CN103361340B - 海湾扇贝耐热相关热休克蛋白70基因标记及其辅助育种方法 - Google Patents

海湾扇贝耐热相关热休克蛋白70基因标记及其辅助育种方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于水产生物技术领域，具体的说是一种海湾扇贝耐热相关热休克蛋白70基因标记及其辅助育种方法。海湾扇贝耐热相关热休克蛋白70基因标记为序列表SEQ ID No.1碱基序列所示，起始密码子上游第83个碱基A、第408个碱基T、第480个碱基A、第967个碱基G、第999个碱基C、第1107个碱基T、第1108个碱基A和第1248个碱基A为抗热基因位点。本发明首次筛选了海湾扇贝热休克蛋白70基因启动子区的多态性位点并发掘了耐热相关基因标记，建立了耐热基因标记辅助育种方法。本发明具有针对性强、选育效率高、操作简便快捷等特点，适用于贝类耐热相关标记的筛选和耐热优良品种的选育。

Description

海湾扇贝耐热相关热休克蛋白70基因标记及其辅助育种方法
技术领域
本发明属于水产生物技术领域，具体的说是一种海湾扇贝耐热相关热休克蛋白70基因标记及其辅助育种方法。
背景技术
生物体受到热激胁迫(高于正常生长温度5℃以上的温度)时，能迅速诱导热激蛋白的合成，它最早是Ritossa于1962年在果蝇中首先发现的。而且除温度外，许多损伤因素、应激刺激(如缺氧、重金属离子、病毒感染、自由基等)都可以诱导热激反应，合成的HSPs在细胞稳态的重建中起重要作用。
热休克蛋白70(HSP70)家族是热激蛋白超家族的重要成员，分子量约为68KD-74KD。热激蛋白70除了具有分子伴侣的功能以外，在消除重金属污染对机体造成的损伤，调节受体数量，调理细胞凋亡，促进抗原提呈，参与机体的免疫反应等方面都具有重要的作用。鉴于HSP70基因对生物机体耐热性所起的重要作用，在农业动物的抗逆性育种中，该基因有望成为改善应激敏感性的候选基因，这方面过去已有一些研究报道。近年来，我国浅海贝类养殖有了长足的发展，但随着气候变暖，夏季高温成为制约水产养殖业发展的主要环境因素。作为对适应和抵抗热应激有重要作用的HSP70基因，在不同的地方品种中可能存在差异，因此充分利用我国丰富的水产动物基因库资源，从中寻找扇贝HSP70基因的多态性，并研究多态位点在不同群体中的分布特征，将为研究和利用HSP70基因作为潜在的耐热性标记辅助选择的候选基因奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种海湾扇贝耐热相关热休克蛋白70基因标记及其辅助育种方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种海湾扇贝耐热相关热休克蛋白70基因标记，海湾扇贝耐热相关热休克蛋白70基因标记为序列表SEQ ID No.1碱基序列所示，起始密码子上游第83个碱基A、第408个碱基T、第480个碱基A、第967个碱基G、第999个碱基C、第1107个碱基T、第1108个碱基A和第1248个碱基A为抗热基因位点。
所述海湾扇贝耐热相关热休克蛋白70基因标记的获得，按如下步骤：
1)海湾扇贝热休克蛋白70基因启动子区的多态性分析：从海湾扇贝闭壳肌中提取基因组DNA作为基因扩增模板，采用AiHSP70pF和AiHSP70pR引物对热休克蛋白70基因启动子区进行扩增得到DNA序列，将克隆得到的DNA序列连入T载体，而后对克隆体进行测序，其多态性位点，分别是-1248A/G，-1108C/A，-1107A/T，-999A/C，-967G/C，-894A/T，-480A/C，-408A/T，-204C/G，-83A/G和-28A/G；引物AiHSP70pF为5′-aaaaccataacggcttgccatactaacc-3′，AiHSP70pR为5′-caggacaaccccaagttatgtggcat-3′；
2)耐热相关热休克蛋白70基因标记的筛选：随机提取50个热敏感个体和50个耐热个体的基因组DNA后，PCR扩增热休克蛋白70启动子区序列，将扩增产物纯化后进行测序分析，所述11处多态性位点中，其中7处检测到3种基因型，分别是-1248A/G，-1108C/A，-1107A/T，-999A/C，-967G/C，-894A/T和-408A/T；另外4处检测到2种基因型，分别是-480A/C，-204C/G，-83A/G和-28A/G；经Chi-square Test分析，-1248A/A，-1108A/A，-1107T/T，-999C/C，-967G/G，-480A/A，-408T/T和-83A/G个体在耐热群体中出现的频率显著高于热敏感群体，即-1248A/A，-1108A/A，-1107T/T，-999C/C，-967G/G，-480A/A，-408T/T和-83A/G作为耐热相关的热休克蛋白70基因标记。
海湾扇贝耐热相关热休克蛋白70基因标记辅助育种方法：以在耐热群体中高频出现的热休克蛋白70基因型作为耐热相关热休克蛋白70基因标记，将携带这种耐热相关基因标记的海湾扇贝进行繁殖，培育后代，克隆得到后代中的热休克蛋白70基因启动子区序列，研究其多态性；同时进行热胁迫处理实验，研究耐热相关热休克蛋白70基因标记的遗传规律及其与海湾扇贝耐热能力的关系，从中筛选出既带有耐热相关热休克蛋白70基因标记、耐热能力又显著提高的贝苗进行多代繁殖和培育后即可建立耐热新品种。
本发明与已有技术相比其特点为：本发明借助分子生物学技术，以海湾扇贝为材料发掘我国养殖贝类耐热相关热休克蛋白70基因标记，初步建立了海湾扇贝耐热相关热休克蛋白70基因标记辅助育种技术，该技术具有操作简便快捷、选育效率高、周期短等特点，为贝类耐热品种的培育开辟了新的分子育种技术途径，对养殖贝类耐热品种的选育具有重要理论意义和应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的海湾扇贝热休克蛋白70基因启动子区多态性位点图。
图2为本发明实施例提供的海湾扇贝热休克蛋白70基因启动子区不同基因型的测序图谱。
图3为本发明实施例提供的海湾扇贝耐热群体及敏感群体中热休克蛋白70不同基因型的分布频率以及相应的卡方检验图。其中，1为-1248G/G基因型，2为-1248A/A基因型，3为-1108C/C基因型，4为-1108A/A基因型，5为-1107A/A基因型，6为-1107T/T基因型，7为-999A/A基因型，8为-999C/C基因型，9为-967G/G基因型，10为-967C/C基因型，11为-480A/A基因型，12为-480A/C基因型，13为-408A/A基因型，14为-408T/T基因型，15为-83A/A基因型，16为-83A/G基因型。
具体实施方式
筛选出海湾扇贝耐热相关的热休克蛋白70基因标记，建立相应的海湾扇贝分子标记辅助育种方法，为海湾扇贝耐热品种培育提供基因标记和技术方法。
海湾扇贝耐热相关的热休克蛋白70基因标记，包括：1、海湾扇贝热休克蛋白70基因启动子区的多态性分析；2、耐热相关热休克蛋白70基因标记的筛选；3、携带耐热相关基因标记个体的快速筛查；
1.海湾扇贝热休克蛋白70基因启动子区的多态性分析
参照分子克隆所述方法从海湾扇贝闭壳肌中提取基因组DNA作为基因扩增的模板；根据已知的热休克蛋白70基因启动子区序列设计一对引物，分别扩增来自耐热群体和热敏感群体的各6个个体的基因组DNA。将克隆得到的DNA序列连入T载体，每个个体分别挑取2个克隆进行测序。将测序得到的核苷酸序列进行比对分析，发现了11处多态性位点。
2.耐热相关热休克蛋白70基因标记的筛选
随机提取50个热敏感个体和50个耐热扇贝个体，提取基因组DNA作为基因扩增的模板。PCR扩增热休克蛋白70启动子区序列，将扩增产物纯化后进行测序分析。在11处多态性位点中，其中7处检测到3种基因型，分别是-1248A/G，-1108C/A，-1107A/T，-999A/C，-967G/C，-894A/T和-408A/T；另外4处检测到2种基因型，分别是-480A/C，-204C/G，-83A/G和-28A/G。
-1248A/A，-1108A/A，-1107T/T，-999C/C，-967G/G，-480A/A，-408T/T和-83A/G个体在耐热群体中出现的频率显著高于热敏感群体，其中-480A/A个体仅出现在耐热群体中。同时-1248G/G，-1108C/C，-1107A/A，-999A/A，-967C/C，-480A/C，-408A/A，和-83A/A个体在热敏感群体中出现的频率显著高于耐热群体，其中-480A/C个体仅出现在热敏感群体中。
因此，将-1248G/G，-1108C/C，-1107A/A，-999A/A，-967C/C，-480A/C，-408A/A，和-83A/A作为热敏感相关的热休克蛋白70基因标记，而将-1248A/A，-1108A/A，-1107T/T，-999C/C，-967G/G，-480A/A，-408T/T和-83A/G作为耐热相关的热休克蛋白70基因标记。
3.携带耐热相关基因标记个体的快速筛查
取海湾扇贝个体全血1μl作为模版，利用PCR扩增热休克蛋白70基因启动子区序列，将PCR产物纯化后利用3730测序仪进行测序分析，选择尽可能多包含-1248A/A，-1108A/A，-1107T/T，-999C/C，-967G/G，-480A/A，-408T/T和-83A/G基因型的个体作为耐热个体，其中必须包含-480A/A和-83A/G基因型。
实施例1
海湾扇贝耐热相关的热休克蛋白70基因标记的获得，按如下步骤获得：
1.海湾扇贝热休克蛋白70基因启动子区的多态性分析
参照分子克隆所述方法从海湾扇贝闭壳肌中提取基因组DNA作为基因扩增模板；根据已知的热休克蛋白70基因启动子区序列设计一对引物，AiHSP70pF(5′-aaaaccataacggcttgccatactaacc-3′)和AiHSP70pR(5′-caggacaaccccaagttatgtggcat-3′)，分别对来自耐热群体和热敏感群体的各6个个体的基因组DNA进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃变性5min；之后进行35个循环的恒定扩增(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 30s)；最后在72℃保温10min。将克隆得到的DNA序列连入T载体，每个个体分别挑取2个克隆进行测序。测序得到的核苷酸序列长为1391bp，比对分析后共发现了11处多态性位点，分别是-1248A/G，-1108C/A，-1107A/T，-999A/C，-967G/C，-894A/T，-480A/C，-408A/T，-204C/G，-83A/G和-28A/G(参见图1)。
2.海湾扇贝耐热相关热休克蛋白70基因标记的筛选
随机提取50个热敏感个体和50个耐热扇贝个体，提取基因组DNA作为基因扩增模板用于基因标记的筛选。利用引物AiHSP70pF(5′-aaaaccataacggcttgccatactaacc-3′)和AiHSP70pR(5′-caggacaaccccaagttatgtggcat-3′)，分别对来自耐热群体和热敏感群体的各50个个体的基因组DNA进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃变性5min；之后进行35个循环的恒定扩增(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 30s)；最后在72℃保温10min。，将PCR扩增得到的热休克蛋白70启动子区序列产物纯化后进行测序。在11处多态性位点中，其中7处检测到3种基因型，分别是-1248A/G，-1108C/A，-1107A/T，-999A/C，-967G/C，-894A/T和-408A/T，在测序图上分别出现3种峰图(参见图2)；另外4处检测到2种基因型，分别是-480A/C，-204C/G，-83A/G和-28A/G，在测序图上分别出现2种峰图(参见图2)。
统计分析耐热群体和热敏感群体中不同基因型出现的频率(参见表1)，再利用SPSS11.5软件进行Chi-square Test分析后发现，多态位点-894，-204和-28的不同基因型个体在耐热群体和热敏感群体中出现的频率无显著差异。具有基因型-1248G/G，-1108C/C，-1107A/A，-999A/A，-967C/C，-480A/C，-408A/A和-83A/A的个体在热敏感群体中出现的频率显著高于耐热群体，其中-480A/C个体仅出现在热敏感群体中；而具有基因型-1248A/A，-1108A/A，-1107T/T，-999C/C，-967G/G，-480A/A，-408T/T和-83A/G的个体在耐热群体中出现的频率显著高于热敏感群体(参见图3)，其中-480A/A个体仅出现在耐热群体中。
因此，-1248G/G，-1108C/C，-1107A/A，-999A/A，-967C/C，-480A/C，-408A/A和-83A/A被认为是热敏感相关的热休克蛋白70基因标记，而-1248A/A，-1108A/A，-1107T/T，-999C/C，-967G/G，-480A/A，-408T/T，和-83A/G被认为是耐热相关的热休克蛋白70基因标记。
表1：海湾扇贝热休克蛋白70不同基因型在耐热群体和热敏感群体中分布频率的卡方检验
3.携带耐热相关基因标记个体的快速筛查
取海湾扇贝全血1μl作为模版，以AiHSP70pF(5′-aaaaccataacggcttgccatactaacc-3′)和AiHSP70pR(5′-caggacaaccccaagttatgtggcat-3′)为引物按以下程序进行PCR扩增：94℃变性5min；之后进行35个循环的恒定扩增(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 30s)；最后在72℃保温10min。将PCR产物纯化后利用3730测序仪进行测序分析，参照测序图谱2选择尽可能多包含-1248A/A，-1108A/A，-1107T/T，-999C/C，-967G/G，-480A/A，-408T/T和-83A/G基因型的个体作为耐热个体，其中必须包含-480A/A和-83A/G基因型。
实施例2
海湾扇贝耐热相关热休克蛋白70基因标记辅助育种方法：以在耐热群体中高频出现的热休克蛋白70基因型-1248A/A，-1108A/A，-1107T/T，-999C/C，-967G/G，-480A/A，-408T/T和-83A/G作为耐热相关热休克蛋白70基因标记。将尽可能多的携带这些耐热相关基因标记(其中必须包含-480A/A和-83A/G)的海湾扇贝进行繁殖，培育后代，克隆获得后代中的热休克蛋白70基因，研究其多态性；同时进行热胁迫处理实验，研究耐热相关热休克蛋白70基因标记的遗传规律及其与扇贝耐热力的关系，从中筛选出既含有耐热相关热休克蛋白70基因标记、耐热能力又提高的贝苗进行多代繁殖和培育后即可建立耐热优良品种。

Claims (2)

1.一种海湾扇贝耐热相关的基因标记，其特征在于：海湾扇贝耐热相关的基因标记为序列表SEQ ID No.1碱基序列所示，起始密码子上游第83个碱基A、第408个碱基T、第480个碱基A、第967个碱基G、第999个碱基C、第1107个碱基T、第1108个碱基A和第1248个碱基A为耐热相关的基因位点。
2.一种权利要求1所述海湾扇贝耐热相关的基因标记辅助育种方法，其特征在于：以序列表SEQ ID No.1碱基序列所示，起始密码子上游第83个碱基A、第408个碱基T、第480个碱基A、第967个碱基G、第999个碱基C、第1107个碱基T、第1108个碱基A和第1248个碱基A作为耐热相关的基因标记，将携带这种耐热相关基因标记的海湾扇贝进行繁殖，培育后代，克隆得到后代中的热休克蛋白70基因启动子区序列，研究其多态性；同时进行热胁迫处理实验，研究耐热相关的基因标记的遗传规律及其与海湾扇贝耐热能力的关系，从中筛选出既带有耐热相关的基因标记、耐热能力又显著提高的贝苗进行多代繁殖和培育后即可建立耐热新品种；
热休克蛋白70基因启动子区序列为：
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