CN105256056B - 一种扇贝物种特异性检测引物及应用 - Google Patents

一种扇贝物种特异性检测引物及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105256056B
CN105256056B CN201510787612.4A CN201510787612A CN105256056B CN 105256056 B CN105256056 B CN 105256056B CN 201510787612 A CN201510787612 A CN 201510787612A CN 105256056 B CN105256056 B CN 105256056B
Authority
CN
China
Prior art keywords
scallop
pcr
primer
detection primer
species specificity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201510787612.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105256056A (zh
Inventor
万超
刘淑艳
徐凤敏
宋大贺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201510787612.4A priority Critical patent/CN105256056B/zh
Publication of CN105256056A publication Critical patent/CN105256056A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105256056B publication Critical patent/CN105256056B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种扇贝物种特异性检测引物及应用。一种扇贝物种特异性检测引物，其序列是：5’‑agattcgggtatttggtgc‑3’（上游）；5’‑cggtaaagtagaaacgggtat‑3’（下游）。一种扇贝物种特异性检测引物的应用，采用扇贝物种特异性检测引物PCR扩增扇贝的CoxⅠ基因，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳会产生一条129bp大小的特异性电泳条带，从而将扇贝成分进行特异性鉴定。本发明特异性引物设计合理，用于扇贝物种检测，特异性好，检测灵敏度高，即经过PCR分析，即可将扇贝成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。

Description

一种扇贝物种特异性检测引物及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种扇贝物种特异性检测引物及应用。
背景技术
扇贝是扇贝属的双壳类软体动物的代称，约有400余种。该科的60余种是世界各地重要的海洋渔业资源之一。壳、肉、珍珠层具有极高的利用价值，是一种适合于人工高密度养殖的优良贝类，是我国主要海产经济贝类之一。通过形态学特征进行判断是对扇贝识别的传统方法，但是这些形态学特征的可塑性强，受环境影响大，具有人为的主观倾向性，且存在丰富的近缘物种，近缘种间的形态差异细微，所以传统的形态学特征识别方法存在识别困难与识别错误的问题。
采用DNA技术鉴定动物物种是物种识别方法中最为热门也是发展最快的分子技术。快速进化并呈母系遗传的线粒体DNA是种群遗传学和进化遗传学的理想研究对象。扇贝与其它近源物种的序列相似度在85-94%之间，而CoxⅠ基因序列有较大差异，目前，贝类动物的分子检测主要集中于这一序列。已发表的检测方法包括普通PCR方法和实时荧光PCR方法等，这些方法或存在交叉反应，或对设备要求很高，目前尚没有一种简便的PCR方法可以将扇贝的基因与其它贝类动物基因完全区分。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种扇贝物种特异性检测引物及应用方法。本发明可以检测出来自动物样品的微量DNA，完全区分扇贝的基因与其它贝类动物基因，检测灵敏度高，方法快速，易操作。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种扇贝物种特异性检测引物，其特征在于：其序列是：
上游引物：5’-agattcgggtatttggtgc-3’；
下游引物：5’-cggtaaagtagaaacgggtat-3’。
一种所述扇贝物种特异性检测引物的应用，其特征在于：利用所述扇贝物种特异性检测引物进行扇贝物种PCR特异性检测。
进一步地，所述扇贝物种PCR特异性检测方法为：采用扇贝物种特异性检测引物PCR扩增扇贝的CoxⅠ基因，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳会产生一条129bp大小的特异性电泳条带，从而将扇贝成分进行特异性鉴定。
进一步地，所述PCR扩增扇贝的CoxⅠ基因的25μL反应体系如下表1：
表1. PCR扩增扇贝的CoxⅠ基因的反应体系
进一步地，所述PCR扩增扇贝的CoxⅠ基因的反应参数如下表2：
表2. PCR扩增扇贝的CoxⅠ基因的反应参数
本发明特异性引物设计合理，用于扇贝物种检测，特异性好，检测灵敏度高。采用本方法检测扇贝动物成分结果显示，采用扇贝物种特异性检测引物PCR扩增扇贝的CoxⅠ基因，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳会产生一条129bp大小的特异性电泳条带，即可将扇贝成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。
附图说明
图1为5种引物PCR结果图，图中：M.DL2000marker,1.P1P2引物扩增结果,2.P3P4引物扩增结果,3.P5P6引物扩增结果,4.P7P8引物扩增结果,5.P9P10引物扩增结果,6.阴性对照。
图2为扇贝与其他海洋动物的PCR特异性检测结果图，图中：M.mark，1.扇贝，2.扇贝，3.杂色蛤，4.紫海胆，5.太平洋牡蛎，6.魁蚶，7.阴性对照，8.空白对照。
图3为灵敏度分析结果图，图中：M.DL2000marker，1. 0.1 ng/μL扩增结果，2.0.5ng/μL扩增结果，3. 1 ng/μL扩增结果，4. 5ng/μL扩增结果，5. 10 ng/μL扩增结果，6.阴性对照，7.空白对照。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。
本实施例中所利用的扇贝物种特异性检测引物，其序列是：
5’-agattcgggtatttggtgc-3’（上游）；
5’-cggtaaagtagaaacgggtat-3’（下游）。
一种所述扇贝物种特异性检测引物的应用，即利用所述扇贝物种特异性检测引物进行扇贝物种PCR特异性检测，具体步骤如下：
1.扇贝物种特异性检测引物合成：在宝生物公司合成扇贝物种特异性检测引物5对，其序列（见表3）：
表3. PCR扩增扇贝的CoxⅠ基因的引物序列：
2.扇贝DNA的提取：采用DNA提取试剂盒（购于宝生物公司）提取扇贝模板DNA，用微量分光光度计检测提取扇贝模板DNA的浓度为100ng。
3.PCR扩增扇贝的CoxⅠ基因：配制25μL PCR反应体系如下表4：
表4. PCR扩增扇贝的CoxⅠ基因的反应体系
使用该扇贝物种特异性检测引物时设置PCR的反应参数如下表5：
表5. PCR扩增扇贝的CoxⅠ基因的反应参数
4.琼脂糖凝胶电泳检测：以P1P2，P3P4、 P5P6、 P7P8 、P9P10等5对特异性引物PCR扩增扇贝的CoxⅠ基因后，以2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示（如图1所示），经琼脂糖凝胶电泳检测后会分别产生129bp、278bp、128bp、417bp、357bp大小的特异性电泳条带。以P1P2作为上下游引物进行特异性PCR扩增，电泳效果最好，PCR扩增效率最高，因此选取P1P2作为扩增体系的特异性扩增引物。
利用所述扇贝物种特异性检测引物进行扇贝的物种成分实时检测时，采用本方法检测扇贝动物成分结果显示，采用扇贝物种特异性检测引物PCR扩增检测扇贝、杂色蛤、紫海胆、太平洋牡蛎、魁蚶等样品，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳，如图2所示，扇贝样品产生一条129bp大小的特异性电泳条带，其他样品无电泳条带，即可将扇贝成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。
采用DNA提取试剂盒提取各待测样品的模板DNA，用微量分光光度计分别检测所提取的模板DNA梯度稀释，制备成0.1 ng/μL、 0.5ng/μL、 1 ng/μL、 5ng/μL、 10 ng/μL 5个浓度梯度样品，分别按照上述步骤3中所述反应体系及反应参数进行PCR扩增，后以2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，以确定本标准方法的检测灵敏度，结果如图3所示，所产生的大小为129bp的特异性电泳条带即为扇贝，当DNA浓度≥1ng/μL时均可以特异扩增，即该标准方法的检测灵敏度为1ng/μL。此方法可以准确的对扇贝的成分进行鉴定，具有很好的灵敏度。
以上内容是结合优选技术方案对本发明所做的进一步详细说明，不能认定发明的具体实施仅限于这些说明。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出简单的推演及替换，都应当视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 万, 超
刘, 淑艳
徐, 凤敏
宋, 大贺
<120> 一种扇贝物种特异性检测引物及应用
<130> 20151027
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 根据序列特异性而设计，作为扇贝物种PCR特异性检测的上游引物
<220>
<221> Artificial Sequence
<222> (1)..(19)
<400> 1
agattcgggt atttggtgc 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 根据序列特异性而设计，作为扇贝物种PCR特异性检测的下游引物
<220>
<221> Artificial Sequence
<222> (1)..(21)
<400> 2
cggtaaagta gaaacgggta t 21

Claims (5)

1.一种扇贝物种特异性检测引物，其特征在于：其序列是：
上游引物：5’-agattcgggtatttggtgc-3’；
下游引物：5’-cggtaaagtagaaacgggtat-3’；
所述引物进行扇贝物种 PCR 特异性检测，方法为：采用扇贝物种特异性检测引 物PCR 扩增扇贝的 CoxⅠ基因，PCR 扩增后经琼脂糖凝胶电泳会产生一条 129bp 大小的特异性电泳条带，从而将扇贝成分进行特异性鉴定。
2.一种根据权利要求 1 所述的扇贝物种特异性检测引物的应用，其特征在于：利用所述扇贝物种特异性检测引物进行扇贝物种 PCR 特异性检测。
3.根据权利要求 2 所述的扇贝物种特异性检测引物的应用，其特征在于：所述扇贝物种 PCR 特异性检测方法为：采用扇贝物种特异性检测引物 PCR 扩增扇贝的 CoxⅠ基因，PCR 扩增后经琼脂糖凝胶电泳会产生一条 129bp 大小的特异性电泳条带，从而将扇贝成分进行特异性鉴定。
4.根据权利要求 3 所述的扇贝物种特异性检测引物的应用，其特征在于：所述 PCR扩增扇贝的 CoxⅠ基因的反应体系如下表 1：
表 1. PCR 扩增扇贝的 CoxⅠ基因的反应体系
。
5.根据权利要求 3 或 4 任一所述的扇贝物种特异性检测引物的应用，其特征在于：所述 PCR 扩增扇贝的 CoxⅠ基因的反应参数如下表 2：
表 2. PCR 扩增扇贝的 CoxⅠ基因的反应参数
。
CN201510787612.4A 2015-11-17 2015-11-17 一种扇贝物种特异性检测引物及应用 Expired - Fee Related CN105256056B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510787612.4A CN105256056B (zh) 2015-11-17 2015-11-17 一种扇贝物种特异性检测引物及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510787612.4A CN105256056B (zh) 2015-11-17 2015-11-17 一种扇贝物种特异性检测引物及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105256056A CN105256056A (zh) 2016-01-20
CN105256056B true CN105256056B (zh) 2018-12-14

Family

ID=55095981

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510787612.4A Expired - Fee Related CN105256056B (zh) 2015-11-17 2015-11-17 一种扇贝物种特异性检测引物及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105256056B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112176074A (zh) * 2020-11-04 2021-01-05 辽宁省海洋水产科学研究院 一种检测虾夷扇贝的实时荧光pcr引物探针及方法
CN112695105A (zh) * 2021-02-18 2021-04-23 辽宁省海洋水产科学研究院 栉孔扇贝的实时荧光pcr鉴定方法
CN115807109B (zh) * 2022-12-20 2024-07-19 中国海洋大学三亚海洋研究院 一种基于pcr技术的扇贝品种鉴定方法及其特异性引物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101712992A (zh) * 2009-09-22 2010-05-26 中国科学院南海海洋研究所 一种华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记及其鉴定方法和试剂盒
CN101845489A (zh) * 2009-12-03 2010-09-29 中国海洋大学 一种大规模筛查扇贝snp的方法
CN103602738A (zh) * 2013-11-12 2014-02-26 辽宁大学 一种快速鉴定扇贝品种的多重pcr引物及方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101712992A (zh) * 2009-09-22 2010-05-26 中国科学院南海海洋研究所 一种华贵栉孔扇贝橙黄壳色分子标记及其鉴定方法和试剂盒
CN101845489A (zh) * 2009-12-03 2010-09-29 中国海洋大学 一种大规模筛查扇贝snp的方法
CN103602738A (zh) * 2013-11-12 2014-02-26 辽宁大学 一种快速鉴定扇贝品种的多重pcr引物及方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Comparative mitogenomic analyses of three scallops (Bivalvia: Pectinidae) reveal high level variation of genomic organization and a diversity of transfer RNA gene sets;Xiangyun Wu等;《BMC Research Notes》;20090505;第2卷;第71页第2段，表1 *
虾夷扇贝线粒体遗传模式的初步研究;徐科凤等;《南方水产科学》;20110630;第7卷(第3期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105256056A (zh) 2016-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105256056B (zh) 一种扇贝物种特异性检测引物及应用
CN106011300A (zh) 乌苏里拟鲿遗传性别鉴定用pcr引物对及快速鉴定方法
CN108103211B (zh) 一种鉴定长砗磲、诺瓦砗磲的微卫星引物和鉴定方法
CN106048016A (zh) 一种凡纳滨对虾抗性相关的多组合分子标记和应用
CN104946790B (zh) 一种溯源鉴定8种动物源性成分的pcr方法
CN103937802A (zh) 日照海蝉的dna条形码标准基因序列以及基于该基因序列的物种鉴定方法
CN105821054B (zh) 一种四川华鳊dna条形码标准检测序列及其应用
CN107354219A (zh) 一种鉴定企鹅性别的方法及试剂盒
CN104962660B (zh) 一种杂色蛤物种实时荧光pcr特异性检测体系及应用
CN106119377B (zh) 一种鉴别真鲷、黑鲷及其杂交后代的引物、试剂盒及鉴别方法
CN104450697B (zh) 一种与牡蛎抗病毒特性相关的snp标记及其应用
CN105543415A (zh) 一种牡蛎疱疹病毒不同变异株的巢式pcr检测方法
Reunov et al. In the Asia-Pacific region, the COI DNA test revealed the divergence of the bivalve mollusc Mactra chinensis into three species; can these species be distinguished using shell coloration and sperm structure?
CN104212915A (zh) 虾类偷死野田村病毒现场快速检测引物组及试剂盒
CN102102100B (zh) 辅助鉴别根结线虫的方法及其专用引物对
CN108060265B (zh) 用于检测感染毛蚶的牡蛎疱疹病毒的引物组和探针及其应用
CN110042168B (zh) 用于区分细鳞鲑和哲罗鲑的引物对、试剂盒及方法
CN104120121A (zh) 用于鉴定琉球螫蝇的dna条形码标准基因及应用
CN109355363B (zh) 一种区分克氏原螯虾不同群体的分子标记方法
CN110551826A (zh) 鉴定番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法
CN103911444B (zh) 一种鉴别花鳗鲡和太平洋双色鳗鲡苗种的引物和方法
CN105255880A (zh) 一种海胆物种特异性检测引物及应用
CN105063198B (zh) 一种杂色蛤物种特异性检测引物及应用
CN105400775A (zh) 一种无损伤提取中华鲟dna的方法
CN105838788A (zh) 一种蓝鳕鱼实时荧光pcr特异性检测体系及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20181214

Termination date: 20191117

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee