CN106591457B

CN106591457B - 一种鉴定位于白菜a03染色体上的根肿病抗性qtl的snp分子标记开发及其应用

Info

Publication number: CN106591457B
Application number: CN201611203604.1A
Authority: CN
Inventors: 苏同兵; 汪维红; 于拴仓; 张凤兰; 余阳俊; 张德双; 赵岫云
Original assignee: Jingyan Yinong Beijing Seed Sci Tech Co ltd; Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Jingyan Yinong Beijing Seed Sci Tech Co ltd; Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2016-12-23
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2036-12-23
Also published as: CN106591457A

Abstract

本发明公开了一种鉴定位于白菜A03染色体上的根肿病抗性QTL的SNP分子标记开发及其应用。本发明提供了A03T/A位点在如下A‑F任一中的应用：A、鉴定或辅助鉴定白菜根肿病抗性；B、制备鉴定或辅助鉴定白菜根肿病抗性的产品；C、鉴定或辅助鉴定白菜为抗根肿病白菜或感根肿病白菜；D、制备鉴定或辅助鉴定白菜为抗根肿病白菜或感根肿病白菜的产品；E、白菜育种；F、选育抗根肿病白菜品种。本发明的实验证明了，本发明所提供的SNP位点及其特异引物可以对白菜根肿病抗性良好分型，具有良好的应用价值，可实现对抗根肿病遗传材料的的预先选择和辅助育种。

Description

一种鉴定位于白菜A03染色体上的根肿病抗性QTL的SNP分子标记开发及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定位于白菜A03染色体上的根肿病抗性QTL的SNP分子标记开发及其应用。

背景技术

根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron)寄生而引起的一种土传病害，在世界范围内危害程度大且危害面积大。由于根肿菌是专性寄生在十字花科作物上，因此极大地威胁着十字花科作物的生产。大白菜栽培周期长，抗病品种少，因此与其他蔬菜如小白菜、日本芜菁、生菜等相比也极易受到根肿病的危害。根肿病目前在世界很多国家都发生已久且普遍严重，我国大白菜栽培面积大，遭受根肿病危害的程度也随之较大。因此选育抗根肿病的大白菜优良品种是当前最亟待解决的问题。在选育抗性品种过程中，开发与大白菜根肿病抗性基因紧密连锁的分子标记起着至关重要的作用。

我国自1955年首次发现根肿病以来，现已扩散至全国各地。云南、辽宁、黑龙江、吉林和山东等省市大白菜主产区俨然已成为最为严重的病害之一。丁云花等利用Williams鉴别系统，对采集自我国8个省市的l8份根肿病菌进行了生理小种鉴定。结果表明：云南魏山、盘龙、玉溪、重庆武隆、湖北长阳、山东青岛、陕西太白、四川郫县、彭州、什邡、上海嘉定、辽宁大连等地的16份根肿病菌均为4号生理小种。四川甘孜的根肿病菌为7号生理小种。云南通海的根肿病菌为2号生理小种。刘峰等利用Williams系统对云南和西藏地区的根肿病病原菌进行鉴定，云南得到9个生理小种，分别为l、2、4、6、7、10、11、12和13，在西藏自治区样品中鉴定出2、4、5和7这4个生理小种，但是是以4号生理小种为主。说明目前我国的十字花科蔬菜根肿病菌是以4号生理小种为主。

随着分子标记的发展，一些根肿病抗性位点陆续被鉴定出来。最早关于抗性基因的定位是Kuginuki等人，定位的就是现在被熟知的Crrl。Matsumoto等发现了两个RFLP标记与CRa连锁，并将CRa定位在A03染色体上。Suwabe等利用SSR标记，发现了Crrl和Crr2两个CR位点，并认为这两个位点在功能上是互补的。Piao等利用共显性标记TCR-05将CRb基因定位在A03染色体上。Hirai等发现了又一个CR位点Crr-3。Sakamoto等发现了两个CR位点，CRk和CRc，并明确了其在染色体上的定位，CRc与之前发现的QTL都相对独立，位于染色体A02上。在这8个位点中，Crrl、Crr2和Crr4这三个位点被分别定位于大白菜连锁群A08、A01和A06，CRc定位于A02连锁群，CRa、Crrb、Crrk和Crr3都被定位到A03连锁群。

SNP属于新一代分子标记，具有丰度高、检测易实现自动化等特点。SNP在基因组上的分布极其丰富，其突变率低，尤其处于编码区的SNP是高度稳定的，其遗传稳定性要比SSR等遗传标记高得多，遗传分析或基因诊断时的重现性、准确性都优于SSR。基于KASP(竞争性等位基因特异性PCR)的SNPline基因分型检测是英国LGC(LaboratoryoftheGovernmentChemist)有限公司开发的高通量SNP分型技术，其具有准确、灵活、低成本和高通量的特点。该方案的核心是KASP技术，即CompetitiveAllele-Specific PCR。这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels(Insertions and Deletions，插入和缺失)，目前已经成为国际上SNP分析的主流方法之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定待测白菜的根肿病抗性。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了检测白菜基因组中A03T/A位点的多态性或基因型的物质的新用途。

本发明提供了检测白菜基因组中A03T/A位点的多态性或基因型的物质在如下A-F中任一种中的应用：

A、鉴定或辅助鉴定白菜根肿病抗性；

B、制备鉴定或辅助鉴定白菜根肿病抗性的产品；

C、鉴定或辅助鉴定白菜为抗根肿病白菜或感根肿病白菜；

D、制备鉴定或辅助鉴定白菜为抗根肿病白菜或感根肿病白菜的产品；

E、白菜育种；

F、选育白菜根肿病抗病品种。

上述应用中，所述检测白菜基因组中A03T/A位点的多态性或基因型的物质包括由引物1、引物2和引物3所组成的引物组；

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)序列1所示的单链DNA分子；

a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)序列2所示的单链DNA分子；

b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物3为如下c1)或c2)：

c1)序列3所示的单链DNA分子；

c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。

上述一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变为所述单链DNA分子3’末端碱基之外一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变。

为了解决上述技术问题，本发明又提供了一种鉴定或辅助鉴定待测白菜为抗根肿病白菜或感根肿病白菜的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测白菜为抗根肿病白菜或感根肿病白菜的方法包括如下步骤：检测待测白菜基因组A03T/A位点的多态性或基因型为AA、TT或TA，

若所述待测白菜基因组A03T/A位点的多态性或基因型为AA或TA，则所述待测白菜为或候选为抗根肿病白菜；

若所述待测白菜基因组A03T/A位点的多态性或基因型为TT，则所述待测白菜为或候选为感根肿病白菜。

上述方法中，发病级别为0级或1级的白菜为抗根肿病白菜；发病级别为3级、5级、7级或9级的白菜为感根肿病白菜。病情分级标准如下：0级：无病；1级：侧根上有结节状的小根瘤，发病根占根系全部的1％-10％；3级：侧根上有根瘤附着，侧根发病根量占10％以上；5级：主根根瘤较小，侧根发病根量占根系的50％以上；7级：主根根瘤较大，侧根发病根量占根系的80％以上，9级：主根根瘤大，呈纺锤形。

上述方法中，所述检测待测白菜基因组A03T/A位点的多态性或基因型的方法为如下(1)或(2)：

(1)直接测序；

(2)用引物对待测白菜进行等位基因特异性PCR；

所述引物由引物1、引物2和引物3组成；

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)序列1所示的单链DNA分子；

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)序列2所示的单链DNA分子；

所述引物3为如下c1)或c2)：

c1)序列3所示的单链DNA分子；

为了解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定待测白菜根肿病抗性的引物组。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测白菜根肿病抗性的引物组由引物1、引物2和引物3组成；

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)序列1所示的单链DNA分子；

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)序列2所示的单链DNA分子；

所述引物3为如下c1)或c2)：

c1)序列3所示的单链DNA分子；

上述引物组中，所述引物1、所述引物2和所述引物3的摩尔比为12∶12∶30。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定待测白菜根肿病抗性的PCR试剂。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测白菜根肿病抗性的PCR试剂为含有上述引物组的PCR试剂；所述引物组中的每条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为10μM。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定待测白菜根肿病抗性的试剂盒。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测白菜根肿病抗性的试剂盒含有上述引物组或上述PCR试剂。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了白菜的育种方法。

本发明提供的白菜的育种方法包括检测待测白菜基因组A03T/A位点的多态性或基因型，选择基因组A03T/A位点的多态性或基因型为AA或TA的待测白菜作为亲本进行育种。

上述方法或上述应用中，所述A03T/A位点位于A03染色体上第24352728位，其脱氧核苷酸为T或A。在本申请中，该位点为序列表序列4中的第301位核苷酸。

上述方法中，所述TT是A03T/A位点为T的纯合型，所述AA是A03T/A位点为A的纯合型，所述TA是A03T/A位点为T和A的杂合型。

上述方法或上述应用或上述引物组中，所述根肿病为根肿病4号生理小种。

本发明通过对高感根肿病大白菜株系15944(CR-为民)、高抗根肿病大白菜株系15593(北京新三号)的部分抗病基因测序数据分析发现，在根肿病抗感亲本之间存在Indel；进一步，将该Indel转换成一个可利用LGC KASP系统分型的SNP分子标记，此标记与根肿病抗性紧密连锁。通过BC1F1群体验证发现：利用本发明所提供的SNP位点与其对应的引物对白菜根肿病抗性的鉴定结果与利用常规检测方法的鉴定结果完全一致，此标记鉴定的准确率高达100％，完全可用于大白菜抗根肿病分子标记辅助育种，对白菜根肿病抗性进行鉴定，也可用于选育白菜根肿病抗病品种。本发明获得的分子标记为共显性，在实际应用中成本低、通量高、特异性高，且鉴定结果准确可靠、省时省力、降低了劳动成本，不仅对加快大白菜抗根肿病育种进程起到重要作用，也为加速白菜抗根肿病育种提供了高效的辅助育种方法和技术。

附图说明

图1为A03T/A位点在78份BC1F1自交型材料中的基因分型鉴定图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的大白菜“15593”(CR-为民)是昆明市坤华种子公司的产品，公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的大白菜“15944”(北京新三号)是京研益农(北京)种业科技有限公司的产品，公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、分子标记的获得

为了更好更快地筛选获得抗根肿病资源，促进分子标记辅助选择育种实践的进行,通过对高感根肿病大白菜株系15944、高抗根肿病大白菜株系15593的部分抗病基因测序数据分析发现，在A03染色体的第24352728位碱基有一个Indel位点，将Indel位点命名为A03T/A位点。

进一步根据A03T/A位点转化成如下可用于KASP技术的特异引物作为分子标记：上游引物A03-24352728-FF、上游引物A03-24352728-FV和下游引物A03-24352728-R。

上述-FF、-FV和-R引物委托英国LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化学家实验室)有限公司获得。-FF、-FV和-R引物序列特征如下：

上游引物A03-24352728-FF：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCCGTCTCCAACAACTTTGAAa(序列1)；

上游引物A03-24352728-FV：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCGTCTCCAACAACTTTGAAt(序列2)；

下游引物A03-24352728-R：

TTCTTTTGCAGGGTAGTCGAAATGTTAT(序列3)。

上述上游引物最后一位碱基t/a对应A03染色体上第24352728位的SNP位点(A03T/A位点)，即序列表序列4中第301位核苷酸。

实施例2、A03T/A位点的分子标记在鉴定感根肿病和抗根肿病材料中的应用

1、分子标记鉴定感根肿病和抗根肿病材料

1)DNA提取

常规CTAB法分别提取表1中78种待测白菜材料的基因组DNA。表1中的78种待测白菜材料是利用亲本15944和15593杂交获得F1代后，继续与感病亲本回交获得BC1F1群体。

用琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测所提取DNA的质量，发现提取的基因组DNA均达到了相关的质量要求，即琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)；用于竞争性等位基因特异性PCR技术检测的DNA用量为4～10ng/每样品。稀释DNA浓度成为10ng/μl备用，得到待测DNA。

2)基于竞争性等位基因特异性PCR

按照英国LGC(LaboratoryoftheGovernmentChemist政府化学家实验室)有限公司提供的标准实验流程，即基于竞争性等位基因特异性PCR技术的实验流程进行实验，以下试剂除特殊说明为均为LGC公司提供的配套试剂，试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照LGC公司的操作指南GenetypingAssay，ManualPart#15004070Rev.B进行。KASPar反应在384微孔板或1536微孔板(Cat.No.04729749001,Roche)中进行，反应体系为3ul或1ul。

具体步骤为：首先利用K-pette分液工作站在微孔板中加入上述各个白菜的待测DNA模板(4ng/μl)1.5μl，60℃烘干。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站向每个反应孔中加入1×Mastermix(KBS-1016-002或Cat.No.KBS-1016-011，LaboratoryoftheGovernmentChemist)与引物预混液(实施例1的两条上游引物和下游引物按照摩尔浓度比12:12:30混合，各引物终浓度均为10μM)，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为94℃预变性，15分钟；94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸：以touchdown程序扩增10个循环，每循环降低0.6℃)；94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。扩增结束后，利用BMGPHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则继续扩增，每3个循环查看分型情况，直至分型完全。

结果如图1和表1所示，结果显示分型效果良好，引物组(A03-24352728-FF、A03-24352728-FV和A03-24352728-R)能特异区分该位点为纯合TT或纯合AA或杂合T/A的材料。

若待测白菜A03T/A位点的核苷酸为TT纯合，则待测白菜为感根肿病白菜；

若待测白菜A03T/A位点的核苷酸为AA纯合或T/A杂合，则待测白菜为抗根肿病白菜。

2、白菜抗、感根肿病检测

将表1中的感病亲本P1(高感根肿病大白菜株系15944)，抗病亲本P2(高抗根肿病大白菜株系15593)、F1(亲本15944和15593杂交获得F1代)和78份白菜BC1F1单株播种并接种根肿病4号生理小种(湖北长阳病原菌)，发病后调查病情，接种和调查方法可参照如下文献中记载：汪维红等，湖北省长阳县十字花科蔬菜根肿病菌生理小种鉴定及抗源筛选，中国蔬菜，2013。

病情分级标准:0级：无病；1级：侧根上有结节状的小根瘤，发病根占根系全部的1％-10％；3级：侧根上有根瘤附着，侧根发病根量占10％以上；5级：主根根瘤较小，侧根发病根量占根系的50％以上；7级：主根根瘤较大，侧根发病根量占根系的80％以上，9级：主根根瘤大，呈纺锤形。

发病级别为0级或1级定义为抗根肿病，且白菜为抗根肿病白菜，发病级别为3级、5级、7级或9级定义为感根肿病，且白菜为感根肿病白菜。

结果如表1所示，在43份病情检测为抗根肿病单株中，分子标记鉴定A03T/A位点全部为T/A杂合，经过实验室人工接种验证，该43个单株全部为抗根肿病，本发明方法的鉴定准确度为100％；

在35份病情检测为感根肿病材料中，分子标记鉴定A03T/A位点全部为TT纯合，经过实验室人工接种验证，35个单株全部为感根肿病，本发明方法的鉴定准确度为100％。

表1为78份BC1F1群体及亲本材料在A03T/A位点的基因分型及发病级别统计表

表注：所有材料为BC1F1单株,其中P1为感病亲本，P2为抗病亲本,各2次重复；b表示抗根肿病，a表示感根肿病。

由此可以看出，本发明的方法和分子标记可以用来检测待测白菜的感、抗根肿病状态。

序列表

<110>北京市农林科学院京研益农(北京)种业科技有限公司

<120>一种鉴定位于白菜A03染色体上的根肿病抗性QTL的SNP分子标记开发及其应用

<160>4

<210>1

<211>43bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gaaggtgacc aagttcatgc tcccgtctcc aacaactttg aaa 43

<210>2

<211>43bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gaaggtcgga gtcaacggat tcccgtctcc aacaactttg aat 43

<210>3

<211>28bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ttcttttgca gggtagtcga aatgttat 28

<210>4

<211>594bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

aagtaataca aagtacaaat attattttta cttactttat ttccttccca caatttctca 60

aggaagttgc ttttagtcaa gactatttcc accaggaact ccggattaaa attagaaggc 120

aggcatgtca tcggaaaaga atcccaatcc aaaattctta gatttgaggg cagacatgtc 180

acgggatcta tgctgtgagg atatggctta ctgtgatatt tcactcttaa gaattggaca 240

ttgggcattc ttttaaaaac tctgtcactt atcttcaacc ccgtctccaa caactttgaa 300

tggtccaaac tatgcctata acatttcgac taccctgcaa aagaacccaa agatacataa 360

acaaatatga tttttttcta aaattttgta gggagaaatg cagtgaacga ctaatgtgac 420

aacttactag tgtaccatca cgtagtactt ggcatatatc tccagcatca accaaaaact 480

ggcgctgccc aggttcatga atggattttt tacgaacaat ttctctaccc aaaagtgcta 540

gcaaatcatg catctgtata cgtccccact cgaagtatat gaaagatttc tcag 594

Claims

1.检测大白菜基因组中A03T/A位点的多态性或基因型的物质在如下A-E中任一种中的应用：

A、鉴定或辅助鉴定大白菜根肿病抗性；

B、制备鉴定或辅助鉴定大白菜根肿病抗性的产品；

C、鉴定或辅助鉴定大白菜为抗根肿病大白菜或感根肿病大白菜；

D、制备鉴定或辅助鉴定大白菜为抗根肿病大白菜或感根肿病大白菜的产品；

E、选育大白菜根肿病抗病品种；

所述A03T/A位点为序列表中序列4中第301位核苷酸。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测大白菜基因组中A03T/A位点的多态性或基因型的物质包括由引物1、引物2和引物3所组成的引物组；

所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；

所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；

所述引物3为序列3所示的单链DNA分子。

3.一种鉴定或辅助鉴定待测大白菜为抗根肿病大或感根肿病大白菜的方法，包括如下步骤：检测待测大白菜基因组A03T/A位点的多态性或基因型为AA、TT或TA，

若所述待测大白菜基因组A03T/A位点的多态性或基因型为AA或TA，则所述待测大白菜为或候选为抗根肿病大白菜；

若所述待测大白菜基因组A03T/A位点的多态性或基因型为TT，则所述待测大白菜为或候选为感根肿病大白菜；

所述A03T/A位点为序列表中序列4中第301位核苷酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述检测待测大白菜基因组A03T/A位点的多态性或基因型的方法为如下（1）或（2）：

（1）直接测序；

（2）用引物对待测大白菜进行等位基因特异性PCR；

所述引物由引物1、引物2和引物3组成；

所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；

所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；

所述引物3为序列3所示的单链DNA分子。

5.鉴定或辅助鉴定待测大白菜根肿病抗性的引物组，由引物1、引物2和引物3组成；

所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；

所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；

所述引物3为序列3所示的单链DNA分子。

6.鉴定或辅助鉴定待测大白菜根肿病抗性的PCR试剂，为含有权利要求5所述的引物组的PCR试剂；

所述引物组中的每条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为10μM。

7.鉴定或辅助鉴定待测大白菜根肿病抗性的试剂盒，为含有权利要求5所述的引物组或权利要求6所述的PCR试剂。

8.大白菜的育种方法，包括检测待测大白菜基因组A03T/A位点的多态性或基因型，选择基因组A03T/A位点的多态性或基因型为AA或TA的待测大白菜作为亲本进行育种；

所述A03T/A位点为序列表中序列4中第301位核苷酸。