CN108103211B - 一种鉴定长砗磲、诺瓦砗磲的微卫星引物和鉴定方法 - Google Patents

一种鉴定长砗磲、诺瓦砗磲的微卫星引物和鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定长砗磲、诺瓦砗磲的微卫星引物和鉴定方法。所述的微卫星引物TC89为：F:5’‑ACAAACGAAGCAGGTGTT‑3’；R:5’‑GGTTCTGGATAAATGGGT‑3’。利用本发明方法，可以快速、准确地鉴定出长砗磲和诺瓦砗磲个体，同时本发明具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。

Description

一种鉴定长砗磲、诺瓦砗磲的微卫星引物和鉴定方法
技术领域：
本发明属于水产生物技术中的贝类分子标记和杂交种鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定长砗磲、诺瓦砗磲的微卫星引物和鉴定方法。
背景技术：
砗磲是一类热带大型海洋珊瑚礁底栖贝类，主要分布在西太平洋、印度洋等海域，我国南海的珊瑚礁澙湖、礁盘是砗磲的传统自然分布区。砗磲的经济价值高、用途广泛，市场需求量大，主要包括食用、水族馆活体及贝壳工艺装饰品等。近年来由于滥捕，砗磲资源受到严重的破坏，如库氏砗磲在我国南海几近绝迹，无鳞砗磲也极为罕见，其它砗磲大多处于濒危境地。
砗磲中以长砗磲的分布最广，数量也最多。近年来通过形态和DNA序列的分类研究发现，长砗磲中有一种数量较少的隐藏种—诺瓦砗磲。Tang等(2005)比较了长砗磲与诺瓦砗磲的形态学差异，发现两者外部形态差异不大，只有在壳上的放射肋及稜鳞的数量和分布有些不同，主要的差异在外套膜的花纹，诺瓦砗磲的外套膜花纹是类似放射状的构造，而长砗磲是斑状花纹，并且两者外套膜边缘黑色眼点的数量与排列方式也有差异。Su等(2014)基于16S rRNA和COI基因型分析发现为两个不同分群，支持诺瓦砗磲和长砗磲为不同种。由于两种砗磲的形态差异很小，单纯依靠形态特征往往难以鉴别；幼体阶段的长砗磲和诺瓦砗磲根据形态特征更加难以区分。急需一种简单高效的方法对长砗磲和诺瓦砗磲个体进行大规模物种鉴定。
发明内容：
本发明目的在于提供一种鉴定长砗磲、诺瓦砗磲的微卫星引物和鉴定方法。本发明利用该方法对长砗磲、诺瓦砗磲各40个个体进行了分析并发现鉴定效果显著，可以简单高效地对两者进行大规模物种鉴定。
本发明解决技术问题的技术方案：利用从60对番红砗磲微卫星引物中筛选出的1对微卫星(SSR)引物对长砗磲、诺瓦砗磲各40个个体的基因组DNA进行PCR扩增，通过扩增图谱可以简单高效的进行物种鉴定。
本发明的第一目的是提供鉴定长砗磲、诺瓦砗磲的微卫星引物TC89，其特征在于，所述的微卫星引物TC89为：
F:5’-ACAAACGAAGCAGGTGTT-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；
R:5’-GGTTCTGGATAAATGGGT-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。
本发明的第二个目的是提供一种鉴定长砗磲、诺瓦砗磲的试剂盒，其特征在于，含有上述微卫星引物TC89。
本发明的第三个目的是提供一种长砗磲、诺瓦砗磲的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测牡蛎样品的基因组DNA，然后用上述微卫星引物TC89进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳和染色，若在240bp～250bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为长砗磲，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；若在220bp～230bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为诺瓦砗磲，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子。
优选，所述的用上述微卫星引物TC89进行PCR扩增，其PCR扩增体系为：25μL，其中各种成分及终浓度分别为：DNA模板50ng，Buffer 10mM，引物各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+2.0Mm，Taq DNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL。
优选，所述的用上述微卫星引物TC89进行PCR扩增，其PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30次；72℃延伸10min。
优选，所述的将扩增产物进行电泳和染色，是将扩增产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，220V稳压电泳4小时，然后用0.1％AgNO3溶液(AgNO3 1g，dH2O 1000mL)染色10min，银染后用2％NaOH、0.4％甲醛、0.2％NaS2O3、dH2O 1000mL显色，至条带清晰为止。
微卫星引物TC89产生的长砗磲特异性条带范围在240bp-250bp之间，诺瓦砗磲特异性条带范围在220bp-230bp之间，两者之间没有等位基因重叠区，可以明显区分两种近缘种砗磲的个体。因此将电泳结果与提供的标准图谱进行对比：若在240bp～250bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为长砗磲，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；若在220bp～230bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为诺瓦砗磲，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子。
本发明从60对番红砗磲微卫星引物中筛选出一对能够在长砗磲、诺瓦砗磲中通用并且可以根据扩增条带大小区分两种砗磲，同时带型清晰、重复性好、扩增条带稳定的微卫星引物：TC89，其具有重要应用价值。
由于长砗磲和诺瓦砗磲属于同域分布种，外部形态差异很小，单纯依靠形态特征往往难以鉴别；幼体阶段的两种砗磲根据形态特征更加难以区分。而利用本发明方法，可以快速、准确地鉴定出长砗磲和诺瓦砗磲个体，同时本发明具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。
附图说明：
图1为微卫星引物TC89在长砗磲、诺瓦砗磲部分个体间的电泳染色对比图谱，1～6是长砗磲个体，7～11是诺瓦砗磲个体。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
参见图1，用消毒后的镊子和小剪刀从长砗磲和诺瓦砗磲足丝孔中剪取少量外套膜组织。向装有外套膜组织的离心管中加入400μl裂解液和10μl蛋白酶K(10mg/ml)，在振荡器上混匀，55℃水浴消化，直至组织完全溶解得到第一溶液。加入等体积饱和酚(200μl)、氯仿/异戊醇(24:1)(200μl)混合液抽提三次，每次10000rpm离心10-15min，用移液器吸取上清液。将1mL预冷的无水乙醇加入装有上清液的离心管中，过夜沉淀。最后经70％酒精洗涤，室温晾干后溶于200μL的超纯水中，得到基因组DNA。紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
以提取的长砗磲和诺瓦砗磲基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应：PCR反应体系的总体积为25μL，其中各种成分及终浓度分别为：DNA模板50ng，Buffer 10mM，引物各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+2.0Mm，Taq DNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL。其中引物序列为：
F:5’-ACAAACGAAGCAGGTGTT-3’
R:5’-GGTTCTGGATAAATGGGT-3’
反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min。
PCR反应结束后，取0.3μL扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，220V稳压电泳4小时，电泳结束后将凝胶从玻璃板上取下放入托盘中，用去离子水清洗两次，然后加入0.1％AgNO3溶液(AgNO3 1g，dH2O 1000mL)染色10min。染色后加入去离子水再次清洗一次，加入显色液(2％NaOH、0.4％甲醛、0.2％NaS2O3、dH2O 1000mL)显色，直至条带清晰为止，于UMAX扫描仪下扫描后，扫描图如图1所示，1～6是长砗磲个体，7～11是诺瓦砗磲个体。
由于微卫星引物TC89产生的长砗磲特异性条带范围在240bp-250bp之间，诺瓦砗磲特异性条带范围在220bp-230bp之间，两者之间没有等位基因重叠区，可以明显区分两种近缘种砗磲的个体。因此将电泳结果与提供的标准图谱进行对比：若在240bp～250bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为长砗磲，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；若在220bp～230bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为诺瓦砗磲，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种鉴定长砗磲、诺瓦砗磲的微卫星引物和鉴定方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acaaacgaag caggtgtt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttctggat aaatgggt 18

Claims (6)

1.鉴定长砗磲、诺瓦砗磲的微卫星引物TC89，其特征在于，所述的微卫星引物TC89为：
F:5’-ACAAACGAAGCAGGTGTT-3’；
R:5’-GGTTCTGGATAAATGGGT-3’。
2.一种鉴定鉴定长砗磲、诺瓦砗磲的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的微卫星引物TC89。
3.一种长砗磲、诺瓦砗磲的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测牡蛎样品的基因组DNA，然后用权利要求1所述的微卫星引物TC89进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳和染色，若在240bp～250bp区间内出现1～2条条带，则该样品为长砗磲，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；若在220bp～230bp区间内出现1～2条条带，则该样品为诺瓦砗磲，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述的用微卫星引物TC89进行PCR扩增，其PCR扩增体系为：25μL，其中各种成分及终浓度分别为：DNA模板50ng，Buffer 10mM，引物各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+2.0mM，Taq DNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL。
5.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述的用微卫星引物TC89进行PCR扩增，其PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30次；72℃延伸10min。
6.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述的将扩增产物进行电泳和染色，是将扩增产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，220V稳压电泳4小时，然后用0.1％AgNO3溶液染色10min，银染后用2％NaOH、0.4％甲醛、0.2％NaS2O3、dH2O 1000mL显色，至条带清晰为止。
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