CN101712992B

CN101712992B - 一种华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记及其鉴定方法和试剂盒

Info

Publication number: CN101712992B
Application number: CN2009101925441A
Authority: CN
Inventors: 何毛贤; 袁涛; 黄良民
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2009-09-22
Filing date: 2009-09-22
Publication date: 2012-10-31
Anticipated expiration: 2029-09-22
Also published as: CN101712992A

Abstract

本发明公开一种华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记及其鉴定方法和试剂盒，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。利用本发明的分子标记可对华贵栉孔扇贝进行遗传鉴定的鉴定方法，其步骤为先制备待测样品基因组DNA，然后采用引物1和引物2对待测样品基因组DNA进行常规PCR扩增，根据PCR扩增产物即可对待测样品进行鉴定。本发明通过AFLP分析方法得到一条特异性高的华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记，用于贝壳壳色的遗传鉴定，鉴定结果准确率可高达100％，可实现对大量华贵栉孔扇贝进行遗传育种分析，找到所需的橙黄壳色个体，从而实现较高的商业价值。

Description

一种华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记及其鉴定方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及水生生物基因工程领域，具体涉及贝类壳色分子标记和遗传鉴定技术，尤其涉及一种华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记及其鉴定方法和试剂盒。

背景技术

在漫长的人类历史中，人们常常着迷于贝壳绚丽的色彩和丰富的形态。壳色的多态性往往与许多其他的生物学特征有着紧密的联系，例如：生物化学特性、遗传特征、遗传漂变、定向选择、频率制约选择等(Jones et al.，1977；Legates and Warwick，1990；Hedegaard et al.，2006)，因此，这一特性也一直吸引着生物学家的关注。

根据许多实验的交叉数据显示，软体动物的壳色变化是遵循遗传学规律的(David and Leslie，1977；Kraeuter et al.，1984；Adamkewicz and Castagna，1988)。关于壳色多态性的研究报告指出，壳色的基本遗传原理相对比较简单，壳色的多态是由一或两个显性位点所控制(Innes and Haley，1977；Palmer，1985；Ekendahl and Johannesson，1997；Yusa，2004)，而更加精细的多态表型则可能由相对更复杂的遗传系统所控制(Peignon et al.，1995；Winkler et al.，2001)。

海湾扇贝、牡蛎、鲍和马氏珠母贝的壳色作为一个可见的遗传标记已经应用于遗传育种中。Gary等(1980)对贻贝Mytilus edulis不同壳色群体进行杂交实验，形成的分离家系的研究中，发现两个群体间的壳色多态性存在相当频率的差异，并且在不同群体间棕色个体比蓝色个体要小10～20％。日本马氏珠母贝Pinctada fucata martensii的壳色有褐色(最常见)、红色、黄色和白色四种，野生和养殖群体里白色贝非常稀少，曾在一些自交群体里发现过白色个体(Wada，1986a，1986b)。白壳色性状有可能是由隐性基因控制的。郑怀平等(2003)建立了不同壳色海湾扇贝Argopecten purpuratus家系，并在此基础上获得了部分红壳色海湾扇贝，通过自交、杂交和定向选育方法培育出不同颜色的海湾扇贝，建立了海湾扇贝“壳色-数量性状复合选择和自交-定向选育-小群体平衡”的育种模式。

有关贝类壳色的研究主要是关于其多态性的或培育新品种，壳色性状相关的分子标记的研究还非常少，Qin等(2007a，2007b)采用AFLP分子标记，构建了海湾扇贝的壳色连锁遗传图谱，有助于研究壳色遗传的理论依据，并且有助于通过选择育种得到特定的壳色品种。

华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)是一种被熟知的拥有丰富亮丽壳色的重要海洋水产贝类。其主要壳色有亮黄色、橙黄色、黄褐色、浅紫褐色、紫色、赭色、淡红色等。而在养殖生产中，壳色性状时常是一项重要的选育指标。不同的壳色的扇贝在商品市场上的价格也有差异，颜色漂亮的往往能有更高的经济价值。然而，有关扇贝华贵栉孔扇贝壳色特异分子标记及其遗传鉴定的分子生物学技术，目前国内外都未见报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记。

本发明的另一个目的在于提供一种利用上述华贵栉孔扇贝壳色分子标记鉴定华贵栉孔扇贝壳色的方法。

本发明的另一个目的在于提供一种华贵栉孔扇贝遗传鉴定试剂盒。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

一种华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

上述华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记的筛选方法采用本领域技术人员所常用的AFLP分析方法，包括如下步骤：

(1)华贵栉孔扇贝基因组DNA的制备；

(2)采用AFLP分析方法对步骤(1)制备的基因组DNA进行分析：

对步骤(1)制备所得DNA模板依次进行酶切、连接、预扩增、选择性扩增和电泳分析；

本发明的AFLP分析方法采用本领域技术人员的常规操作，该分析方法中涉及到的酶切采用常用的EcoRI和MseI双酶切；本发明采用AFLP分析方法是引物设计的常规方法，涉及一系列用于预扩增和选择性扩增的引物，最后筛选出一组引物E-AAG和M-CAA，发现该组引物的电泳结果中，出现了华贵栉孔扇贝橙黄壳色特异性片段；

(3)根据上述电泳分析结果，引物E-AAG和M-CAA组合扩增出一个橙黄壳色特异的DNA片段，长度为176bp，将该片段切胶回收，采用常规克隆手段制备阳性克隆送交测序，结果得出该橙黄壳色特异的DNA片段其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

利用BLASTn软件在GenBank数据库中对上述获得的橙黄壳色特异的DNA片段进行同源性搜索，结果表明并无同源序列存在，说明这1个序列为华贵栉孔扇贝的新序列，该橙黄壳色特异的DNA片段仅仅存在于橙黄壳色样品中，在其余颜色的样品中不存在，因此该橙黄壳色特异的DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)可作为华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记。

上述华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记可用于华贵栉孔扇贝壳色的遗传鉴定，从而对华贵栉孔扇贝进行遗传育种。

本发明人根据核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的贵栉孔扇贝橙黄壳色特异性DNA片段，设计出一对特异性引物，利用该引物可以对华贵栉孔扇贝壳色进行遗传鉴定，所述特异性引物为：

引物1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

引物2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

一种利用本发明华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记对华贵栉孔扇贝壳色进行遗传鉴定的方法，该鉴定方法包括如下步骤：

(1)提取待测样品基因组DNA；

(2)采用引物1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)和引物2(其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)，对步骤(1)提取的待测样品基因组DNA进行PCR扩增，若扩增结果产生了142bp的序列如SEQ ID NO：1所示的特异DNA片段，则说明待测样品为遗传上的橙黄壳色个体，如果没有特异的DNA片段则认为是遗传上的非橙黄壳色个体，从而实现了华贵栉孔扇贝壳色的遗传鉴定。

上述鉴定方法中，PCR反应体系以及反应条件可采用市售的PCR试剂盒，均可实现本发明；PCR反应体系优选含有1.5mM MgCl₂、200μM dNTPs、引物10.5μM、引物20.5μM、1.0μL基因组DNA和0.03U/μL ExTaq DNA聚合酶；PCR反应条件优选95℃30s，66℃20s，72℃15s，总共35个循环。

根据上述鉴定方法，还可以制备对华贵栉孔扇贝进行遗传鉴定的鉴定试剂盒，鉴定试剂盒中含有引物1和引物2，引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，试剂盒中的其他物质可参考常规PCR扩增反应体系的组成进行搭配，根据最终的扩增产物是否含有142bp的特异性目的片段，即可对待测样品进行快速鉴定。

上述鉴定试剂盒也可以配套跟随一个阳性对照品，将扩增结果和阳性对照的PCR扩增结果进行对比，如果待测样品与阳性对照一样在142bp处出现目的片段，则说明该待测样品为遗传上的橙黄壳色个体，如果待测样品没有出现142bp的目的片段，则说明待测样品为遗传上的非橙黄色个体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明通过AFLP分析方法得到一条华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记，该分子标记特异性高，可用于贝壳壳色的遗传鉴定，且鉴定结果准确率可高达100％；

2.利用本发明的橙黄壳色分子标记以及鉴定方法，可以对华贵栉孔扇贝进行遗传育种分析，找到所需的橙黄壳色个体，从而实现较高的商业价值；

3.本发明提供的鉴定试剂盒可通过引物1和引物2，从大量样品中PCR扩增筛选出所需个体，简化了选择育种的操作。

附图说明

图1为华贵栉孔扇贝橙黄壳色个体的AFLP引物组合(E-ACC/M-CTC)的扩增电泳图谱；

图2为华贵栉孔扇贝紫色壳色个体的AFLP引物组合(E-ACC/M-CTC)的扩增电泳图谱；

图3为实施例2中华贵栉孔扇贝橙黄壳色个体的扩增电泳结果图；

图4为实施例2中华贵栉孔扇贝紫色壳色个体的扩增电泳结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实施例1华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记的制备

本实施例的华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记其制备方法包括如下几个步骤：

(1)华贵栉孔扇贝基因组DNA的提取；

(2)华贵栉孔扇贝基因组DNA的AFLP分析；

(3)特异性DNA片段的获得及测序。

上述三个步骤的详细操作如下：

(1)华贵栉孔扇贝基因组DNA的提取

选择40个华贵栉孔扇贝橙黄壳色个体和40个华贵栉孔扇贝紫色壳色个体，总共80个样品分别采用QIAGEN QIAamp DNA Mini Kit试剂盒(Germany)提取基因组DNA，提取方法参考试剂盒说明书。

(2)华贵栉孔扇贝基因组DNA的AFLP分析：

基因组DNA的AFLP分析采用本领域技术人员的常规操作，主要分为如下4步：

a.酶切和连接：

首先将100ng基因组DNA用EcoRI(0.125μL，20U/μL)和MseI(0.25μL，10U/μL)酶切(20μL反应体系)，37℃温育6h，70℃处理20min；之后再加入5μL连接混合液，连接混合液包括：0.1μL T4DNA连接酶(400U/μL)、0.5μL NE Buffer 2(10×)、0.025μL BSA(10mg/mL)、1.25μL ATP(100mmol/L)、EcoRIadapter(5pmol/L)和MseIadapter(50pmol/L)各0.5μL，16℃温育10h，72℃处理20min；酶切和连接操作中所涉及到的试剂均为市售。

b.预扩增：

将上述连接产物用预扩增引物进行PCR扩增，扩增反应体系为20μL：10×PCR缓冲液2μL、2mmol/L dNTPs 2μL、25mmol/L MgCl₂ 1.2μL、EcoRI预扩引物(10μmol/L)0.6μL、MseI预扩引物(10μmol/L)0.6μL、Taq酶(5U/μL)0.25μL和连接产物1μL，PCR反应程序为94℃30s，53℃30s，72℃60s，30个循环。

c.选择性扩增：

将上述预扩增产物用去离子超纯水稀释10倍后作为选择性扩增的模板，反应体系为20μL：2.0mM MgCl₂，200μM dNTPs，0.5μM选择性引物，1.0μLDNA和0.06U/μL ExTaq酶(Takara，Japan)。扩增条件为94℃，30s；60℃，30s；72℃，60s，30个循环。

d.电泳

选择性扩增产物采用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染的方法来检测，观察80个样品电泳图上条带的分布情况，电泳图如图1和图2所示，其中♀♂为两个亲本个体，其他为子代个体。

通过对比观察图1和图2可以看出，E-AAG/M-CAA的引物组合扩增出一条橙黄壳色特异的DNA片段，长度为176bp，将此片段命名为B1f176，该特异的DNA片段只在橙黄壳色个体中出现，而在紫色个体中不出现，可作为橙黄壳色特异的DNA标记。

(3)特异性DNA片段的获得及测序：

a.特异性DNA片段的回收：

采用QIAEX II Gel Extraction Kit(QIAGEN，Germany)从变性聚丙烯酰胺凝胶中将上述橙黄壳色特异的DNA片段电泳条带进行回收、纯化；本步骤的操作按照试剂盒说明书进行即可。

b.特异性DNA片段的克隆：

采用本领域技术人员的常规操作对上述切胶回收的DNA进行连接、转化和阳性克隆筛选，最终获得6个含有目标片段的克隆进行测序。

c.特异性DNA片段的测序：

将上述6个阳性克隆，采用ABI 3730序列分析仪进行橙黄壳色特异DNA片段的序列分析，获得华贵栉孔扇贝橙黄壳色特异分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

利用BLASTn软件在GenBank数据库中对该标记进行同源性搜索，结果表明并无同源序列存在，说明本实施例制备得到的特异性DNA片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)为华贵栉孔扇贝的新序列。

实施例2华贵栉孔扇贝橙黄壳色特异分子标记的应用

本实施例选择30个华贵栉孔扇贝橙黄壳色个体和30个华贵栉孔扇贝紫色壳色个体，总共60个作为试验样品，采用实施例1制备得到的华贵栉孔扇贝橙黄壳色特异分子标记对这60个贝壳进行遗传鉴定，具体包括如下步骤：

1.基因组DNA的提取

60个贝壳样品的基因组DNA提取QIAGEN QIAamp DNA Mini Kit试剂盒(Germany)，操作按照试剂盒说明书进行。

2.PCR扩增

根据实施例1制备所得华贵栉孔扇贝橙黄壳色特异分子标记(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，设计一对特异性引物用于遗传鉴定：

引物1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

引物2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

PCR扩增体系为：总体系为20μL，1.5mM MgCl₂、200μM dNTPs、引物E-AAG 0.5μM、引物M-CAA 0.5μM、1.0μL模版(基因组DNA)和0.03U/μLExTaq DNA polymerase(Takara，Japan)。

PCR扩增反应条件：95℃30s，66℃20s，72℃15s；总共35个循环。

采用上述PCR扩增体系以及反应条件对60个样品分别进行PCR扩增，扩增产物扩增产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。

从图3和图4中可以看出：30个橙黄壳色个体都能扩增得到长度为142bp目的片段，而30个紫色个体都未扩增得到该目的片段。

将30个橙黄壳色个体扩增得到的目的片段分别进行常规的切胶回收、纯化、连接和转化等操作，最终得到的阳性克隆送交测序，测序结果30个橙黄壳色个体得到的目的片段，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1一致。

由上述试验结果可以得出，本发明的华贵栉孔扇贝橙黄壳色特异分子标记具有较高的准确率，利用该分子标记对华贵栉孔扇贝进行壳色的遗传鉴定，其准确率可达100％。一种华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记及其鉴定方法和应用序列表

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院南海海洋研究所

<120>一种华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记及其鉴定方法和应用

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>142

<212>DNA

<213>华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)

<400>1

agattccgca tggcattatc ctccgcgcac aggtgttggt atggaaccca aatatgctgt 60

atatatagcg ctgtaattat ttgagatttg acacatttat gtaccagtac ttcccacgtg 120

aagctcaaat gaccaaggtc tt 142

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

aagaccttgg tcatttgagc ttc 23

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

agattccgca tggcattatc 20

Claims

1.一种华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种利用权利要求1所述华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记对华贵栉孔扇贝橙黄壳色进行遗传鉴定的鉴定方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)待测样品基因组DNA的制备；

(2)采用引物1和引物2对上述待测样品基因组DNA进行常规PCR扩增；

引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

(3)根据上述PCR扩增产物是否为权利要求1所述的华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记，从而对待测样品进行鉴定。

3.根据权利要求2所述鉴定方法，其特征在于所述步骤(2)中，PCR扩增的反应体系含有1.5mM MgCl₂、200μM dNTPs、0.5μM引物1、0.5μM引物2、1.0μL基因组DNA和0.03U/μLExTaq DNA聚合酶。

4.根据权利要求3所述鉴定方法，其特征在于所述步骤(2)中，PCR扩增反应条件为95℃30s，66℃20s，72℃15s，总共35个循环。

5.一种华贵栉孔扇贝遗传鉴定试剂盒，其特征在于该试剂盒包含引物1和引物2，所述引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。