CN110373494B

CN110373494B - 与大白菜芜菁花叶病毒病抗性基因retrcs03紧密连锁的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN110373494B
Application number: CN201910764572.XA
Authority: CN
Inventors: 李巧云; 满卫萍; 赵智中; 张志刚; 刘栓桃; 王荣花
Original assignee: Vegetable Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Vegetable Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-08-19
Filing date: 2019-08-19
Publication date: 2020-05-22
Anticipated expiration: 2039-08-19
Also published as: CN110373494A; NL2026261A; NL2026261B1

Abstract

本发明提供与大白菜芜菁花叶病毒病抗性基因retrcs03紧密连锁的分子标记及其应用，属于生物技术领域。本发明提供的分子标记进一步定位了大白菜TuMV抗性基因retrcs03，有助于更好地在大白菜抗TuMV分子标记辅助选择中加以利用，同时可对该基因进行定位，为该基因的克隆及深入利用和研究奠定基础。同时，将其应用于育种工作中，将大大降低TuMV流行对大白菜生产造成的经济损失，有益于降低生产成本，具有很大的应用潜力和较高的经济价值。

Description

与大白菜芜菁花叶病毒病抗性基因retrcs03紧密连锁的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及与大白菜芜菁花叶病毒病抗性基因retrcs03紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

芜菁花叶病毒病(Turnip mosaic virus,简称TuMV)属马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyviruse Y)，主要通过蚜虫或汁液接触传毒。TuMV是马铃薯Y病毒科中寄主范围最广、危害最大的病毒，在世界范围内分布相当广泛，除南极洲外，各大洲均有分布，而且寄主范围十分广泛，可侵染43个科156个属的318种的双子叶植物(包括十字花科、菊科、藜科、豆科、石竹科等)和部分单子叶植物(Walsh and Jenner 2002)。在我国大白菜生产中，平均每年造成5％的产量损失，有些年份减产10％以上，病害严重的地块几乎绝收。该病防治困难，化学防治效果不理想，最有效且可持续的防治措施就是培育抗病品种(Hughes et al.2002)。利用分子标记辅助选择或通过基因工程手段改良或创新种质，可大大加快育种进程，是现代育种的发展趋势。

研究表明，大白菜芜菁花叶病毒的遗传规律十分复杂(谭其猛1980；Provvidenti1980；Leung and Williams 1983；钮心恪1984；Suh 1995；闫瑾琦2000；Yoon et al.1993；韩和平2003；Rusholme等2007；潘春清2007；张晓伟等2009；屈淑平等2009；Li et al.2011；李巧云等2012；钱伟等2012)，在多个位点上存在多种变异。

已定位在大白菜上的TuMV抗性基因TuRB0lb(Rusholme et al.2000)、retr01和ConTR0l(Rusholme et al.2007)、TuRBCH01(Wang et al.2011)、retr02(Qian etal.2013)、TuRB07(Jin et al.2014)以及TuRBCS01(Li et al.2015)分别位于第A06、A04、A08、A06、A04、A06和A04染色体上。此外，张晓伟等(2009)检测到3个与大白菜TuMV-C4株系抗性有关的QTLs，分别位于大白菜A03、A04和A06染色体上；田希辉等(2014)检测到1个与大白菜TuMV-C4株系抗性相关的主效QTL，位于A09染色体上；李国亮等(2019)检测到两个与大白菜TuMV-C4株系抗性有关的QTLs，分别位于大白菜A07和A08染色体上。

在前期研究中，以抗病材料‘73’和感病材料‘06-247’为亲本，构建分离群体，鉴定出一个隐性TuMV抗性基因，命名为retrcs03。前期的研究仅初步筛选出与该基因连锁的3个分子标记BrID90143(4.2cM)、BrSSR4068(4.2cM)和BrID10645(10.1cM)(曾强等2014)，但上述分子标记连锁度不高。因此有必要进一步筛选与基因retrcs03更加紧密连锁的分子标记。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供与大白菜芜菁花叶病毒病抗性基因retrcs03紧密连锁的分子标记及其应用。本发明提供的分子标记进一步定位了大白菜TuMV抗性基因retrcs03，有助于更好地在大白菜抗TuMV分子标记辅助选择中加以利用，同时可对该基因进行定位，为该基因的克隆及深入利用和研究奠定基础，并有利于抗芜菁花叶病毒大白菜的选育。

本发明的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供检测待测大白菜基因组中与大白菜芜菁花叶病毒病抗性基因retrcs03紧密连锁的分子标记的物质的应用。

本发明提供的检测待测大白菜基因组中与大白菜芜菁花叶病毒病抗性基因retrcs03紧密连锁的分子标记的物质在如下1)-9)中任一种中的应用：

1)、鉴定或辅助鉴定待测大白菜的芜菁花叶病毒抗性；

2)、制备鉴定或辅助鉴定鉴定或辅助鉴定待测大白菜的芜菁花叶病毒抗性的产品；

3)、鉴定或辅助鉴定待测大白菜为抗芜菁花叶病毒大白菜或感抗芜菁花叶病毒大白菜；

4)、制备鉴定或辅助鉴定大白菜为抗芜菁花叶病毒大白菜或感抗芜菁花叶病毒大白菜的产品；

5)、大白菜育种；

6)、选育大白菜抗芜菁花叶病毒品种；

7)、制备选育大白菜抗芜菁花叶病毒品种产品；

8)、鉴定或辅助鉴定待测大白菜的抗芜菁花叶病毒性状；

9)、制备鉴定或辅助鉴定待测大白菜的抗芜菁花叶病毒性状产品。

上述应用中，

所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该标记片段大小为191bp。

上述应用中，

所述检测检测待测大白菜基因组中与大白菜芜菁花叶病毒病抗性基因retrcs03紧密连锁的分子标记的物质为如下1)或2)：

1)所示的物质包括成套引物，所述成套引物由引物1和引物2组成；

2)所示的物质包括含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒；

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；

a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；

b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

上述应用中，

所述成套引物中的每条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为1.0μM。

本发明第二个方面是提供一种产品。

本发明提供的产品，为上述检测待测大白菜基因组中与大白菜芜菁花叶病毒病抗性基因retrcs03紧密连锁的分子标记的物质。

上述产品中，所述产品为如下1)-4)中任一种：

1)鉴定或辅助鉴定鉴定或辅助鉴定待测大白菜的芜菁花叶病毒抗性的产品；

2)鉴定或辅助鉴定大白菜为抗芜菁花叶病毒大白菜或感抗芜菁花叶病毒大白菜的产品；

3)选育大白菜抗芜菁花叶病毒品种的产品；

4)鉴定或辅助鉴定待测大白菜的抗芜菁花叶病毒性状产品。

本发明第三个方面是提供一种鉴定或辅助鉴定待测大白菜为抗芜菁花叶病毒大白菜或感芜菁花叶病毒大白菜的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：采用上述产品对待测大白菜的基因组DNA进行PCR扩增，得扩增产物；检测所述扩增产物。

若所述扩增产物含有191bp的片段，则将所述待测大白菜候选为抗芜菁花叶病毒大白菜；

若所述扩增产物含有199bp的片段，则将所述待测大白菜候选为感芜菁花叶病毒大白菜；

进一步的，如所述扩增产物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，则将所述待测大白菜候选为抗芜菁花叶病毒大白菜；

进一步的，如所述扩增产物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，则将所述待测大白菜候选为感芜菁花叶病毒大白菜。

本发明第四个方面，是提供一种选育大白菜抗芜菁花叶病毒品种的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：采用上述产品对待测大白菜的基因组DNA进行PCR扩增，得扩增产物；检测所述扩增产物；选择扩增产物含有191bp的片段的大白菜作为亲本进行育种。

进一步的，所述扩增产物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步的，所述待测大白菜为个体或群体。

本发明具备的有益效果在于：

1)本发明的分子标记进一步定位了大白菜TuMV抗性基因retrcs03。标记的特异性强、稳定性高，并且标记的筛选方法简便快捷，对检测设备和引物模板质量要求不高，具有试验试剂用量少，速度快，成本低，适合大批次、高通量、自动化的优点。非常适合现代农业中的分子育种趋势。

2)本发明为大白菜TuMV抗性基因retrcs03的图位克隆提供了非常重要的分子遗传学信息。

3)本发明的大白菜TuMV抗性基因retrcs03的分子标记引物应用于育种工作中，将大大降低TuMV流行对大白菜生产造成的经济损失，有益于降低生产成本，具有很大的应用潜力和较高的经济价值。

4)本发明筛选出与基因retrcs03连锁的SSR标记，可以有效的用于基因retrcs03的标记辅助选择，所述分子标记与大白菜TuMV抗性基因retrcs03的紧密连锁距离为1.1cM，利用该标记在大白菜基因组中的物理位置信息，可以进行基因retrcs03的精细定位，或通过染色体步移法接近该基因，从而提高选择的准确性，缩短育种年限，同时也为基因retrcs03的克隆打下基础，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中所涉及的引物SAAS_mBr4174在两亲本及抗、感池中的扩增结果图，P1是亲本‘73’，P2是亲本‘06-247’，A是感池，B是抗池。

图2是本发明实施例1中基因retrcs03的标记连锁图，左侧数字代表连锁距离，单位是cM。

图3为是本发明实施例1中引物组合SAAS_mBr4174在BC1分离群体部分单株中的扩增结果图。P1是亲本‘73’，P2是亲本‘06-247’，1-15是15个回交单株，其中编号为1、3、4、6、9、11、12、14的单株扩出的是抗病条带，编号为2、5、7、8、10、13、15的单株扩出的是感病杂合条带。

图4为是本发明实施例1中利用引物组合SAAS_mBr4174扩出的抗病标记和感病标记的序列比对结果图；图中示出两序列在6个位置有差异，其中5个位置的差异为碱基替换，1个位置的差异为碱基缺失，即抗病标记在121-128处缺失碱基序列CTATCTAT。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明的一个具体实施方式中，提供了一种与大白菜TuMV抗性基因retrcs03紧密连锁的分子标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该标记片段大小为191bp。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种扩增与大白菜TuMV抗性基因retrcs03紧密连锁的分子标记的引物对，该引物对序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种与大白菜TuMV抗性基因retrcs03紧密连锁的分子标记的检测方法，该方法以抗、感TuMV的大白菜材料的基因组DNA为模板，经PCR扩增，得到能同时鉴定父本、母本及其杂合体的基因型的特异谱带，该特异谱带包括携带抗性基因的植株特异谱带和不携带抗性基因的植株特异谱带，所述携带抗性基因的植株谱带为核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的分子标记。

所述不携带抗性基因的植株谱带的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

上述方法中，PCR反应体系为：10μL反应体系中包括正、反向引物各1.0μM，DNA模板50-70ng，2×Es Taq MasterMix(含Taq DNA聚合酶、3mM MgCl₂和400μM dNTPs)5.0μL。

上述方法中，PCR扩增程序为：95℃预变性5min，94℃变性1min，50℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。另外，实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法，具体操作可参看分子生物指南或产品说明书。

实施例1与基因retrcs03紧密连锁分子标记的筛选、标记测序及基因定位

植物材料：本发明所用的抗病亲本材料为大白菜高抗TuMV的高代自交系材料‘73’,感病材料为‘06-247’，分离群体为‘06-247’×‘73’×‘73’回交群体。将上述材料采用丹麦品氏进口育苗基质灭菌后，播于6.5cm塑料育苗钵中，置于人工气候室内培养。培养条件为：温度25℃，湿度为60％，光强8000-9000lux。

毒源材料：TuMV的C4株系，引自中国农科院蔬菜花卉研究所，用前一个月在感病材料上繁毒培养。

TuMV接种鉴定：待供试材料长到三叶一心时，分别对两亲本及BC1代群体接种TuMV-C4。接种方法采用摩擦接种法，具体参见李巧云等(2009)，2-3周后再进行抗病性鉴定。单株TuMV抗病性鉴定采用生物学观察的方法，鉴定标准参照GB/T 19557.5-2004。综合分析多次的鉴定结果，确定每个单株的抗性，进而计算群体的病情指数或抗、感单株的分离比例，分析其抗性归类及抗性遗传。结果表明，在180个单株中，抗病单株89株，感病单株91株，χ² _c＝0.02<χ² _0.05＝3.84，符合1:1的分离比例。

引物来源：根据曾强等(2014)中对大白菜TuMV抗性基因retrcs03的分子标记筛选结果，参考大白菜基因组网站http://brassicadb.org/brad/上的标记信息，根据该基因标记附近的序列信息设计SSR引物150对。

引物设计具体方法为选取600bp左右上述基因组序列，登陆网站http://www.gramene.org/gremene/searches/ssrtool，利用软件SSRIT(Simple Sequence RepeatIdentification Tool)在线筛选SSR。筛选标准为：单核苷酸重复不少于10次，双核苷酸重复不少于6次，三核苷酸重复不少于4次，四、五、六及以上核甘酸重复不少于3次。根据SSR两端的序列，利用primer premier5.0软件设计引物。引物由上海生物工程有限公司合成。上述150对引物序列用于基因retrcs03紧密连锁分子标记的筛选。

基因组DNA的提取和检测：本发明中所用材料的基因组DNA采用天根(TIANGEN)公司的快捷型植物基因组DNA提取试剂盒进行提取，具体方法如下：

1、处理材料：取植物新鲜组织0.2g，加入液氮充分碾磨。加入400μl缓冲液FP1和6μl的RNase A(10mg/ml)，旋涡振荡1min，室温放置10min。

2、加入130μl缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1min。

3、12,000rpm(～13,400×g)离心5min，将上清转移至新的离心管中。

4、将上清液再次12,000rpm(～13,400×g)离心5min，将上清转移至新的离心管中。

5、向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，此时会出现絮状基因组DNA。12,000rpm(～13,400×g)离心2min，弃上清，保留沉淀。

6、加入600μl 70％乙醇，涡旋振荡5sec，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，弃上清。

7、重复步骤6。

8、开盖倒置，室温5-10min，彻底晾干残余的乙醇。

9.加入100μl双蒸水，65℃水浴10-60min溶解DNA，其间颠倒混匀数次助溶，最终得到DNA溶液。

用分光光度计测定所提取DNA的浓度和纯度，并用1％的琼脂糖胶进行电泳检测。最后使用前用去离子水将其稀释至50ng/μL的浓度。

抗、感池的构建：选取BC1分离群体中的极端抗病单株和极端感病单株各10株的基因组DNA，各自混合后构建抗、感池，用于引物多态性筛选和标记连锁分析。

PCR扩增及扩增产物检测：PCR扩增反应体系为：10μL反应体系中包括正、反向引物各1.0μM，DNA模板50-70ng，2×Es Taq MasterMix(含Taq DNA聚合酶、3mM MgCl₂和400μMdNTPs)5.0μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min，94℃变性1min，50℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。电泳后银染检测结果。结果表明，以两亲本基因组DNA为模板，利用大白菜基因组中目的区域内的150对引物进行扩增，其中，成功扩增的有138对，在双亲之间有多态性的有42对，在双亲和抗、感池间有一致多态性的有21对，最后在BC1群体180个单株中进行验证，结合抗病性鉴定结果，有11对引物扩出的标记与基因retrcs03存在连锁关系，其中引物SAAS_mBr4174扩出的标记与基因retrcs03的连锁关系最近，连锁距离为1.1cM。在180个单株中，177个单株的抗病性鉴定结果与引物SAAS_mBr4174的扩增结果一致，只有149号、163号和173号3个单株发生了交换。

数据统计与分析：筛选出在两亲本和抗、感池间具有多态性的引物，在BC1群体180个单株中进行验证，并对各单株带型进行统计，感病条带记做“A”，抗病条带记做“H”，条带不清或无扩增条带记做“-”。用JoinMap4.0软件进行遗传连锁分析，计算连锁距离，确定各标记与基因的相对位置。结果如图2所示，其中引物SAAS_mBr4174扩增位点与基因retrcs03的连锁距离只有1.1cM，为紧密连锁关系。

PCR产物的克隆测序：电泳确认目的条带被扩增后，再用高保真酶扩增，扩增产物用赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)的胶回收试剂盒回收，然后，将胶回收产物4μL和TaKaRa公司1μL的pMD19-T cloning Vector、4ul的Solution I加入到微型离心管中，轻弹使之混匀，将其置于16℃恒温条件下连接1小时，再放4℃过夜连接。转化大肠杆菌感受态细胞DH5ɑ，转化菌在含50μg/ml卡那霉素的LB固体平板上37℃倒置培养16小时左右。菌落PCR检测后挑取阳性克隆测序。对引物SAAS_mBr4174在抗病亲本73中扩出的谱带测序结果如SEQ ID No.1所示，大小为191bp，在感病亲本06-247中扩出的谱带如SEQ IDNo.4所示，大小为199bp。

序列比对与分析：将上述标记序列与已发表的大白菜全基因组序列(http://brassicadb.org/brad/)进行比对，确定各标记在染色体上的具体位置，再根据各标记与大白菜TuMV抗性基因的关系，实现对目的基因的定位。如图2所示，基因retrcs03位于两标记BrID101487和SAAS_mBr4174_191之间。将抗病标记SAAS_mBr4174_191的序列与大白菜基因组序列(v1.5)进行比对，结果显示该标记位于大白菜4号染色体上6371496-6371694之间。将抗病标记BrID101487的序列(详见http://brassicadb.org/brad/)与大白菜基因组序列(v 1.5)进行比对，结果显示该标记位于4号染色体上3229172-3229304之间。因此，基因retrcs03位于大白菜基因组4号染色体上3229304-6371496之间约3.14Mb的区域。

表1为上述BC1群体部分单株的抗病性鉴定结果和利用引物组合SAAS_mBr4174的扩增结果，其中R表示抗病，S表示感病，扩增带型1表示与抗病亲本‘73’一致的条带，2表示与感病亲本‘06-247’一致的条带，3表示杂合条带，0表示未扩出条带。其中，绝大部分单株的扩增结果与抗病性鉴定结果一致，只有1号单株不一致，表现为感病，但扩出的是抗病条带。

表1

利用上述对基因retrcs03的定位结果，可进行该基因的进一步精细定位及图位克隆；利用该基因两侧紧密连锁的分子标记，可在育种过程中进行该基因的分子标记辅助选择，有助于抗TuMV大白菜品种的选育；利用上述基因retrcs03两侧的紧密连锁标记为前景标记，选取大白菜基因组中各个染色体上的部分标记为背景标记，构建珍贵育种材料(如06-247)的近等基因系，可改良或创新种质。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 与大白菜芜菁花叶病毒病抗性基因retrcs03紧密连锁的分子标记及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 191

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

catccaaatt ctacccaatc tatggtgtga atagatacag ttctaacctg gaaacgtagc 60

atcaaatagc ttctgaaagt ttccttcatg gactcgtgtc tcaatcaaac gaccaatcta 120

ttacaataaa atagacttgc ctctctcctc atgaagccac atcagcatgg agaggtgagc 180

attttaggac a 191

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tgtcctaaaa tgctca 16

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

catccaaatt ctaccc 16

<210> 4

<211> 199

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

catccaaatt ctacccaatc tatggtgtga atagatacag ttctaaccta ggaacgtagc 60

atcaaatagc ttctgaaagt ttccttcata gactcgtgtc tcaatcaaac aaccaatcta 120

tctatctatt acaataaaat agacttgcct ctctcctcat gaagccacat cagcatggag 180

agatgagcat tttaggaca 199

Claims

1.检测待测大白菜基因组中与大白菜芜菁花叶病毒病抗性基因retrcs03紧密连锁的分子标记的物质在如下1)-9)中任一种中的应用：

1)、鉴定或辅助鉴定待测大白菜的芜菁花叶病毒抗性；

2)、制备鉴定或辅助鉴定待测大白菜的芜菁花叶病毒抗性的产品；

5)、大白菜育种；

6)、选育大白菜抗芜菁花叶病毒品种；

7)、制备选育大白菜抗芜菁花叶病毒品种产品；

8)、鉴定或辅助鉴定待测大白菜的抗芜菁花叶病毒性状；

9)、制备鉴定或辅助鉴定待测大白菜的抗芜菁花叶病毒性状产品；

所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述检测待测大白菜基因组中与大白菜芜菁花叶病毒病抗性基因retrcs03紧密连锁的分子标记的物质为如下1)或2)：

1)所述物质包括成套引物，所述成套引物由引物1和引物2组成；

2)所述物质包括含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒；

所述引物1为：SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；

所述引物2为：SEQ ID No.3所示的单链DNA分子。

2.一种产品，其特征在于，所述产品为权利要求1所述应用中的所述检测待测大白菜基因组中与大白菜芜菁花叶病毒病抗性基因retrcs03紧密连锁的分子标记的物质。

3.如权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为如下1)-4)中任一种：

1)鉴定或辅助鉴定待测大白菜的芜菁花叶病毒抗性的产品；

3)选育大白菜抗芜菁花叶病毒品种的产品；

4)鉴定或辅助鉴定待测大白菜的抗芜菁花叶病毒性状产品。

4.一种鉴定或辅助鉴定待测大白菜为抗芜菁花叶病毒大白菜或感芜菁花叶病毒大白菜的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用权利要求2或3所述产品对待测大白菜的基因组DNA进行PCR扩增，得扩增产物；检测所述扩增产物。

5.如权利要求4所述的鉴定或辅助鉴定待测大白菜为抗芜菁花叶病毒大白菜或感芜菁花叶病毒大白菜的方法，其特征在于，

若所述扩增产物含有199bp的片段，则将所述待测大白菜候选为感芜菁花叶病毒大白菜。

6.如权利要求4所述的鉴定或辅助鉴定待测大白菜为抗芜菁花叶病毒大白菜或感芜菁花叶病毒大白菜的方法，其特征在于，

若扩增产物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，则将所述待测大白菜候选为抗芜菁花叶病毒大白菜；

若所述扩增产物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，则将所述待测大白菜候选为感芜菁花叶病毒大白菜。

7.一种选育大白菜抗芜菁花叶病毒品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用权利要求2或3所述产品对待测大白菜的基因组DNA进行PCR扩增，得扩增产物；检测所述扩增产物；选择扩增产物含有191bp的片段的大白菜作为亲本进行育种。

8.如权利要求7所述的选育大白菜抗芜菁花叶病毒品种的方法，其特征在于，所述扩增产物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

9.如权利要求7所述的选育大白菜抗芜菁花叶病毒品种的方法，其特征在于，所述待测大白菜为个体或群体。