在。另外，棉蚜在田间的病毒感染率较高，如使用被感染的棉蚜带到室内饲养，会造成病毒的污染，影响棉蚜的质量。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供了一种利用离体叶片饲养繁殖棉蚜的方法及棉蚜的鉴定方法。该方法首先通过PCR方法鉴定棉蚜的类型和是否被病毒感染；然然后田间采集棉花倒3叶或黄瓜倒3-5叶，保留1-3厘米的叶柄后平铺在MS培养基+琼脂糖+萘乙酸+马来酰肼组合的培养皿中，对挑选的未被病毒感染且已明确棉蚜类型的棉蚜进行饲养繁殖。该方法能够长期稳定饲养棉蚜，可为棉蚜研究提供生长一致、健康的棉蚜个体。

本发明一种田间采集棉蚜的鉴定方法，其特征是，

(1)棉蚜类型的鉴定方法，具体为：利用棉花型棉蚜鉴定正反向引物SEQ ID NO.1-2和黄瓜型棉蚜鉴定正反向引物SEQ ID NO.3-4，对待测棉蚜样品的基因组DNA进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行电泳分析：如在252bp有条带，确定采集到的是棉花型棉蚜，如在212bp有条带，确定采集到的是黄瓜型棉蚜；

(2)棉蚜是否被病毒感染的鉴定方法，具体为：利用正向引物SEQ ID NO.5和反向引物SEQ ID NO.6对待测棉蚜样品的基因组DNA进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行电泳分析：如在257bp有条带，说明该棉蚜样品被病毒感染。

优选的，待测棉蚜样品的基因组DNA的获取方法为：田间采集棉蚜成蚜，单头饲养至产仔后，剔除成蚜保留仔蚜，提取总RNA，反转录成cDNA。

优选的，所述的PCR扩增体系(25μL)为：10×Buffer(含Mg²⁺)2.5μL，10mmol/LdNTPs2.0μL，10μmol/L正向引物1.0μL，10μmol/L反向引物1.0μL，5U/μL Taq Enzyme 0.2μL，25ng/μL cDNA 2μL，使用PCR纯等级水补足至25μL体系。

优选的，所述的PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；14℃保存。

进一步的，通过步骤(1)明确棉蚜的类型(棉花型或黄瓜型)，通过步骤(2)明确棉蚜是否被病毒感染，挑选未被病毒感染且已明确棉蚜类型的棉蚜备用。

本发明一种利用离体叶片饲养繁殖棉蚜的方法，其特征是，包括以下步骤：

S1：利用MS培养基配制浓度为1-2％的琼脂糖溶液，加热融化，加入终浓度50-200毫克/升的萘乙酸和终浓度0.25-0.5％的马来酰肼，备用；

S2：田间采集棉花倒3叶或黄瓜倒3-5叶，保留1-3厘米的叶柄，冲洗干净，备用；

S3：在培养皿底倒入S1步骤的溶液；待琼脂糖凝固后，平铺上S2步骤的叶片，叶背向上，叶柄紧贴琼脂糖表面；

S4：将上述筛选到的未被病毒感染且已明确棉蚜类型的棉蚜接到S3步骤的叶片上，棉花型棉蚜用棉花叶片饲养，黄瓜型棉蚜用黄瓜叶片饲养。

进一步的，棉蚜接到叶片上后，培养皿先用拉伸封口膜覆盖，然后再盖一层银色薄膜，在光照培养箱中进行棉蚜的饲养和繁殖。

优选的，所述步骤S1：琼脂糖溶液加热融化后，凉至60±5℃后加入萘乙酸和马来酰肼，备用。

本发明的有益效果是：

1、本发明首先分别设计棉蚜类型鉴定引物和病毒感染鉴定引物，通过PCR方法鉴定棉蚜的类型和是否被病毒感染，从而为棉蚜研究提供健康且类型确定的棉蚜个体；

2、本发明还使叶片长期保持可用于饲养棉蚜的状态。本发明通过实验证明：使用棉花的倒3叶和黄瓜的倒3-5叶保鲜效果最好；使用MS培养基提供营养，使用琼脂糖有助于叶片上根的发育，且长时间保湿，使用萘乙酸和马来酰肼组合促进叶片生根、抑制叶芽分化。最终使棉叶保鲜时间≥7天，黄瓜叶保鲜时间≥8天，从而大大减少了饲养棉蚜时的叶片更换频率，降低了工作量。

3、本发明还使用封口膜加银色薄膜覆盖培养皿，即可有效防止蚜虫的逃逸，也可防止水汽的凝结。

综上，本发明通过对棉蚜的鉴定以及叶片的保鲜，从而可以大量的饲养繁殖健康且类型确定的棉蚜个体，有助于棉蚜的研究。

附图说明

图1棉花所采集棉蚜类型鉴定的PCR扩增产物电泳图；

图2黄瓜上采集黄瓜型棉蚜PCR扩增产物电泳图；

图3棉花上采集棉蚜是否感染病毒的PCR扩增产物电泳图；

图4黄瓜上采集棉蚜是否感染病毒的PCR扩增产物电泳图；

图5为实施例3激素诱导黄瓜叶片生根情况。

具体实施方式

下面将以实施例的方式对本申请作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本申请。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本申请的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本申请来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本申请的范围仅由所附权利要求界定。

下述实施例中所使用的各原料，除特别指出的以外，均可由市售获得。

实施例1：棉蚜总RNA的提取和cDNA的制备

2017年8月，在自中国农业科学院棉花研究所试验农场(36.13°N,114.85°E)棉田、黄瓜田采集蚜虫。在棉花和黄瓜田分别采集30头蚜虫，带回实验室，单头饲养至产仔数多于6头，剔除成蚜保留仔蚜，每个家系挑选5头仔蚜混在在1个离心管中，使用trizol试剂盒(Invitrogen)提取总RNA，使用反转录试剂盒(Promega)合成cDNA。分别成功提取18个、22个在棉花、黄瓜采集的蚜虫总RNA。

实施例2：棉蚜种类和病毒感染鉴定

首先利用本发明设计的棉蚜鉴定引物(SEQ ID NO.1-4)分别对18个采自于棉花的棉蚜和22个采自于黄瓜的棉蚜cDNA样品进行PCR扩增；然后用病毒检测引物(SEQ ID NO.5-6)进行PCR扩增。

棉花型棉蚜鉴定正向引物：5'-GAGGAGGATTTTCTATCAATAATGC-3'(SEQ ID NO.1)；

棉花型棉蚜鉴定反向引物：5'-TAACATTAATGCAATTACTCCTCC-3'(SEQ ID NO.2)；

黄瓜型棉蚜鉴定正向引物：5'-ACCCCTAATCATATTCAACCAG-3'(SEQ ID NO.3)；

黄瓜型棉蚜鉴定反向引物：5'-ATTTAGTGTAGGTAAAACTAA-3'(SEQ ID NO.4)；

病毒感染鉴定正向引物：5'-CCAGAGATAGAGAAGGAA-3'(SEQ ID NO.5)；

病毒感染鉴定正向引物：5'-ATAGCATTATAGCGTTCAA-3'(SEQ ID NO.6)。

PCR反应扩增体系为(25μL)：10×Buffer(含Mg²⁺)2.5μL，10mmol/L dNTPs 2.0μL，10μmol/L正向引物1.0μL，10μmol/L反向引物1.0μL，5U/μL Taq Enzyme(Taq酶)0.2μL，25ng/μL DNA 2μL，使用PCR纯等级水补足至25μL体系。

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；14℃保存。

判断标准：PCR扩增产物进行琼脂糖电泳分析，如在252bp有条带，确定采集到的是棉花型棉蚜，如在212bp有条带，确定采集到的是黄瓜型棉蚜；如在257bp有条带扩增出，说明该品系被病毒感染。

PCR扩增产物琼脂糖电泳结果如图1-4所示，结果显示：棉花上采集到的蚜虫有15种棉花型棉蚜(图1)，黄瓜上有18种黄瓜型棉蚜(图2)，两种寄主上棉蚜的病毒感染个数分别为13头(图3)和14头(图4)，挑选确定未被病毒感染的蚜虫品系备用。

实施例3激素诱导生根

利用MS培养基配置浓度为1.5％的琼脂糖溶液，加热融化，室温放置至60℃时加入终浓度为100毫克/升的萘乙酸和终浓度为0.4wt％马来酰肼。在超净工作台，在90mm培养皿底中倒入30ml的上述琼脂糖溶液。间采集黄瓜倒4叶，保留2厘米的叶柄，用无菌蒸馏水冲洗5遍，待琼脂糖凝固后，平铺上叶片，叶背向上，叶柄紧贴琼脂糖表面。使用封口膜覆盖培养皿后放置到光照培养箱，温度25±1℃，16h:8h(L:D)，2d后叶片长出须根，且无叶芽分化(图5)。

实施例4MS培养基和琼脂糖对叶片新鲜度影响

称取配制MS培养基(Solarbio)的固体料(约41.74克)，加热溶解于1000ml蒸馏水中，116℃高压灭菌30分钟，冷却后测得溶液pH值为5.7，即得MS培养基溶液。使用三角瓶盛取1000ml蒸馏水，使用盐酸调节pH值为5.7，0.22μM滤膜过滤除菌。分别应用两种溶液配制1.5％的琼脂糖和1.5％的琼脂溶液，加热融化，室温放置至60℃时，分别加入终浓度100毫克/升的萘乙酸和终浓度0.4wt％的马来酰肼。在超净工作台，在90mm培养皿底中倒入30ml的上述琼脂糖溶液。分别棉花倒3叶和黄瓜倒4叶，保留2厘米的叶柄，用无菌蒸馏水冲洗5遍，待琼脂糖凝固后，平铺上叶片，叶背向上，叶柄紧贴琼脂糖表面，每处理12片叶片。使用封口膜覆盖培养皿后放置到光照培养箱，温度25±1℃，16h:8h(L:D)，每天查看叶片的新鲜度。

结果如表1所示：使用MS培养基和琼脂糖能显著提高叶片的保鲜时间，保鲜时间比使用蒸馏水+琼脂提高4天以上，保鲜效果明显。

表1.MS培养基和琼脂糖对叶片新鲜度影响

实施例5不同位置叶片对叶片新鲜度影响

称取MS培养基(Solarbio)配制MS培养基(Solarbio)的固体料(约41.74克)，加热溶解于1000ml蒸馏水中，116℃高压灭菌30分钟，冷却后测得溶液pH值为5.7，即得MS培养基溶液。应用MS培养基配制1.5％的琼脂糖溶液，加热融化，室温放置至60℃时，分别加入终浓度为100毫克/升的萘乙酸和终浓度0.4wt％马来酰肼。在超净工作台，在90mm培养皿底中倒入30ml的上述琼脂糖溶液。分别棉花倒2、3、4、5叶和黄瓜倒2、3、4、5叶，保留2厘米的叶柄，用无菌蒸馏水冲洗5遍，待琼脂糖凝固后，平铺上叶片，叶背向上，叶柄紧贴琼脂糖表面，每处理12片叶片。使用封口膜覆盖培养皿后放置到光照培养箱，温度25±1℃，16h:8h(L:D)，每天查看叶片的新鲜度。

结果如表2所示：结果表明使用棉花的倒3叶和黄瓜的倒4叶保鲜效果最好，保鲜时间比倒2叶提高2-4天，保鲜效果明显。

表2.MS培养基和琼脂糖对叶片新鲜度影响

实施例6覆膜对水汽凝结和棉蚜趋避作用

称取配制MS培养基(Solarbio)的固体料(约41.74克)，加热溶解于1000ml蒸馏水中，116℃高压灭菌30分钟，冷却后测得溶液pH值为5.7。使用三角瓶盛取1000ml蒸馏水，使用盐酸调节pH值为5.7，0.22μM滤膜过滤除菌，即得MS培养基溶液。应用MS培养基配制1.5％的琼脂糖溶液，加热融化，室温放置至60℃时，分别加入终浓度100毫克/升的萘乙酸和终浓度0.4wt％的马来酰肼。在超净工作台，在90mm培养皿底中倒入30ml的上述琼脂糖溶液。采集棉花倒3叶，保留2厘米的叶柄，用无菌蒸馏水冲洗5遍，待琼脂糖凝固后，平铺上叶片，叶背向上，叶柄紧贴琼脂糖表面。将筛选到的蚜虫用毛笔接到叶片上。分别设置仅用封口膜覆盖、封口膜加银色薄膜覆盖和仅用银色薄膜覆盖处理，每处理12片叶片。培养皿后放置到光照培养箱，温度25±1℃，16h:8h(L:D)，3天后查看培养皿覆盖物上蚜虫数量和水汽凝结情况。

结果表明仅用封口膜覆盖，可以防止水汽凝结，但蚜虫有逃逸现象；仅用银色薄膜覆盖，可以阻止蚜虫逃逸，但薄膜上有水汽凝结，影响蚜虫存活；使用封口膜加银色薄膜覆盖，即可有效防止蚜虫的逃逸，也可防止水汽的凝结。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 一种利用离体叶片饲养繁殖棉蚜的方法及棉蚜的鉴定方法

<130> 0

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaggaggatt ttctatcaat aatgc 25

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taacattaat gcaattactc ctcc 24

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acccctaatc atattcaacc ag 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atttagtgta ggtaaaacta a 21

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccagagatag agaaggaa 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atagcattat agcgttcaa 19

Claims

1.一种田间采集棉蚜的鉴定方法，其特征是，

2.如权利要求1所述的一种田间采集棉蚜的鉴定方法，其特征是，所述待测棉蚜样品的基因组DNA的获取方法为：田间采集棉蚜成蚜，单头饲养至产仔后，剔除成蚜保留仔蚜，提取总RNA，反转录成cDNA。

3.如权利要求1所述的一种田间采集棉蚜的鉴定方法，其特征是，所述的PCR扩增体系为：Mg²⁺的10×Buffer 2.5μL，10mmol/L dNTPs 2.0μL，10μmol/L正向引物1.0μL，10μmol/L反向引物1.0μL，5U/μL Taq Enzyme 0.2μL，25ng/μL cDNA 2μL，PCR水补足至25μL体系。

4.如权利要求3所述的一种田间采集棉蚜的鉴定方法，其特征是，所述的PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；14℃保存。

5.如权利要求1-4中任意一项所述的一种田间采集棉蚜的鉴定方法，其特征是，通过步骤(1)明确棉蚜的类型为棉花型或黄瓜型，通过步骤(2)明确棉蚜是否被病毒感染，挑选未被病毒感染且已明确棉蚜类型的棉蚜备用。

6.一种利用离体叶片饲养繁殖棉蚜的方法，其特征是，包括以下步骤：

S4：将权利要求5筛选到的未被病毒感染且已明确棉蚜类型的棉蚜接到S3步骤的叶片上，棉花型棉蚜用棉花叶片饲养，黄瓜型棉蚜用黄瓜叶片饲养。

7.如权利要求6所述的一种利用离体叶片饲养繁殖棉蚜的方法，其特征是，棉蚜接到叶片上后，培养皿先用拉伸封口膜覆盖，然后再盖一层银色薄膜，在光照培养箱中进行棉蚜的饲养和繁殖。

8.如权利要求6所述的一种利用离体叶片饲养繁殖棉蚜的方法，其特征是，所述步骤S1，琼脂糖溶液加热融化后，凉至60±5℃后再加入所述的萘乙酸和马来酰肼。