CN115850412B - 大豆GmSUI1基因及其编码蛋白在大豆疫霉根腐病侵染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，提供了大豆GmSUI1基因及其编码蛋白在大豆疫霉根腐病侵染中的应用，所述GmSUI1基因的CDS序列如SEQIDNO.1所示，所述编码基因的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。过表达GmSUI1的转基因大豆根霉病发病程度较重，且病程相关蛋白基因(PR)的表达量显著提高，为抗大豆疫霉根腐病相关机制研究提供了重要的基因基础及理论支持，为推进植物防御系统的研究和应用以及培育高抗病的大豆新品种提供宝贵的基因资源，在大豆抗病基因工程育种中具有重要的应用价值。

Description

大豆GmSUI1基因及其编码蛋白在大豆疫霉根腐病侵染中的 应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及大豆GmSUI1基因及其编码蛋白在大豆疫霉根腐病侵染中的应用。

背景技术

大豆疫霉根腐病(Phytophthora root and stem rot of soybean)是由大豆疫霉菌(PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdermann)引起的可造成大豆严重减产的世界性病害。该病菌生理小种变化快，且毒力结构复杂，因此导致抗病品种的抗性容易丧失，而利用基因工程手段解决该难题是一个有效途径。鉴定抗病相关基因，研究其抗性机制，对于阐明大豆抗病分子机理及利用基因工程改良大豆的抗病性有重要意义。植物防御反应的调控发生在从转录的积累和调节到蛋白的翻译和修饰等各个层面，涉及免疫反应蛋白、转录调节因子和防御相关基因等多种调节机制的参与和协调。迄今为止，大豆对大豆疫霉菌的分子防御机制尚不明晰。

真核翻译起始因子(eukaryoticinitiationfactor，简称为eIF)是参与真核生物的蛋白翻译起始这一复杂过程的蛋白。真核生物的翻译起始过程的完成，大多依靠eIF与核糖体、mRNA和起始tRNA之间的相互作用。目前，人们已发现eIF家族是一类重要的功能调节因子，参与了植物生长和分化等一系列的生命活动。如：eIF2B、eIF3等真核翻译起始因子在癌症等抗病方面起到了重要作用；eIF3与细胞周期的调控和细胞生长等密切相关。目前关于eIF4E和eIF5A两类基因的功能研究较多，在模式植物拟南芥以及毛白杨中都已进行了克隆及其功能的初步研究。eIF家族基因在次生木质部形成，抑制伏马毒素B1和黑暗引起的细胞凋亡，调控植物的衰老，影响种子的萌发速度等方面均起到了一定的调控作用。同时eIF家族基因能够参与一些非生物胁迫：能够响应高盐、干旱以及渗透等胁迫信号。此外，eIF家族基因在调控病毒RNA在植物体内的翻译起了一定的作用，在响应芜菁花叶病毒(TuMV)、CVYV、MNSV等马铃薯Y病毒、大麦黄花叶病毒、黑条矮缩病毒(RBSDV)均起着重要的作用。翻译起始因子基因的突变能够在保证植物自身的正常生理活动的情况下，抑制病毒与寄主细胞的相互作用，使该基因影响寄主细胞抵御病毒的侵染。

发明内容

本发明的目的在于提供大豆GmSUI1基因及其编码蛋白在大豆疫霉根腐病侵染中的应用，所述大豆GmSUI1基因在感染根腐病的大豆中过量表达，在大豆抗病基因工程育种中具有重要的应用价值。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了大豆GmSUI1基因，所述GmSUI1基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了大豆GmSUI1基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明还提供了大豆GmSUI1基因编码的蛋白质作为抗大豆疫霉根腐病侵染靶点的应用。

进一步地，GmSUI1基因及其编码的蛋白质在感病大豆中过量表达。

进一步地，GmSUI1基因沉默的大豆品种可以抗大豆疫霉根腐病。

本发明还提供了一种提高大豆抗大豆疫霉根腐病的方法，在大豆植株中沉默GmSUI1基因。

本发明还提供了大豆GmSUI1基因作为抗大豆疫霉根腐病侵染靶点在大豆辅助育种中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)通过双分子荧光互补(BiFC)、体外GST-pull-down技术证明了GmSUI1基因与GmERF5基因能够互作。

(2)利用农杆菌介导法对大豆进行遗传转化，对所获得的植株进行PCR检测、草丁膦(PPT)筛选、荧光定量PCR检测和WesternBlot鉴定，获得了GmSUI1过表达转基因大豆植株。

(3)对T3代GmSUI1转基因大豆植株接种疫霉菌1号生理小种，采用qRT-PCR的方法对菌的生物量积累进行分析，结果表明：GmSUI1过表达转基因大豆植株降低了大豆对疫霉菌的抗性，菌的生物量积累显著高于对照。GmSUI1基因在大豆应答疫霉菌侵染过程中为负调控因子。

(4)转基因GmSUI1过表达大豆植株与对照相比，病程相关蛋白基因(PR)的表达量提高，表明GmSUI1通过调控PR基因的表达来参与到植物的抗病防御反应中。

(5)GmSUI1受水杨酸、茉莉酸、脱落酸及乙烯四种激素不同程度的诱导表达。

附图说明

图1：GmSUI1的cDNA克隆；

图2：双分子荧光互补分析GmSUI1和GmERF5的互作；

图3：融合蛋白GST-GmSUI1的诱导表达；

图4：空载GST蛋白与融合蛋白GST-GmSUI1的纯化；

图5：GST-pull down分析GmSUI1与GmERF5的互作；

图6：GmSUI1的cDNA和蛋白质序列；

图7：GmSUI1氨基酸序列在PROSITE中的分析结果；

图8：GmSUI1与不同种植物蛋白的系统发生分析；

图9：GmSUI1系统进化分析与蛋白多重序列比对；

图10：GmSUI1蛋白的跨膜区域分析；

图11：GmSUI1蛋白的二维结构、三维结构；

图12：GmSUI1蛋白的磷酸化位点预测；

图13：GmSUI1蛋白的疏水性氨基酸分布图；

图14：GmSUI1蛋白的信号肽预测；

图15：GmSUI1在大豆不同组织中的表达量；

图16：qRT-PCR分析疫霉菌诱导下GmSUI1的表达水平；

图17：GmSUI1在不同激素处理下的相对表达量；

图18：GmSUI1蛋白亚细胞定位；

图19：PPT检测GmSUI1转基因大豆；

图20：T1代过表达GmSUI1基因大豆bar基因引物PCR检测的部分结果；

图21：T1代过表达GmSUI1基因大豆的western blot检测；

图22：T1代过表达GmSUI1转基因大豆的表达量分析；

图23：GmSUI1过表达转基因大豆植株子叶抗病性鉴定；

图24：GmSUI1过表达转基因植株疫霉菌的生物量累积分析；

图25：GmSUI1过表达的大豆植株中PR基因的表达量分析。

具体实施方式

本发明提供了大豆GmSUI1基因，所述GmSUI1基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了大豆GmSUI1基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明还提供了大豆GmSUI1基因编码的蛋白质作为抗大豆疫霉根腐病侵染靶点的应用。

在本发明中，GmSUI1基因及其编码的蛋白质在感病大豆中过量表达。

在本发明中，GmSUI1基因沉默的大豆品种可以抗大豆疫霉根腐病。

本发明还提供了一种提高大豆抗大豆疫霉根腐病的方法，所述方法具体为在大豆植株中沉默GmSUI1基因。

本发明还提供了大豆GmSUI1基因作为抗大豆疫霉根腐病侵染靶点在大豆辅助育种中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本实验前期研究证实过表达GmERF5(Ethylene Response Factor 5)转基因大豆植株能够提高对大豆疫霉根腐病菌的抗性，对受大豆疫霉菌诱导的高抗大豆品种“绥农10”酵母双杂交文库以GmERF5为诱饵蛋白进行筛选，得到15个与GmERF5互作的蛋白(经北京睿博兴科生物技术有限公司测序所知)。本试验对其中的真核翻译起始因子eIF(eukaryoticinitiation factor)，在数据库NCBI进行比对，并得到其全长序列，根据同源比对酵母中真核翻译起始因子SUI1(Genebank accession no.NM_001021768.2)与其同源性较高，将其命名为GmSUI1(Genebankaccessionno.LOC100791863)。

本实验通过针对GmSUI1 NCBI数据库内全长序列设计引物：

F(SEQ ID NO.3):ATGTCTGAATTAGACGATCAAA

R(SEQ ID NO.4):TCAGAAACCATGAATCTTG

以1μL东农50的cDNA为模板，分别加入1μL的F/R引物，12.5μL的ExTaqMix酶(购买自宝日医生物技术北京有限公司)，用水补足到25μL。用预变性94℃6min，94℃30s，58℃30s，72℃30s，30个循环，终延伸72℃7min，进行PCR。并以180V 10min进行电泳。结果见图1，由图1可知，在500bp以下位置有一条清晰单一的条带，与基因预期大小一致。说明该基因被成功克隆。

实施例2

本实施例提供了一种验证GmSUI1蛋白与GmERF5蛋白互作关系的方法，包括以下步骤：

1.双分子荧光互补技术(BiFC)验证互作蛋白

以GmSUI1和GmERF5的cDNA序列以及载体pSAT6-cEYFP和pSAT6-nEYFP的全长序列，针对其酶切位点设计如下引物。并将GmSUI1与载体pSAT6-cEYFP相连，GmERF5与载体pSAT6-nEYFP相连。引物序列如下：

F(SEQ ID NO.5):CGAGCTCCTACAAGGATGACGATGACAAG

R(SEQ ID NO.6):CGGTACCGAAACCATGAATCTTGAT

F(SEQ ID NO.7):CCATATGTATATCGTGATCAAGATGCGCCG

R(SEQ ID NO.8):CGAGCTCGCTCTTCTTCTTCTGAGGCACA

设计引物利用同源重组酶(购买自诺唯赞生物科技股份有限公司)参照说明书构建pSAT6-nEYFP-N1-GmERF5和pSAT6-cEYFP-N1-GmSUI1重组载体。利用酷来博公司所购买的原生质体转化试剂盒进行拟南芥原生质体的提取和转化，操作如下：

取短日照温室条件下培养约4周未抽苔的拟南芥叶片，优选第2、3和4对叶片；或在培养皿中生长10天左右的拟南芥幼苗。在超净工作台中用灭菌刀片将叶片横向切成0.5-1.0mm的细条，置于含有10mL混好的酶解液中，避光室温40rpm摇床摇动3h，直至大部分叶片长条呈现透明，说明基本酶解完毕。收集原生质体前，80rpm摇床摇动1-5分钟，让原生质体彻底释放出来。酶解后的产物用细胞筛过滤，用镊子或无菌枪头轻轻夹取酶解物帮助充分释放原生质体，去除未消化的叶片组织，用10mL溶液II-W5solution冲洗酶解器皿和未消化的叶片2-3次，将所有的液体收到50mL离心管中。选用水平转头，100g离心2min，升速3，降速3，去除上清。用5mL预冷的溶液II-W5 solution温柔重悬位于底部的原生质体，用剪尖的蓝枪头轻轻将原生质体悬起，100g离心1min，升速3，降速3，弃去上清。加入5mL预冷的溶液II-W5 solution，重悬原生质体，冰上孵育30min。显微镜下观察原生质体的状态并用血球计数板进行计数。100g离心1min，升速3，降速3，去上清，用相应体积的MMg溶液重悬原生质体，调整原生质体密度为2×10⁵/mL。在2mL的圆底离心管中加入10μL(10-20μg)纯化后的质粒，随后加入100μL原生质体，轻轻混匀，再加入110μL溶液IV-PEG solution，轻轻旋转离心管，或使用剪过的蓝枪头轻轻吸打，直至混匀，此过程中避免产生气泡，室温放置3-30min。2.加入0.44mL溶液II-W5 solution，轻柔混匀，终止转化。常温100g离心1min，升速3，降速3，在不损失原生质体的情况下，尽可能去除上清。加入1mL溶液II-W5 solution悬浮细胞。将离心管水平放置于光照培养箱中(20-25℃)，避免强光照，孵育18h。利用激光共聚焦显微镜以观察GmERF5和GmSUI1的蛋白互作情况，结果见图2，由图2可知，GmSUI1与GmERF5在拟南芥细胞核中呈现黄色荧光，说明二者在细胞核中存在相互作用。

2.体外GST-Pull-down检测GmSUI1与GmERF5蛋白的互作关系

(1)GST-GmSUI1融合蛋白的获得：

以GmSUI1的cDNA碱基序列以及PGEX4T-1(原核表达载体)的cDNA序列为模板，设计如下特异引物：

F(SEQ ID NO.9):CGTGGATCCATGTCTGAATTAGACGATC

R(SEQ ID NO.10):CGCTCGAGTCAGAAACCATGAATCTTGAT

以GmSUI1质粒作为模板利用应用特异性引物PCR扩增以得到增加酶切位点目的片段，成功后完成pGEX4T-1-GmSUI1载体的构建，利用同源重组酶(购买自诺唯赞生物科技股份有限公司)参照说明书进行构建pGEX4T-1-GmSUI1重组载体，并利用DE3菌株Rosetta大肠杆菌感受态(购买自上海唯地生物技术有限公司)，分别对pGEX4T-1和pGEX4T-1-GmSUI1质粒进行转化，以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，0.5mM)对菌液进行诱导，在诱导2h、4h、6h，及对照菌液在4h时，吸取2mL的诱导菌液用于检测，检测结果见图3，由图3可知，与未经诱导的第一条泳道的蛋白印迹相比，经IPTG诱导的泳道2、3、4在目的蛋白42kDa处蛋白条带明显变粗，说明重组蛋白能够被0.5mM IPTG有效诱导。按照GE公司Glutathione Sepharose 4B的GST纯化树脂说明书进行GST-GmSUI1融合蛋白的纯化，结果见图4，由图4可知，在42kDa大小处回收到单一的明显的蛋白条带。

(2)体外蛋白质结合分析(GST-Pull-down)：

1)树脂Glutathione Sepharose 4B的平衡：温和晃动Glutathione Sepharose 4B将其混匀，取2个1.5mL EP管，用剪过的枪头分别吸取50μL混合后的悬浮液注入其中。离心机提前4℃预冷，500rpm，离心5min，小心除去上清后，取1mL4℃保存的Washing Buffer加入其中，小心混匀。再次离心，除去上清，放置4℃准备待用。

2)GST-pull down：将纯化回收所得的GmSUI1融和蛋白及GST空载体蛋白，分别各取50μL，置于2mL离心管。4℃，360°转子孵育12h。然后向2个EP管中分别加入50μL纯化回收的GmERF5-His蛋白(参照碧云天His标签蛋白纯化试剂盒(耐还原螯合型)进行纯化回收)。4℃，利用360°转子孵育结合2h，然后低转速300rpm离心5min，并避开底层的Sepharose，小心除去上清。向EP管中加入1mL的1×Bindingbuffer清洗树脂三次，500rpm离心5min。小心去除Sepharose以外的液体，并加入2×SDS上样Buffer，沸水加热10min，12000rpm离心，吸取上清，进行Western Blot，操作方法如下：

溶液配制方法如下：电泳液：称取3.03g Tris-base，14.4g甘氨酸(Glycine)，0.975g十二烷基硫酸钠(SDS)，超纯灭菌水定容至1L。转移液：称取14.4g甘氨酸(Glycine)，3.03g Tris-base，0.975g十二烷基硫酸钠(SDS)，200mL甲醇(CH3OH)，超纯灭菌水定容至1L。

首先，制备SDS-PAGE胶，按顺序点样。进行转膜，将两张3MM滤纸和PVDF膜按照等比例剪裁成与胶同等大小，其中3MM滤纸同两块海绵垫、一支玻棒用转膜液浸泡湿润、沾湿。同时将PVDF膜置于少量甲醇浸润。按黑底朝下，海绵，滤纸，胶，PVDF膜，滤纸，海绵顺序依次摆放。将夹子夹好放入机器上。转移槽注意降温，并在槽内放入冰袋，采用80V转移1.5h。接下来进行免疫反应：小心从夹子上分离PVDF膜，预先备好的15mL封闭液中并将PVDF膜放置其中，室温于摇床摇晃1h进行封闭。将2μL小鼠抗体(Anti-His，abcam；ab9108)按照1：5000的比例加入10mL TBST液体中，将膜放置其中，室温放置于摇床1h进行一抗结合。TBST缓冲液洗膜两次，每次加缓冲液10mL，室温下摇动10min，然后用TBS缓冲液洗膜一次，继续在室温下清洗10min。在清洁的平皿加入10mLTBST缓冲液液体中，并加入1μL二抗(山羊抗鼠抗体)，使其比例达到1：10000，将PVDF膜放置其中，室温下摇床上摇晃1h。把PVDF膜进行干燥处理。取出4℃保存的成像缓冲液ECL中A液与B液，按1：1比例均匀混合覆盖在PVDF膜上。把处理的膜放置进入天能5500的化学发光成像系统(购买自北京原平皓生物技术有限公司)等待成像。结果见图5，由图5可知，GmERF5-His蛋白不能够下拉空载体GST蛋白，但是能够下拉GmSUI1-GST蛋白，说明二者存在体外互作。

实施例3

本实施例提供了大豆GmSUI1基因的生物信息学分析，具体分析软件如表1所示：

表1具体生物信息学的网站及数据库

利用NCBI的ORF Finder软件对GmSUI1(Genebank accession no.LOC100791863)进行分析，如图6可知，分析结果表明GmSUI1序列的cDNA为342bp，编码113个氨基酸。如图7可知，在PROSITE中对GmSUI1氨基酸序列进行分析，结果表明在第31-101个氨基酸的位置存在一个SUI1结构域，证实该基因为真核翻译起始因子EIF1/SUI1的一个亚族。如图8可知，从Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)这一在线数据库中，对GmSUI1进行查找比对获得与其同源性较高的其他物种基因序列，下载以上序列并利用MEGA5.1软件构建系统进化树以进行同源蛋白分析。如图9可知，应用DNAMAN对选取的蛋白序列采取多重序列对比，其中，大豆GmSUI1与可可树中TcaSUI1的同源性最高，同源率达到93.81％，其次为棉花(同源率为92.92％)，与菠萝中AcoSUI1的同源性最低，同源率为72.73％。如图10可知，用TMHMM在线软件上预测GmSUI1氨基酸跨膜结构，发现氨基酸存在跨膜区域(transmembrane)的概率较低，在膜内的概率也很低(inside)，而在膜外的概率较高(outside)，接近于1，因此GmSUI1蛋白质无明显跨膜区，113个氨基酸残基全部在膜外，说明该蛋白质没有跨膜转运信号，可以推测并不是膜上的受体。如图11可知，利用分子模拟软件对大豆GmSUI1二级结构、三维结构分析，GmSUI1通过模板预测二次结构，该结构共存在4个α螺旋结构，5个β折叠结构。如图12可知，基于神经网络算法，预测GmSUI1编码蛋白质的磷酸化位点，结果表明GmSUI1存在4个丝氨酸磷酸化位点、2个苏氨酸磷酸化位点以及2个酪氨酸磷酸化位点，说明GmSUI1可能被这3种氨基酸激酶磷酸化并激活，调控基因表达。如图13可知，GmSUI1蛋白的不稳定系数为27.71，总平均亲水性是-0.540，其阈值为40，预测为稳定的亲水蛋白。GmSUI1的信号肽进行预测如图14，剪切位点(C值)基本无变化，跨膜区域(S值)较平缓，综合参数(Y值)趋近于水平。由此推断，GmSUI1不存在信号肽。

实施例4

本实施例提供了大豆GmSUI1基因的表达模式分析，使用的植物材料为高抗大豆品种“绥农10”和“东农50”(分别购自黑龙江省龙科种业集团有限公司和黑龙江省广民种业有限责任公司)，当其幼苗长至V1期，分别进行以下处理：

(1)不同组织器官的差异性表达：挑选长势良好的东农50及绥农10幼苗，分别取其根、茎、叶和子叶样品速冻于液氮中，提取其RNA并反转录成cDNA，具体提取方法如下：

液氮研磨后的所需大豆组织适量，加入Trizol Reagent 1mL，震荡10s，冰浴10min。加入氯仿0.2mL，震荡10s，然后冰浴8min，经4℃13000rmp，15min离心后，取上清液0.5ml至新管，加等量异戊醇颠倒5次，冰浴10min，再次4℃10000rmp离心15min后取离心后沉淀，加75％的无水乙醇1mL以4℃7500rmp条件离心5min，吹打洗涤沉淀，加75％的无水乙醇1mL，再次以4℃7500rmp离心5min。最后，干燥沉淀，加DEPC水25μL回溶，并将其放置于-80℃保存。

以所得RNA为模板，利用HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect forqPCR试剂盒(购买自诺唯赞生物科技股份有限公司)进行反转录：在0.2mL硅化离心管内混入体系1μg RNA、4μL 5×All-in-one qRT SuperMix、1μL Enzyme Mix，并用RNase-freeddH₂O补足20μL的总体系。用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心收集至管底。并进行50℃15min、85℃5sec的处理。

接下来以cDNA为模板利用qRT-PCR的试验方法分析GmSUI1在不同品种的不同组织器官中的差异表达。其中GmSUI1定量引物设计如下：

F(SEQ ID NO.11):AATGCTGATGACTCGGGTGC

R(SEQ ID NO.12):CGATTCTGGGTCCTGAACAACT

实时定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)试验用TOYOBOSYBRGREEN(QPK-201)试剂盒(购买自北京原平皓生物技术有限公司)。结果用2^⁽-△△Ct)法进行定量计算。

结果见图15，如图15所示：通过qRT-PCR分析GmSUI1在大豆“东农50”及“绥农10”植株中的表达情况。组织特异性表达结果显示，GmSUI1在子叶中表达量最高，其次是叶、根和茎，且在感病品种“东农50”中子叶、叶及茎中的表达量均极显著高于抗病品种“绥农10”。

(2)疫霉菌处理：取大豆疫霉菌生理1号小种(由中国微生物菌种保藏中心提供)，将直径5mm菌块接种于10日龄的绥农10的下胚轴，随后将处理组和对照组分别于0h、6h、12h、24h、36h、48h和72h取大豆已展开的对生真叶，用液氮将取得的样品速冻，并存于-80℃备用。结果见图16，如图16所示：GmSUI1的相对表达量受大豆疫霉菌诱导表达，在P.sojae处理12h达到最高，说明GmSUI1能够应答大豆疫霉菌的侵染。

(3)不同激素处理：向大豆幼苗分别喷洒乙烯ET(5％)、脱落酸ABA(50μM)、茉莉酸MJ(100mM)、水杨酸SA(0.5mM)溶液；乙烯处理是把幼苗置于容器中，加入2mL40％的乙烯利和1gNaHCO₃与200mL水，迅速密封，其余激素按浓度用水溶解。取样时间分别为0h、3h、6h、9h、12h、24h、36h、48h和72h取样。结果见图17，如图17所示：GmSUI1在SA诱导下，GmSUI1的相对表达量变化更为明显，在诱导1h后开始升高，在诱导9h时表达量为最高值，继续诱导后表达量下降；在ABA诱导后相对表达量升高，在处理12h时相对表达量达到最高，然后又逐渐降低；在ET诱导9h后GmSUI1的相对表达量逐渐增加，在12h达到最高值，随后降低；GmSUI1在MJ诱导下相对表达量在6h开始增加，在12h时表达量达到最高值，而后迅速降低。其中，在SA诱导下GmSUI1相对表达量变化最为显著，其次是MJ，ET，ABA。

实施例5

该实施例提供了GmSUI1基因的亚细胞定位，具体如下：

首先以GmSUI1的cDNA序列以及植物表达载体pCAMBIA1302全长序列为模板设计引物，扩增片段并插入相应酶切位点。引物设计如下：

F(SEQ ID NO.13)：CCATGGTTATGTCTGAATTAGACGATC

R(SEQ ID NO.14)：GACTAGTGAAACCATGAATCTTGAT

以GmSUI1质粒作为模板利用应用特异性引物PCR扩增以得到增加酶切位点目的片段，成功后完成pCAMBIA1302-GmSUI1载体的构建，利用同源重组酶(购买自诺唯赞生物科技股份有限公司)参照说明书进行构建pCAMBIA1302-GmSUI1重组载体，并利用DH5α大肠杆菌感受态(购买自上海唯地生物技术有限公司)，参照酷来博公司所购买的原生质体转化试剂盒进行拟南芥原生质体的提取和转化。将连接好的重组质粒注入置备拟南芥原生质体，25℃光照培养18h-20h，提取最终均匀的原生质体进行压制装片，利用荧光共聚焦显微镜进行亚细胞定位观测，以观察35S：GmSUI1-GFP表达融合蛋白的亚细胞定位的具体情况，结果如图18所示，从图18中可以看出，在白光下，拟南芥细胞均呈现完整状态；在红光激发下，叶绿体均呈现红色状态；在绿色荧光激发下，转入空载体1302质粒与转入pCAMBIA1302-GmSUI1质粒的拟南芥原生质细胞中的细胞膜、细胞质和细胞核均呈现绿色，GmSUI1定位在细胞膜、细胞核和细胞质内。

实施例6

该实施例提供了GmSUI1基因过表达大豆转基因植株，具体如下：

1.大豆遗传转化

(1)获得大豆转基因植株所用的培养基成分，见表2～6：

表2萌发(种豆)培养基1L

蔗糖Sucrose	20g
		B5培养基基础盐	3.21g
琼脂Agar	16g
		蒸馏水	定容至1L
细胞分裂素6-BA	1.0mg
		PH	5.8

表3共(侵染)培养基1L

表4恢复培养基1L

蔗糖Sucrose	30g
		MS培养基基础盐	4.443g
吗啉乙磺酸MES	0.59g
		琼脂Agar	8g
蒸馏水	定容至1L
		头孢霉素Cef	500mg
细胞分裂素6-BA	1.67mg
		pH	5.6

表5伸长培养基1L

蔗糖Sucrose	30g
		B5培养基基础盐	3.21g
吗啉乙磺酸MES	0.59g
		琼脂Agar	16g
蒸馏水	定容至1L
		门冬酰胺酶L-Asp	50mg
吲哚乙酸IAA	0.1mg
		L-焦谷氨酸L-Pyr	100mg
赤霉素GA3	0.5mg
		头孢霉素Cef	250mg
反玉米素ZR	1.0mg
		pH	5.6

表6生根培养基1L

蔗糖Sucrose	30g
		B5培养基基础盐	3.21g
琼脂Agar	16g
		蒸馏水	定容至1L
生长素IBA	1.0mg
		pH	5.6

(2)农杆菌子叶节转化法获得大豆遗传转化植株

以GmSUI1的cDNA序列及带有Bar基因片段的植物过表达载体pCAMBIA3301-Flag的克隆位点设计特异引物。将GmSUI1融合N端Flag标签连接到载体pCAMBIA3301上，引物碱基序列如下：

F(SEQ ID NO.15)：CGATCGACTACAAGGATGACGATGACAAG

R(SEQ ID NO.16)：CTCGAGTCAGAAACCATGAATCTTGAT

以前期实验获得GmSUI1质粒作为模板进行PCR扩增其目的片段，并双酶切其载体，利用同源重组酶(购买自诺唯赞生物科技股份有限公司)参照说明书进行构建pCAMBIA3301-Flag-GmSUI1重组载体，体系如下：线性化载体1μL，插入片段1μL，5×CE IIBuffer 4μL，Exnase II 2μL，ddH₂O 12μL。大肠杆菌培养箱37℃放置30min。降至4℃或立即置于冰上冷却。将大肠杆菌DH5α(购买自上海唯地生物技术有限公司)提前置于冰上解冻。解冻后的感受态中加入10μL所得连接产物，置于冰上，冰浴30min。水浴锅42℃预热，冰浴后迅速置于水浴锅经65s热激后，再次将其放置冰上2-3min。无菌台内，在EP管中加入700μLLB液体，在大肠杆菌37℃摇床内振荡培养至少60min。EP管底部沉淀吹打混匀后，涂布在有Kana抗性LB固体培养基上，倒置于大肠杆菌培养箱内培养过夜。选取LB固体培养基上饱满的单斑加入含有Kana抗性的液体LB液体培养基中，再次放置于37℃大肠杆菌摇床，振荡培养过夜。将菌液与30％甘油按1：1比例保存大肠菌种。

选取饱满、健康的“东农50”大豆种子(DN50)，氯气灭菌16h。在萌发培养基中将无菌的DN50种子种下，组培室25℃培养5d。将萌发的无菌大豆幼苗，切除下胚轴，将大豆沿中线纵向剖开，去除顶芽、腋芽，在子叶节处划3至5刀。疫霉菌液摇至OD₆₀₀＝0.5，12000rpm离心，加入侵染培养基重悬，并将划好的子叶节外植体，置入其中，在共侵染培养基中28℃，120rpm条件下震荡30min。将所侵染的子叶节外植体吸干菌液，近轴面置于共侵染固体培养基上，摆放整齐，在组培室内避光暗培养3d。子叶节置入经121℃高温灭菌的超纯水清洗3次，用灭菌的滤纸吸去液体，将其插入恢复固体培养基上，组培室内培养15d。将长至1～2cm的抗性芽切下插入伸长培养基中，组培室内培养15d。待伸长苗发育健壮，将其移入生根培养基中直立培养30d。当伸长苗长出适量根，将其移除放置于掺有蛭石的腐植土中，然后，在温室内培育大豆转化植株。

转基因植株的鉴定

1)T1代转基因大豆的草丁膦抗性检测

处置bar基因扩增出条带的阳性植株与非转基因植株浓度为175mg/L的草丁膦，3d后进行观察，进一步验证bar基因是否成功转入到植株中，结果见图19，由图19可知，观察其3d后涂抹部位变化情况：对照非转基因大豆叶片处理部位全部变黄，颜色较深且存在褐色斑点，过表达转基因大豆，叶片处理部位表现轻微发黄，部分位置无明显变化，说明过表达转基因大豆具有PPT抗性，即转化植株内存在bar基因，转化成功，上述植株为转基因植株。

2)PCR对bar外源基因检测

播种T0代转化植株所获种子，并对其每一株植株进行编号(对应于T0代植株)，在温室条件下进行常规培育。当转化植株生真叶展开时，通过SDS小量法提取相应叶片DNA，并针对进行外源基因bar基因进行PCR检测，结果见图20，由图20可知，3次PCR重复共检测获得26株T1代GmSUI1过表达转基因的大豆阳性植株。

Bar基因的引物序列如下所示：

F(SEQ ID NO.17):ATATCCGAGCGCCTCGTGCAT；

R(SEQ ID NO.18):GGTCTGCACCATCGTCAACCACT

3)WesternBlot检测T1代GmSUI1过表达转基因大豆植株

用Flag抗体(购买自哈尔滨赛信生物科技有限公司)进行Western Blot检测经bar引物检测为阳性的GmSUI1过表达T1代转基因大豆植株。称取1g大豆新鲜叶片，加入Buffer在液氮低温超冷条件下用研钵研磨。以最高转速离心15min，吸取上清即为蛋白备用。利用WesternBlot分析，结果见图21，由图21可知，与对照“东农50”相比在目的条带的位置，出现清晰完整的杂交信号，说明以上均为转基因植株。

4)取幼嫩的转化植株叶片，用液氮速冻后提取RNA并反转录为cDNA。利用qRT-PCR检测GmSUI1过表达转基因大豆植株中GmSUI1的相对表达量，结果见图22，由图22可知，与对照“东农50”相比在目的条带的位置，出现清晰完整的杂交信号，这3株植株分别编号为SUI1-OX17、SUI1-OX60、SUI1-OX117，说明以上均为转基因植株。

实施例7

对3个转化事件扩繁所得的T3代GmSUI1的过表达转基因大豆进行Western Blot检验，并对其进行活体子叶接种鉴定试验。

1)活体子叶接种法

选择已经过鉴定的GmSUI1过表达转基因大豆植株和对照非转基因植株，分别对其接种大豆疫霉菌1号生理小种。在7日龄的子叶滴加20μL经诱导的游动孢子，在另一片子叶上滴入等量的灭菌超纯水作为对照，置于16h/8h日照/黑暗条件下的大豆光照培养箱，在接种3d后观察其发病状况，结果见图23，由图23可知，GmSUI1过表达转基因大豆植株的子叶，接种部位变为褐色，并伴随水渍状病斑的出现；而对照非转基因大豆植株的子叶接种部位轻微发黄，几乎没有水渍状病斑出现，无明显发病症状，发病程度低于转基因植株。

2)大豆疫霉菌生物量的积累

将感病后的处理子叶提取RNA，并用于定量qRT-PCR检测，数据处理公式为：菌的生物量积累＝2^-△△Ct，其中-△△Ct＝CtTEF1–CtEF1β，其中GmTEF1(Genebank accessionno.EU079791)为大豆疫霉菌内参基因。

引物设计如下所示：

F(SEQ ID NO.19):TGATCGTGCTGAACCACCC；

R(SEQ ID NO.20):CGAGCGACGGTCCATCTT。

结果见图24，由图24可知，GmSUI1过表达转基因大豆植株的子叶中疫霉菌内参基因GmTEF1的相对表达量在接菌后极显著高于对照植株。上述结果说明GmSUI1负调控大豆对大豆疫霉菌的抗性。

3)病程相关蛋白PR基因的qRT-PCR检测

以病程相关蛋白PR基因特异性引物，对GmSUI1过表达转基因植株进行qRT-PCR进行检测，引物序列如下所示：

F(SEQ ID NO.21):GTTCGGAATGTGAAGCAAGGA；

R(SEQ ID NO.22):ATAGGAGAAAAGAGCCGCCAA；

F(SEQ ID NO.23):AACGCCGTGAGTGCTTATTGT；

R(SEQ ID NO.24):TTTGCTCCTGTTCCTGTATTTGTC。

结果见图25，由图25可知，GmSUI1过表达转基因的大豆叶片中PR2、PR4的表达受到显著的抑制，可见GmSUI1通过抑制PR2、PR4的表达，负调控大豆对疫霉菌的抗性。

由上述实验可知，GmSUI1基因与大豆抗疫霉菌正调控因子GmERF5存在互作关系。克隆GmSUI1蛋白，通过亚细胞证实该蛋白定位在细胞的膜质核上。且通过疫霉菌处理抗感大豆品种“东农50”和“绥农10”证实GmSUI1能够响应疫霉菌得侵染，并发现过量表达GmSUI1基因转基因大豆对大豆疫霉菌的表现为感病，主要表现在GmSUI1的疫霉菌接菌鉴定、病程相关蛋白基因PR的表达量变化。此外，GmSUI1还可受到水杨酸、茉莉酸、乙烯和脱落酸不同程度的诱导表达，表明其可能作为生物及非生物胁迫的交联因子在逆境胁迫中发挥重要作用。

由以上实施例和实验例可知，本发明提供了大豆GmSUI1基因及其编码蛋白在大豆疫霉根腐病侵染中的应用，所述大豆GmSUI1基因在感染根腐病的大豆中过量表达，在大豆抗病基因工程育种中具有重要的应用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.大豆GmSUI1基因在培育易感大豆疫霉根腐病大豆中的应用，其特征在于，所述GmSUI1基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，所述GmSUI1基因过量表达的大豆品种易感大豆疫霉根腐病。

2.一种促进大豆易感大豆疫霉根腐病的方法，其特征在于，在大豆植株中过量表达GmSUI1基因；所述GmSUI1基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。