CN103060338A - 大白菜TuMV抗性基因retr02与等位基因Retr02、及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供大白菜TuMV抗性基因retr02，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。本发明提供大白菜TuMV抗性基因retr02的等位基因Retr02，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供大白菜TuMV抗性基因retr02编码的蛋白及其等位基因Retr02编码的蛋白。本发明同时提供了编码TuMV抗性基因retr02和等位基因Retr02在分子标记辅助培育抗TuMV植物中的应用。

Description

大白菜TuMV抗性基因retr02与等位基因Retr02、及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及大白菜TuMV抗性基因retr02与等位基因Retr02、及其编码蛋白与应用。 

背景技术

大白菜起源于中国，是我国最重要的蔬菜作物之一。大白菜病毒病是大白菜三大病害之一，对大白菜生产具有极大威胁。该病各地普遍发生，在一些产区可造成严重减产甚至绝产。芜菁花叶病毒(TuMV)是侵染大白菜的主要病毒，北京地区以TuMV-C4株系为主。 

TuMV是一种分布广且寄主范围很广的植物病毒，主要分布在温带和热带地区。自1921年美国病毒学家Schultz首次在小白菜和芜菁中发现TuMV以来，至今已有43科318种双子叶植物（包括十字花科、菊科、藜科、豆科、石竹科等）及部分单子叶植物受到其侵染。TuMV对芸薹属植物的危害尤为严重，其危害性仅次于黄瓜花叶病毒(CMV)，是侵染蔬菜作物的第二大病毒。 

大白菜TuMV抗性遗传复杂，不同抗性材料表现出不同水平的抗性，利用抗病品种是非常有效的防治手段。1984年钮心恪选用不同大白菜抗性材料对F₁、F₂和BC₁群体进行抗性分析，表明大白菜对TuMV的抗性受2对相互独立的显性基因控制，植株只要具有其中1对基因就表现抗性。1983年Leung等报道大白菜对TuMV-C1株系的抗性遗传受显性基因控制。1993年Yoon等选用对TuMV C1～C5株系均产生抗性的大白菜自交系O-2为抗病材料，研究发现TuMV的抗性遗传受2个隐性基因控制。而Suh等用两份TuMV抗性材料BP058和O-2与两份感病材料ssd31和B18来研究不同株系间的相互作用，指出单株系的抗性受 1个或2个显性基因控制，当用混合株系接种时，其抗性受2个以上主效基因和几个微效基因控制。1995年曹光亮等采用双列杂交设计结合配合力分析，发现白菜对TuMV的抗性为不完全显性。Il2Yong Kim采用TuMV的K1、K2株系对大白菜抗病亲本（O-2）、感病亲本（SE，SS）及其F₁、F₂、BC群体进行抗病性鉴定，结果在组合SS×O-2中，抗性由2个显性基因控制；在组合SE×O-2中，抗性由显性单基因控制，这表明同一抗病材料在不同的遗传背景下对相同TuMV株系的抗性受感病亲本的控制。由以上研究可知，大白菜对TuMV抗性遗传比较复杂。 

目前，国内外已筛选了一系列的与TuMV抗性基因连锁的RAPD、AFLP、SSR、SCAR标记。Hughes等利用CDN1株系接种油菜（Brassica napus）后，用BSA法筛选具有多态性的AFLP或SSR标记，得到了1个与抗TuMV基因连锁的AFLP标记和6个SSR标记。闫瑾琦筛选到2个与大白菜抗TuMV基因紧密连锁的RAPD标记(OPV181400和OPV18820)，其遗传距离分别为9.15cM和15.36cM。韩和平用大白菜抗病自交系Brp0058和感病自交系Brp0181杂交后代的F₂分离群体为试验材料，采用BSA法筛选到2个与TuMV感病基因紧密连锁的AFLP分子标记，利用Mapmaker作图软件统计分析，其遗传距离分别为7.15cM和8.14cM，并将其转化为SCAR标记。王雪以甘蓝感病自交系01-16-5-7和抗病自交系20-2-5杂交后代的F₂分离群体为试材，采用BSA法筛选到2个与TuMV感病基因紧密连锁的AFLP分子标记。高金萍以高抗TuMV的结球甘蓝自交不亲和系A21为父本，易感TuMV的结球甘蓝自交不亲和系1047为母本杂交后代的F₂群体为试材，筛选到与抗病基因连锁的2个RAPD标记，并将其转化为SCAR标记。王美以高抗TuMV的大白菜普通白心株系91-12和高感TuMV的桔红心株系T12-19杂交所得的100个小孢子培养DH株系为作图群体。利用AFLP标记、RAPD标记和SSR标记构建大白菜分子遗传图谱，并在此基础 上利用JoinMap3.0对大白菜芜菁花叶病毒抗性基因进行了QTLs定位。总之，当前国内外已经筛选了一系列的与TuMV抗性基因连锁的RAPD、AFLP、SSR和SCAR标记。但是，随着大白菜基因组测序项目的完成，开发出了大量的Indel标记，这些已有的连锁标记与Indel标记相比，不够稳定，比较复杂。 

迄今已发现的芸薹属抗TuMV基因主要集中在A基因组，少部分在C基因组（表1），而且位于C基因组的TuRB02基因具有数量性状的抗性特点。TuRB01是在油菜品种‘Westar’中发现的显性基因，位于A基因组N6染色体上，该基因对生理小种1的分离具有抗性，几乎达到免疫级别，ELISA检测时也没有发现病毒。基因TuRB01b与TuRB01一样，位于Brassica napus的A基因组R6染色体上，但由于抗不同的生理小种，所以命名为TuRB01b。TuRB02为数量性状位点抗病基因，控制着感病的程度。TuRB03为单显性基因，对分离物CDN1的抗性为高抗。单显性基因TuRB04和TuRB05在swede品系165中被鉴定出来，TuRB04控制对一些TuMV株系的抗性，而TuRB05控制对这些株系的坏死应答，限制病毒在植物整个组织中的传播。TuRB04对于TuRB05来说是上位基因，两个基因共同控制致病型1，3株系。Walsh等在大白菜品系BP058中定位了广谱性抗病基因，即retr01（隐性基因）与ConTR01（显性基因）协同控制着作物对TuMV的抗性，主要是控制病斑的扩散，其中retr01定位于R4，ConTR01定位于R8。曹必好等以甘蓝抗TuMV自交不亲和系84075和感TuMV自交不亲和系9797及其杂交的F₂代分离群体为材料进行抗性鉴定，结果表明，84075的抗病基因对TuMV的抗性符合孟德尔遗传规律，抗性基因为单显性基因，并且克隆了抗TuMV相关基因（TuR2），但未对其功能作进一步分析。 

表1芸薹属中TuMV抗性基因及其特征 

抗性基因	位于的芸薹属基因组	有效抗致病型/分离物	参考资料
				TuRB01	B.napus(A)	1	Walsh et al.(1999)
TuRB01b	B.rapa(A)	1	Rusholme(2000)

[0009] 

TuRB02	B.napus(C)	CHN1,JPN1	Walsh et al.(1999)
				TuRB03	B.napus(A)	CDN1	Hughes(2001)
TuRB04	B.napus(A)	1,3	Jenner et al.(2002)
				TuRB05	B.napus(A)	1,3	Jenner et al.(2002)
retr01	B.rapa(A)	1,3,4,7,8,9,12	Walsh et al.(2007)
				ConTR01	B.rapa(A)	1,3,4,7,8,9,12	Walsh et al.(2007)

发明内容

为进一步研究大白菜抗TuMV的分子机理，本发明的目的是提供大白菜TuMV抗性基因及其编码蛋白与应用。 

本发明申请人以大白菜抗TuMV高代自交系80122及感TuMV高代自交系80425为试验材料，构建F₂分离群体继续探讨TuMV抗性的遗传规律。申请人利用BSA法（分离群体分组分析法）筛选出与TuMV抗性基因连锁的分子标记，获得了对大白菜TuMV抗性基因的定位。通过图位克隆（map-based cloning）技术获得了大白菜TuMV抗性基因retr02与该基因的等位基因Retr02，并对其进行了分离克隆及比较分析。通过原核表达及酵母双杂实验对该基因的功能、抗性机理进行了验证，发现该基因控制大白菜TuMV抗病高代自交系80122和TuMV感病高代自交系80425杂交产生的TuMV抗性。该基因的分离克隆使人们对于大白菜隐性抗性基因的利用成为可能，进一步促进大白菜TuMV抗性育种。 

本发明提供大白菜TuMV抗性基因retr02。retr02基因具有SEQID No.1所示的核苷酸序列，由1321个碱基组成，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。retr02基因来源于大白菜抗TuMV高代自交系80122，位于大白菜基因组的Bra035393。 

本发明提供大白菜TuMV抗性基因retr02的等位基因Retr02。Retr02基因具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，由1319个碱基组成，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。Retr02基因来源于大白菜感TuMV高代自交系80425，位于大白菜基因组的Bra035393。 

本发明还提供大白菜TuMV抗性基因retr02编码的蛋白质，其为：1）由SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或2）在SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1）衍生的蛋白质。其中，序列表中SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的氨基酸序列分别由77个和75个氨基酸残基组成。 

本发明还提供大白菜TuMV抗性基因retr02的等位基因Retr02编码的蛋白质，其为：1）由SEQ ID No.8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或2）在SEQ ID No.8所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1）衍生的蛋白质。其中，序列表中SEQ ID No.8所示的氨基酸序列分别由119个氨基酸残基组成。 

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如，将非活性区段的第27位天冬氨酸（Asp，D）替换为组氨酸（His，H），得到蛋白的突变体序列，且不影响其活性。 

因此，本发明的大白菜TuMV抗性基因retr02或其等位基因Retr02编码的蛋白质还包括SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ IDNo.8所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有同等活性的大白菜TuMV抗性基因retr02或其等位基因Retr02编码的蛋白质衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。 

本发明还提供含大白菜TuMV抗性基因retr02或其等位基因Retr02核苷酸序列或其片段的克隆载体或各类表达载体、含有所述载 体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其特异片段的转化植物细胞和转基因植物。 

本发明还提供大白菜TuMV抗性基因retr02在培育抗TuMV植物中的应用。具体为在植物中干涉Retr02基因表达获得抗TuMV植物。 

本发明还提供大白菜TuMV抗性基因retr02和其等位基因Retr02在分子标记辅助培育抗TuMV植物中的应用。具体为利用大白菜TuMV抗性基因retr02和其等位基因Retr02特异的分子标记，进行分子标记辅助选择育种。 

其中，所述分子标记可为表2中任一对与retr02紧密相连的Indel标记，或根据retr02和Retr02在exon3处第602处碱基的差异（SNP，A/G）开发了CAPS标记（A602G）。 

表2与retr02紧密连锁的多态性I ndel分子标记 

本发明提供的大白菜TuMV抗性基因retr02的有益效果在于： 

（1）可用于培育大白菜TuMV抗性材料。可用本发明中携带TuMV抗性基因retr02的材料为供体亲本与其它大白菜品种或品系杂交和回交，利用本发明产生的特异性分子标记进行筛选，培育出含retr02基因的新材料。也可根据当前发现的retr02的抗性机制，使用RNA干扰技术或反义RNA技术或其它有效技术，获得TuMV抗性材料。 

（2）利用本发明产生的分子标记可鉴定大白菜资源或杂交后代植株的基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种选择效率。 

附图说明

图1为实施例1中大白菜80122、80425及其杂交一代植株接种TuMV-C4后的照片。 

图2为实施例1中大白菜80122、80425及其杂交一代植株ELISA鉴定结果柱状统计图。 

图3为实施例1中大白菜TuMV抗性基因retr02的染色体连锁定位区域遗传连锁图。 

图4为实施例1中80122的retr02基因和80425的Retr02基因的PCR扩增gDNA电泳照片。 

图5为实施例1中80122的retr02基因和80425的Retr02基因的PCR扩增cDNA电泳照片。 

图6为实施例2中80122的retr02基因和80425的Retr02基因gDNA核苷酸序列比较分析图。 

图7为实施例2中80122的retr02基因和80425的Retr02基因cDNA核苷酸序列比较分析图。 

图8为实施例2中80122的retr02基因和80425的Retr02基因编码蛋白氨基酸序列比较分析图。 

图9为实施例3中用Bio11077F/Bio11078R对多份大白菜材料扩增 retr02位点（Bra035393基因）CDS片段的电泳照片。 

图10为实施例3中含80122的retr02基因和含80425的Retr02基因的pET-32a载体蛋白表达电泳照片。 

图11为实施例3中80122的retr02基因和80425的Retr02基因的CDS片段克隆到酵母双杂系统中与TuMV-VPg互作的照片。 

图12为实施例4中A602G检测大白菜80122、80425及其杂交二代基因型的电泳照片。 

图中，M为MarkerD2000电泳条带。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。 

实施例中所涉植物材料如下： 

80122：原名BP8407，国家级抗源材料，参见刘志荣，王子欣.大白菜抗源‘8407’的选育.中国蔬菜.1989(4)； 

80425：由市购“极早春”自交5代纯化获得，参见钱伟，张淑江，章时蕃，李菲，张慧，孙日飞.大白菜TuMV抗性的主基因+多基因混合遗传分析.中国蔬菜.2012（12）：16-21； 

80124：陕西地方品种89B自交17代纯化材料，参见Qian,W.,Zhang,S.J.,Zhang,S.F.,Li,F.,Zhang,H.,Wu,J.,Wang,X.W.,Walsh,J.A.,Sun,R.F.2012.Mapping and candidate-gene screening of the novel Turnip mosaic virus resistance gene retr02 in Chinese cabbage(Brassica rapa L.).Theor.Appl.Genet.DOI 10.1007/s00122-012-1972-x； 

80186：地方品种二青自交12代纯化材料，参见钱伟，张淑江，章时蕃，李菲，张慧，孙日飞.大白菜TuMV抗性的主基因+多基因混合遗传分析.中国蔬菜.2012（12）：16-21； 

2079：国家级抗源材料，参见王世祥，王翠花.1990.大白菜霜霉病与病毒病复合接种鉴定方法的研究.山东农科学，1990（4），41-42； 

BP058：国家级抗源材料，参见韩和平，孙日飞，张淑江，李菲，章时蕃，钮心恪．2004．大白菜中与芜菁花叶病毒（TuMV）感病基因连锁的AFLP标记．中国农业科学，37（4）：539-544． 

Chiifu：大白菜基因组测序材料，参见Wang et al.2011.Thegenome of the mesopolyploid crop species Brassica rapa.Nature Genetics43:1035-1039 

80403：市购“春大将”自交8代纯化材料，参见钱伟，张淑江，章时蕃，李菲，张慧，孙日飞.大白菜TuMV抗性的主基因+多基因混合遗传分析.中国蔬菜.2012（12）：16-21； 

80461：市购“强势”自交11代纯化材料，参见刘广金.春种大白菜—强势.农业科技与信息.1998，3； 

R-O-18：欧洲油用白菜，参见Rachel L.Rusholme,Erin E.Higgins,John A.Walsh.2007.Genetic control of broad-spectrum resistance to turnip mosaic virus in Brassica rapa(Chinese cabbage).Journal of General Virology,88:31773186； 

Tendergreen：由英国华威大学的John Walsh赠与，参见Hughes SL,Hunter PJ,Sharpe AG, Kearsey MJ,Lydiate DJ,Walsh JA(2003)Genetic mapping of the novel Turnip mosaic virus resistance gene TuRB03in Brassica napus.Theor Appl Genet107:1169-1173。 

实施例1本发明TuMV抗性基因连锁分子标记的筛选和定位 

1、大白菜TuMV抗性遗传分析 

以大白菜TuMV抗性高代自交系80122为母本，感TuMV高代自交系80425为父本杂交获得F₁，自交获得F₂群体，每个F₂单株通过自交获得F_2:3家系。本实验的TuMV毒源采用北京北区的主流株系TuMV-C4株系（中国农业科学院蔬菜花卉研究所病理课题提供）。TuMV-C4毒 源扩繁材料选用易感TuMV的芥菜材料Tendergreen。TuMV接种的具体方法参考阎谨琦（2000）、韩和平（2004）、李巧云（2009）。在易感TuMV的芥菜Tendergreen三叶期时接种TuMV-C4株系，进行毒源扩繁，接种20d后收集已发病的叶片以供进一步群体接种使用。在大白菜三叶期（幼苗的第3片真叶充分展开）时进行第一次接种。接种时，取扩繁的Tendergreen上的新鲜病叶1g，放入高温灭菌过的研钵中，加入磷酸盐缓冲液（0.05mol·L^-1，pH7.0）5ml，研磨成浆，用双层纱布滤出病毒汁液，其立即用于人工磨擦接种。人工磨擦接种时，先在待鉴定植株（第2和第3片叶）正面均匀喷撒少许金刚砂，左手托住叶背，右手食指沾病毒汁液在叶面轻轻往返磨擦2～4次，随后立即用清水冲洗叶面，遮荫24h。在第一次人工磨擦接种1～2d后再重复接种一次，并将所有接种的叶片做好标记。白天温度控制在25～28℃，夜间温度20～22℃使其发病，21d后取大白菜植株的心叶进行ELISA检测病毒的含量，进行抗病性鉴定。TuMV-ELISA鉴定参考韩和平（2004）、李巧云（2009），详细步骤及过程参照TuMV-ELISA检测试剂盒（美国Agdia公司）内的说明书。 

对大白菜F₂群体进行人工磨擦接种鉴定，图1为80122、80425及其F₁植株接种TuMV-C4后的照片，ELISA鉴定结果如图2所示，80122抗TuMV，接种前后没有差异，经ELISA鉴定接种后不含TuMV；80425感TuMV，接种前后有差异，经ELISA鉴定接种后含TuMV；F₁感TuMV，接种前后有差异，经ELISA鉴定接种后含TuMV。F₂群体（239株）中有52株抗病植株，187株感病植株，经卡平方测验F₂群体中抗病植株和感病植株的分离比符合1:3（χ²＝1.44＜χ² _0.05＝3.84），表明在该组合中抗性基因是由一对隐性基因控制。 

2、大白菜TuMV抗性基因定位 

采用中国农业科学院蔬菜花卉研究所生物技术实验室的SSR标记及Indel标记进行连锁标记的筛选。在亲本80122和80425间共筛选 SSR引物200对，其中表现多态性的SSR引物64对。经分离群体分组分析法（BSA）研究发现，1个SSR标记BC84在抗感亲本和抗感池间均表现多态，说明该SSR与抗病基因紧密连锁。将BC84引物序列（正向引物5’-CGTCCGCTCAAATCGCATCTGTA-3’，反向引物5’-AGGTTGTGAGGGGTCTGGA-3’）与大白菜全基因组进行比对，得出BC84引物序列位于大白菜A04染色体的scaffold000048上。利用生物技术室A04上的Indel标记在抗感亲本和抗感池间多态性筛选，共筛选到4个Indel标记与该抗病基因连锁，这4个Indel标记分别为BrID90209（scaffold000048），BrID90211（scaffold000048），BrID90143（scaffold000070）和BrID90275（scaffold000016）。利用4对连锁的Indel标记检测F₂群体的239个单株，利用Jionmap4.0分析它们之间的连锁关系，该抗性基因位于大白菜A04染色体，其两侧标记为BrID90211和BrID90275。 

根据大白菜参考基因组序列，在scaffold000048和scaffold000016的区域内设计了45对Indel标记，其中17对与该抗性基因紧密连锁，17对插入/缺失（Indel）标记如表2所示。 

表2与retr02紧密连锁的多态性I ndel分子标记 

Indel的PCR扩增反应体系为15μl，其中包括0.3μl primer F，0.3μl primer R，50ng DNA，1.5μl10×PCR buffer(含MgCl2)，1.2μl0.8mM dNTP，和0.5U Ampli Taq Gold。 

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min、55℃退火1min、72℃下延伸1.5min，35个循环；最后72℃下延伸10min；4℃保存。PCR产物加入7μl非变性双色缓冲液，利用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物，电泳恒压120V，0.5×TBE为缓冲液。然后采用银染法检测。 

利用Jionmap4.0分析抗性基因和17对Indel标记之间的连锁关系，该抗性基因两侧紧密连锁的分子标记为BrID10694和BrID101309，其与抗病基因连锁距离分别为(0.3cM)和(0.6cM)，如图3所示，定位该抗性基因位于大白菜A04染色体上的scaffold000060或者scaffold000104上。 

实施例2本发明大白菜TuMV抗性基因克隆及序列分析 

植物对病毒的抗性有主动抗性和被动抗性。在被动抗性，抗性基因一般为隐性基因，当前鉴定克隆的许多隐性抗病基因大多与真核生物的翻译起始因子（Eukaryotic translation initiation factor，eIFs）相关，主要是翻译起始因子4E（eukaryotic translation initiation factors4E，eIF4E）、翻译起始因子4G（eukaryotic translation initiation factors4G，eIF4G）和它们的异构体eIF(iso)4E、eIF(iso)4G。 

根据公开的大白菜基因组序列数据库的资料（http://brassicadb.org/brad/）及植物对病毒的隐性抗病机制，在定位的scaffold000060和scaffold0000104只有1个预测的基因Bra035393， 将其命名为retr02，该基因编码eIF(iso)4E蛋白。 

根据大白菜参考基因组中Bra035393的序列，设计引物： 

正向引物Bio10365F5’-TTGAGAACGTAGGTCTTTAA-3’ 

反向引物Bio10366R5’-TGGACATCTTGTAGTTGAGG-3’。 

用PCR技术以80122和80425的DNA为模板扩增出Bra035393的全基因片段参见图4：图4中第一泳道为M，第二泳道为80122经引物Bio10365F/Bio10366R扩增的retr02基因全长，第三泳道为80425经引物Bio10365F/Bio10366R扩增的Retr02基因全长。本PCR反应使用高保真PCR酶KOD-Plus-Neo，扩增30个循环（94℃1min，55℃1min，68℃1min）。将PCR产物使用omega胶回收试剂盒进行回收。使用天根TA克隆试剂盒，将回收到的基因片段连接到质粒载体PGM-T，并测定其序列。80122的Bra035393基因命名为retr02，80425的Bra035393基因命名为Retr02，其核苷酸序列分别如序列表SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。 

同样，根据大白菜参考基因组中Bra035393的序列，设计以下引物对： 

Bio11535F/Bio11536R： 

Bio11535F5’-ATGGCGACAGAGGATGT-3’， 

Bio11536R5’-TCAGACAGTGAACCGA-3’； 

Bio11561F/Bio11562R： 

Bio11561F5’-CTTTGACCGATCGAGTG-3’， 

Bio11562R5’-TGAGTAACCCGACAGAAT-3’； 

Bio11077F/Bio11078R： 

Bio11077F5’-CGACACCGTCCAAGACTTC-3’， 

Bio11078R5’-CCAATACCCATCAGAACAGC-3’。 

利用上述引物对对Bra035393进行cDNA的克隆。采用全式金RNA提取试剂盒对80122和80425进行RNA提取，并用全式金二步 法反转试剂盒进行反转成cDNA，使用高保真PCR酶KOD-Plus-Neo，扩增30个循环（94℃1min，55℃1min，68℃1min），扩增结果参见图5：图5中第五泳道为M，第一泳道为80122经引物Bio11561F/Bio11562R扩增的retr02cDNA全长，第二泳道为80425经引物Bio11561F/Bio11562R扩增的Retr02cDNA全长，第三泳道为80425经引物Bio11535F/Bio11536R扩增的Retr02CDS全长，第四泳道为80122经引物Bio11535F/Bio11536R扩增的retr02CDS全长。将PCR产物使用omega胶回收试剂盒进行回收。使用天根TA克隆试剂盒，将回收到的基因片段连接到质粒载体PGM-T，并测定其序列。 

对Bra035393进行gDNA的克隆，测序后获得了80122和80425的Bra035393的全基因序列如图6所示，碱基序列比对发现，Bra035393基因含有5个exon和4个intron。80122的Bra035393基因（即retr02）和80425Bra035393基因（即Retr02）存在着3个差异位点。80122的Bra035393基因相比80425的Bra035393基因，第一个差异位点是在exon1和intron1的连接处多出一个碱基G，第二个差异位点是在intron2中多出一个碱基T，第三个差异位点是在exon3中存在着一个SNP（A/G）。 

同时，测序后获得了80122和80425的Bra035393的cDNA序列如图7所示，碱基序列比对发现80425正常转录，80122的retr02基因在exon1和intron1处发生不同剪切形式，出现两种CDS序列，且翻译时均出现移码，提前终止，产生缩短的不成熟的蛋白质，如图8所示。 

实施例3retr02的不同剪辑对TuMV抗性产生的机制验证 

1、retr02基因的Insert G（exon1/intron1）会造成不同剪辑 

对5份大白菜TuMV抗病材料（80124，80186，2079，BP058，Chiifu）及3份大白菜TuMV感病材料（80403，80461，R-O-18）的Bra035393位点进行gDNA和cDNA克隆，证实retr02基因的Insert G(exon1/intron1)会造成不同剪辑。 

参照实施例2，提取这8份材料的DNA和RNA，进行gDNA和cDNA克隆测序，加上实施例2中的两份材料（80122和80425）。在共计10份材料（6份抗病材料和4份感病材料）中发现共有四份抗病材料（80122，80124，2079，BP058）含有Insert G(exon1/intron1)，在exon1/intron1处发生不同剪辑。用引物Bio11077F/Bio11078R对其检测，结果见图9，可以看出80122，80124，2079，BP058由于发生不同剪辑均扩增出了两种产物。 

2、retr02基因产生缩短的不成熟的eIF(iso)4E蛋白 

参照实施例2的方法，用正向引物Bio115375’-GGAATTCCATGGCGACAGAGGATGTG-3’（EcoRI酶切位点）和反向引Bio115385’-CCTCGAGGTCAGACAGTGAACCGA-3’（XhoI酶切位点）对retr02（80122）和Retr02（80425）的cDNA进行PCR扩增，扩增片段使用EcoRI和XhoI（NEB公司）进行酶切回收，酶切体系参照NEB公司。 

原核表达载体选取pET-32a（Novagen,Madison,WI,USA），其带有His标签。将pET-32a质粒使用EcoRI和XhoI（NEB公司）进行酶切回收，酶切体系参照NEB公司。 

将80122（retr02）和80425（Retr02）的酶切回收产物和pET-32a的酶切回收产物，采用T4连接酶（NEB公司）进行连接，挑取阳性克隆，测序。连接体系参考NEB公司。将测序正确的阳性克隆，转化到E.coli BL21(DE3)pLysS（Novagen）中。挑取阳性克隆，进行原核诱导表达。 

原核诱导表达体系如下： 

1）挑取单菌落，接入1ml含氨苄青霉素（50ug/ml）的LB培养液，37℃培养过夜。 

2）取100ul过夜培养物接入6ml含氨苄青霉素（50ug/ml）的LB 培养液，37℃振荡培养2h-3h以上，至对数中期（A600=0.5~0.6）。 

3）吸出500ul未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，室温高速离心1min，沉淀悬浮于100ul1x SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热3min，室温高速离心1min，冰上放置。 

4）在剩余培养物中加入IPTG至终浓度1mmol/L，20℃（或28℃）继续过夜培养，取500ul样品放于微量离心管中，室温高速离心1min。 

5）沉淀悬浮于100ul ddH₂O，加100ul2x SDS凝胶加样缓冲液，100度加热3min，室温高速离心1min，冰上放置，待全部样品处理完后上样。 

6）将电泳槽玻璃板洗净，吹干，并用凡士林封边，安装好。 

7）配12%分离胶，将配好的分离胶立即倒入凝胶槽内，至凝胶槽高三分之二处，加蒸馏水密封。待胶凝固后（约需30min）倒掉水，用吸水纸吸干。 

8）配5%浓缩胶将配好的浓缩胶立即倒入凝胶槽内（以插入梳子不溢出为宜），插入梳子。 

9）待胶凝固后，拔出梳子，放入电泳槽中。 

10）制备好的样品加入上样孔。 

11）连接电泳仪。 

12）打开电源，调整电压至80V，待样品跑过浓缩胶（大约需15min）后将电压调至150V，待指示剂（溴酚兰）到达凝胶的底部距离下缘1cm时停止电泳，大约需90min，电泳结束。 

凝胶染色如下： 

染色：将凝胶浸泡在染色液中，室温在摇床上缓慢染色1小时。 

脱染：将染液回收，凝胶先用蒸馏水漂洗一次，浸入脱染液中脱染，室温浸泡凝胶或37℃加热使其脱色，更换几次脱色液，直至出现清晰的电泳带为止。 

脱色后，将凝胶保存在水中或是20%甘油的水中。 

电泳照片见图10，从蛋白表达分析上看，Retr02编码正常的eIF(iso)4E蛋白，但是retr02的两种CDS序列均表达出缩短的不成熟的eIF(iso)4E蛋白。 

3、retr02基因丧失与TuMV-C4VPg互作的功能。 

参照实施例2的方法，用正向引物Bio1202135’-CCCATATGATGGCGA A AGGTA AGAGGC-3’（NdeI酶切位点）和反向引物Bio1202145’-CCCCGGGTCACTCGTGGTCCACTGGGA-3’（XmaI酶切位点）从TuMV-C4cDNA中扩增出TuMV-C4VPg片段。利用引物Bio115375’-GGAATTCATGGCGACAGAGGATGT-3’（EcoRI酶切位点）和反向引物Bio115385’-CCTCGAGGTCAGACAGTGAACCGA-3’（XhoI酶切位点）从80122和80425cDNA中扩增出retr02和Retr02的CDS片段。将二者克隆到酵母双杂系统Gal4中，参照Clontech酵母双杂试剂盒（Mountain View,CA,USA）的载体，按照试剂盒说明的实验条件和步骤进行了蛋白互作实验，结果图11所示。结果表明，80122（retr02）编码的蛋白不能够与TuMV-C4VPg蛋白互作，而80425（Retr02）编码的蛋白能够与TuMV-C4VPg蛋白互作。表明retr02由于可变剪辑，编码大大缩短的不成熟的蛋白，其丧失了与TuMV-C4VPg蛋白互作的功能，从而不能参与TuMV-C4在植物体内的增殖，避免TuMV-C4侵染植株。 

实施例4retr02基因序列标记在分子标记辅助选择育种中的应用 

利用本发明提供的序列信息可以产生retr02等位基因特异的分子标记，用于鉴定retr02和Retr02的基因型，在分子标记辅助选择育种过程中加以应用。例如，实施例1表2中的与retr02紧密相连的Indel标记可用于分子标记辅助选择育种。 

除此之外，根据retr02和Retr02在exon3处第602处碱基的差异（SNP，A/G）开发了CAPS标记（A602G）： 

参照实施例2的方法，用正向引物Bio110015’-TAAAACCCAAAACTGACT-3’和反向引物Bio110025’-TATCTCCTTCCACTTCTT-3’从80122和80425中扩增出retr02和Retr02的含exon3处SNP（A/G）的1329bp的片段，经限制性内切酶BsaXI(NEB公司）)酶切（酶切体系参照NEB公司的的BsaXI酶切说明操作），80122扩增片段（SNP，A）可以被酶切消化成两条片段（766bp+563bp），80425扩增片段（SNP，G）不可以被酶切消化成两条片段。利用该CAPS标记A602G，检测F₂群体，其与F₂群体中的抗性共分离，其可用于鉴定各杂种植株的基因型（图12）。 

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 

Claims (10)

1.大白菜TuMV抗性基因retr02，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述大白菜TuMV抗性基因retr02的等位基因Retr02，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述大白菜TuMV抗性基因retr02编码的蛋白，其为：

1）由SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或

2）在SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1）衍生的蛋白质。

4.权利要求2所述大白菜TuMV抗性基因retr02的等位基因Retr02编码的蛋白，其为：

1）由SEQ ID No.8所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或

2）在SEQ ID No.8所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1）衍生的蛋白质。

5.含权利要求1或2所述基因的载体。

6.含有权利要求5所述载体的宿主。

7.含有权利要求1或2所述基因或其特异片段的转化植物细胞或转基因植物。

8.权利要求1或2所述基因在分子标记辅助培育抗TuMV植物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述分子标记为表2中任一对Indel标记：

表2与retr02紧密连锁的多态性I ndel分子标记

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述分子标记为表CAPS标记A602G。

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