CN108103239A - 鉴定大白菜芜菁花叶病毒病抗性的snp分子标记a045736268c/t及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了鉴定大白菜芜菁花叶病毒病抗性的SNP分子标记A045736268C/T及其应用。本发明提供了检测待测白菜基因组中A045736268C/T位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定待测白菜的芜菁花叶病毒抗性中的应用；本实验利用DH群体,通过苗期人工摩擦接种TuMV,借助已有的白菜基因组信息进行抗性基因定位和分子标记开发，初步研究表明大白菜TuMV的抗性基因位于A04号染色体上，所开发的与该抗性基因紧密连锁的SNP标记无论在抗病还是感病材料中的选择准确率均为100％，可用于分子标记辅助选择育种。该项研究将为大白菜芜菁花叶病毒病抗性基因的进一步定位克隆及种质资源创新奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及鉴定大白菜芜菁花叶病毒病抗性的SNP分子标记A045736268C/T及其应用。
背景技术
病毒病是大白菜生产中的三大病害之一，整个生育期均可发病，严重影响大白菜的生产，受其危害，我国大白菜平均每年有5％的产量损失。但生产中对病毒病一直没有特效药剂防治，主要以推广抗病品种结合栽培管理进行防治。筛选抗病遗传资源，培育抗病新品种是解决大白菜感病毒病的根本途径，也是目前白菜最重要的育种目标之一。
研究结果表明，芜菁花叶病毒(TuMV)是侵染大白菜的主要病原，当前已经开发了一系列与TuMV的相关的分子标记。闫瑾琦(2000)筛选到2个与大白菜TuMV抗病基因连锁的RAPD标记，高金萍(2008)获得了与抗TuMV基因连锁的两个SCAR标记，Wang等(2011)在小白菜筛选到与TuMV抗病基因连锁的2个AFLP标记，Rusholme等利用RLFP和SSR标记将TuMV抗性基因定位在大白菜A04及A08染色体上，钱伟等(2012)、刘巧云等(2014)分别获得了与大白菜TuMV抗病基因连锁的Indel标记。SNP作为新一代分子标记在大白菜病毒病抗性筛选上鲜为报道。
分子标记是在DNA水平上对目标性状进行选择，具有高效、快速、不受环境影响等优点，可以在幼苗期进行选择，加快育种过程。SNP属于新一代分子标记，是指在染色体基因组水平上单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。与第一二代分子标记不同，SNP具有分布密度高、遗传稳定性好、二等位基因型等特点。不同物种全基因组的序列测定及比较表明，SNP遗传分析或基因诊断时的重现性、准确性及稳定性都优于SSR。
SNP的检测分析技术很多，基于KASP(竞争性等位基因特异性PCR)的SNPline基因分型检测技术是其中的一种，是由英国LGC(Laboratory of the Government Chemist)有限公司开发的高通量SNP分型技术。KASP是竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAllele Specific PCR)的缩写，可在广泛的基因组DNA样品中，对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。其具有准确、灵活、低成本、高通量的特点，目前已经成为国际上SNP分析的主流方法之一。
发明内容
本发明一个目的是提供检测待测白菜基因组中A045736268C/T位点的多态性或基因型的物质的应用。
本发明提供的检测待测白菜基因组中A045736268C/T位点的多态性或基因型的物质在如下1)-9)中任一种中的应用：
1)、鉴定或辅助鉴定待测白菜的芜菁花叶病毒抗性；
2)、制备鉴定或辅助鉴定鉴定或辅助鉴定待测白菜的芜菁花叶病毒抗性的产品；
3)、鉴定或辅助鉴定待测白菜为抗芜菁花叶病毒白菜或感抗芜菁花叶病毒白菜；
4)、制备鉴定或辅助鉴定白菜为抗芜菁花叶病毒白菜或感抗芜菁花叶病毒白菜的产品；
5)、白菜育种；
6)、选育白菜抗芜菁花叶病毒品种；
7)、制备选育白菜抗芜菁花叶病毒品种产品；
8)、鉴定或辅助鉴定待测白菜的抗芜菁花叶病毒性状；
9)、制备鉴定或辅助鉴定待测白菜的抗芜菁花叶病毒性状产品。
上述应用中，
所述A045736268C/T位点为白菜基因组A04染色体第5736268位；所述A045736268C/T位点的基因型为CC、TT或CT。
上述应用中，
所述检测待测白菜基因组中A045736268C/T位点的多态性或基因型的物质为如下1)或2)：
1)所示的物质包括成套引物，所述成套引物由引物1、引物2和引物3组成；
2)所示的物质包括含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒；
所述引物1为如下a1)或a2)：
a1)序列1所示的单链DNA分子；
a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物2为如下b1)或b2)：
b1)序列2所示的单链DNA分子；
b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物3为如下c1)或c2)：
c1)序列3所示的单链DNA分子；
c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
上述应用中，
所述成套引物中的每条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为0.168μM、0.168μM和0.42μM。
本发明第二个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品，为上述检测待测白菜基因组中A045736268C/T位点的多态性或基因型的物质。
上述产品中，所述产品为如下1)-4)中任一种：
1)鉴定或辅助鉴定鉴定或辅助鉴定待测白菜的芜菁花叶病毒抗性的产品；
2)鉴定或辅助鉴定白菜为抗芜菁花叶病毒白菜或感抗芜菁花叶病毒白菜的产品
3)选育白菜抗芜菁花叶病毒品种的产品；
4)鉴定或辅助鉴定待测白菜的抗芜菁花叶病毒性状产品。
本发明第3个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测白菜为抗芜菁花叶病毒白菜或感芜菁花叶病毒白菜的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测白菜基因组中A045736268C/T位点的多态性或基因型，
所述A045736268C/T位点的基因型为CC、TT或CT；
若所述待测白菜基因组A045736268C/T位点的多态性或基因型为CC或CT，则所述待测白菜为或候选为抗芜菁花叶病毒白菜；
若所述待测白菜基因组A045736268C/T位点的多态性或基因型为TT，则所述待测白菜为或候选为感芜菁花叶病毒白菜。
本发明第4个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测白菜的抗芜菁花叶病毒性状的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测白菜基因组中A045736268C/T位点的多态性或基因型，所述A045736268C/T位点的基因型为CC、TT或CT；
基因组A045736268C/T位点的多态性或基因型为CC或CT的待测白菜的对芜菁花叶病毒抗性高于基因组A045736268C/T位点的多态性或基因型为TT的待测白菜。
上述方法中，
所述检测待测白菜基因组中A045736268C/T位点的多态性或基因型的方法包括如下1)或2)：
1)直接测序；
2)用上述检测待测白菜基因组中A045736268C/T位点的多态性或基因型的物质对待测白菜进行等位基因特异性PCR；
或，所述A045736268C/T位点的基因型为CC、TT或CT。
本发明第5个目的是提供一种选育白菜抗芜菁花叶病毒品种的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：先检测待测白菜基因组A045736268C/T位点的多态性或基因型，再选择基因组A045736268C/T位点的多态性或基因型为CC或CT的待测白菜作为亲本进行育种。
所述待测白菜为个体或群体。
病情指数(检测方法见李巧云等，大白菜芜菁花叶病毒病抗性遗传分析，《华北农学报》,2012,27(4):135-139)0-33.33(包含33.33)为抗芜菁花叶病毒病材料，33.33-100(不等于33.33)为感芜菁花叶病毒病材料。
本实验利用DH群体,通过苗期人工摩擦接种TuMV,借助已有的白菜基因组信息进行抗性基因定位和分子标记开发，初步研究表明大白菜TuMV的抗性基因位于A04号染色体上，所开发的与该抗性基因紧密连锁的SNP标记无论在抗病还是感病材料中的选择准确率均在98％以上，可用于分子标记辅助选择育种。该项研究将为大白菜芜菁花叶病毒病抗性基因的进一步定位克隆及种质资源创新奠定基础。
附图说明
图1为利用A045736268C/T标记对260个白菜样品(包括双亲及DH后代)进行基因分型。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、SNP分子标记的获得
通过对高感芜菁花叶病毒病株系T12-19、高抗芜菁花叶病毒病株系91-112的基因组重测序数据分析发现(实施例中的父本91-112为连续自交9代的大白菜高代自交系，高抗TuMV-C4；母本T12-19是双单倍体株系，高感TuMV-C4。父本91-112和母本T12-19均在文献“Genetic mapping and localization of a major QTL for seedling resistance todowny mildew in Chinese cabbage(Brassica rapa ssp.pekinensis，Mol Breeding(2009)23:573–590”中公开过，公众可从北京农林科学院蔬菜研究中心获得。)，在A04染色体第5736268位碱基有一个C/T突变的SNP位点，该SNP位点命名为A045736268C/T位点，可以作为SNP分子标记，也为如下序列4第103位。
ggtgcactcattgacctttgtacattagatgaaagtcctgtgttccatggctgtaacaaaataaaaatccgatcatatcattcccgaagcagaaccttcgttC/taattctttcaaaaaccatgcagtgaagtgcccacctgttcatttgattgtccatttggaggtggtgcaaagatttgtgacgtggaatgaccaagatgc(序列4)
A045736268C/T位点的基因型为CC、TT和C/T；
根据A045736268C/T位点，设计如下可用于KASP技术的与目的基因紧密连琐的特异引物作为分子标记：上游引物A045736268-FF、上游引物A045736268-FV和下游引物A045736268-R。
上述A045736268-FF、上游引物A045736268-FV和下游引物A045736268-R委托英国LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化学家实验室)有限公司获得。
A045736268-FF、A045736268-FV和A045736268-R引物序列特征如下：
上游引物A045736268-FF：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCCGAAGCAGAACCTTCGTTC(序列1)；
上游引物A045736268-FV：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTCCCGAAGCAGAACCTTCGTTT(序列2)；
下游引物A045736268-R：
GCACTGAATCAGAGAACGGGATTACT(序列3)。
实施例2、分子标记A045736268C/T位点在鉴定感芜菁花叶病毒病和抗芜菁花叶病毒病材料中的应用
1、分子标记鉴定感芜菁花叶病毒病材料和抗芜菁花叶病毒病材料
1)DNA提取
实施例中的父本91-112为连续自交9代的大白菜高代自交系，高抗TuMV-C4；母本T12-19是双单倍体株系，高感TuMV-C4。父本91-112和母本T12-19均在文献“Geneticmapping and localization of a major QTL for seedling resistance to downymildew in Chinese cabbage(Brassica rapa ssp.pekinensis，Mol Breeding(2009)23:573–590”中公开过，公众可从北京农林科学院蔬菜研究中心获得。
本发明所用群体是用这两个亲本构建的DH群体后代。
常规CTAB法分别提取表1中258个DH群体后代的基因组DNA。
用琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测所提取DNA的质量，发现提取的基因组DNA均达到了相关的质量要求，即琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)；用于竞争性等位基因特异性PCR技术检测的DNA用量为4-10ng/每样品。稀释DNA浓度成为10ng/μl备用，得到待测DNA。
2)基于竞争性等位基因特异性PCR
按照英国LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化学家实验室)有限公司提供的标准实验流程，即基于竞争性等位基因特异性PCR技术的实验流程进行实验，以下试剂除特殊说明为均为LGC公司提供的配套试剂，试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照LGC公司的操作指南GenetypingAssay，Manual Part#15004070Rev.B进行。KASPar反应在384微孔板或1536微孔板(Cat.No.04729749001,Roche)中进行，反应体系为3ul或1ul。
具体步骤为：首先利用K-pette分液工作站在微孔板中加入待测DNA模板(4ng/μl)1.5ul，60℃烘干。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站向每个反应孔中加入1×Mastermix(KBS-1016-002或Cat.No.KBS-1016-011，Laboratory of the GovernmentChemist)与引物预混液(实施例1的两条上游引物和下游引物按照摩尔浓度比12:12:30混合，上游引物A045736268-FF、上游引物A045736268-FV和下游引物A045736268-R的反应终浓度分别是0.168um、0.168um和0.42um)，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为94℃预变性，15分钟；94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸：以touch down程序扩增10个循环，每循环降低0.6℃)；94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则继续扩增，每3个循环查看分型情况，直至分型完全。
分子标记检测结果如图1和表1所示，结果显示分型效果良好。
因此，可以用A045736268C/T位点的核苷酸的基因型，判断白菜是否抗芜菁花叶病毒病，具体如下：
检测待测白菜A045736268C/T位点的基因型，
若待测白菜A045736268C/T位点的基因型为TT纯合，则待测白菜为或候选为感芜菁花叶病毒病；
若待测白菜A045736268C/T位点的基因型为CC纯合，则待测白菜为或候选为抗芜菁花叶病毒病；
若待测白菜A045736268C/T位点的基因型为C/T杂合，则待测白菜为或候选为抗芜菁花叶病毒病。
由于是DH群体，基本不存在杂合后代情况。
2、病情指数检测感芜菁花叶病毒病材料和抗芜菁花叶病毒病材料
下述实施例中的0.05M(PH＝7.0)磷酸缓冲液配制方法：分别量取61.0mL的0.2mol/L Na2HPO4母液和39.0mL的0.2mol/L NaH2PO4母液，混匀后定容至200mL，即为0.05M(PH＝7.0)磷酸缓冲液。其中，0.2mol/L Na2HPO4母液的制备方法：Na2HPO4·2H2O35.61g、Na2HPO4·7H2O 53.65g或Na2HPO4·12H2O 71.64g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL；0.2mol/LNaH2PO4母液的制备方法：NaH2PO4·H2O 27.6g或NaH2PO4·2H2O 31.2g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。
下述实施例中的病毒病TuMV小种在文献“李巧云等，大白菜芜菁花叶病毒病抗性遗传分析，《华北农学报》,2012,27(4):135-139”中公开过，公众可从北京农林科学院蔬菜研究中心获得。
抗病鉴定及病害分级标准如下：
0级：无发病症状；
1级：接种叶片有褪绿斑，少数叶片表现花叶；
3级：多数叶片或整株出现花叶；
5级：整株呈现花叶，少数叶片皱缩畸形，叶柄坏死；
7级：部分叶片坏死、畸形或植株矮小；
9级：大部分叶片枯萎，整株坏死。
具体计算公式如下：
病情指数0-33.33(包含33.33)为抗芜菁花叶病毒病材料，33.33-100为感芜菁花叶病毒病材料。
将表1所示的258个白菜接种TuMV小种，检测芜菁花叶病毒病情指数(方法见上述)，检测结果如表1所示。
分析表1中的病情指数检测结果和分子标记鉴定结果如下：
在119份病情指数检测为抗芜菁花叶病毒材料中，分子标记A045736268C/T位点鉴定显示有118份材料为CC纯合，即为抗芜菁花叶病毒材料，本发明方法的鉴定准确度为99.2％；
在139份病情指数检测为感芜菁花叶病毒病材料中，分子标记A045736268C/T位点鉴定显示有137份材料为TT纯合，即为感芜菁花叶病毒材料，本发明方法的鉴定准确度为98.6％。
因此，可以看出，本发明的方法和分子标记可以用来检测待测白菜的抗感芜菁花叶病毒病状态。
表1为258份材料在A045736268C/T位点的基因分型及病情指数统计表
表注：所有材料为DH纯合自交系
由此可以看出，本发明的方法和分子标记可以用来检测待测白菜的感、抗病状态。
序列表
<110>北京市农林科学院；京研益农（北京）种业科技有限公司
<120>鉴定大白菜芜菁花叶病毒病抗性的SNP分子标记A045736268 C/T及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 1
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tcccgaagca gaaccttcgt tc 42
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 2
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tttcccgaag cagaaccttc gttt 44
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 3
<400> 3
gcactgaatc agagaacggg attact 26
<210>4
<211> 201
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> （103）
<223> n=t或c
<400> 4
ggtgcactca ttgacctttg tacattagat gaaagtcctg tgttccatgg ctgtaacaaa 60
ataaaaatcc gatcatatca ttcccgaagc agaaccttcg ttnaattctt tcaaaaacca 120
tgcagtgaag tgcccacctg ttcatttgat tgtccatttg gaggtggtgc aaagatttgt 180
gacgtggaat gaccaagatg c 201
Claims (10)
1.检测待测白菜基因组中A045736268C/T位点的多态性或基因型的物质在如下1)-9)中任一种中的应用：
1)、鉴定或辅助鉴定待测白菜的芜菁花叶病毒抗性；
2)、制备鉴定或辅助鉴定鉴定或辅助鉴定待测白菜的芜菁花叶病毒抗性的产品；
3)、鉴定或辅助鉴定待测白菜为抗芜菁花叶病毒白菜或感抗芜菁花叶病毒白菜；
4)、制备鉴定或辅助鉴定白菜为抗芜菁花叶病毒白菜或感抗芜菁花叶病毒白菜的产品；
5)、白菜育种；
6)、选育白菜抗芜菁花叶病毒品种；
7)、制备选育白菜抗芜菁花叶病毒品种产品；
8)、鉴定或辅助鉴定待测白菜的抗芜菁花叶病毒性状；
9)、制备鉴定或辅助鉴定待测白菜的抗芜菁花叶病毒性状产品。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述A045736268C/T位点为白菜基因组A04染色体第5736268位；所述A045736268C/T位点的基因型为CC、TT或CT。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述检测待测白菜基因组中A045736268C/T位点的多态性或基因型的物质为如下1)或2)：
1)所示的物质包括成套引物，所述成套引物由引物1、引物2和引物3组成；
2)所示的物质包括含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒；
所述引物1为如下a1)或a2)：
a1)序列1所示的单链DNA分子；
a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物2为如下b1)或b2)：
b1)序列2所示的单链DNA分子；
b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物3为如下c1)或c2)：
c1)序列3所示的单链DNA分子；
c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述成套引物中的每条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为0.168μM、0.168μM和0.42μM。
5.一种产品，为权利要求1-4任一所述应用中的所述检测待测白菜基因组中A045736268C/T位点的多态性或基因型的物质。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：
所述产品为如下1)-4)中任一种：
1)鉴定或辅助鉴定鉴定或辅助鉴定待测白菜的芜菁花叶病毒抗性的产品；
2)鉴定或辅助鉴定白菜为抗芜菁花叶病毒白菜或感抗芜菁花叶病毒白菜的产品
3)选育白菜抗芜菁花叶病毒品种的产品；
4)鉴定或辅助鉴定待测白菜的抗芜菁花叶病毒性状产品。
7.一种鉴定或辅助鉴定待测白菜为抗芜菁花叶病毒白菜或感芜菁花叶病毒白菜的方法，包括如下步骤：检测待测白菜基因组中A045736268C/T位点的多态性或基因型，
所述A045736268C/T位点的基因型为CC、TT或CT；
若所述待测白菜基因组A045736268C/T位点的多态性或基因型为CC或CT，则所述待测白菜为或候选为抗芜菁花叶病毒白菜；
若所述待测白菜基因组A045736268C/T位点的多态性或基因型为TT，则所述待测白菜为或候选为感芜菁花叶病毒白菜。
8.一种鉴定或辅助鉴定待测白菜的抗芜菁花叶病毒性状的方法，包括如下步骤：检测待测白菜基因组中A045736268C/T位点的多态性或基因型，所述A045736268C/T位点的基因型为CC、TT或CT；
基因组A045736268C/T位点的多态性或基因型为CC或CT的待测白菜的对芜菁花叶病毒抗性高于基因组A045736268C/T位点的多态性或基因型为TT的待测白菜。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：
所述检测待测白菜基因组中A045736268C/T位点的多态性或基因型的方法包括如下1)或2)：
1)直接测序；
2)用权利要求1-3任一中的所述检测待测白菜基因组中A045736268C/T位点的多态性或基因型的物质对待测白菜进行等位基因特异性PCR；
或，所述A045736268C/T位点的基因型为CC、TT或CT。
10.一种选育白菜抗芜菁花叶病毒品种的方法，包括如下步骤：先检测待测白菜基因组A045736268C/T位点的多态性或基因型，再选择基因组A045736268C/T位点的多态性或基因型为CC或CT的待测白菜作为亲本进行育种。
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