CN110699462B

CN110699462B - 一种砗蚝微卫星位点及鉴定引物

Info

Publication number: CN110699462B
Application number: CN201911076923.4A
Authority: CN
Inventors: 马海涛; 喻子牛; 张跃环; 肖述
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2019-11-06
Filing date: 2019-11-06
Publication date: 2023-08-18
Anticipated expiration: 2039-11-06
Also published as: CN110699462A

Abstract

本发明公开了一种砗蚝微卫星位点及鉴定引物。砗蚝微卫星位点HH101、HH102、HH103、HH104或HH105，其特征在于，所述的砗蚝微卫星位点HH101、HH102、HH103、HH104和HH105的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4、5所示。本发明提供了5个砗蚝的新的微卫星位点及扩增这5个微卫星位点的引物序列和扩增方法，其具有稳定性高、特异性强的优点，可应用于砗蚝的群体遗传结构分析、亲权鉴定及分子标记辅助育种等领域，是一种可靠有效的分子标记。

Description

一种砗蚝微卫星位点及鉴定引物

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及一种砗蚝微卫星位点及鉴定引物。

背景技术

微卫星DNA，又称作短串连重复(STRs)、简单重复序列(SSRs)、简单序列长度多态性(SSLP)，是指基因组中以1～6个核苷酸为单位串联组成的核苷酸序列。微卫星标记具有分布广泛、多态性信息容量高、呈共显性、符合孟德尔分离规律、易于PCR扩增、再现性好等优点，已经被广泛应用于海洋生物的群体遗传结构分析、亲权鉴定、遗传连锁图谱构建、功能基因定位和遗传育种等领域。

砗蚝隶属于砗磲科(Tridacnidae)，砗蚝属(Hippopus)。分布于印度洋东部和太平洋西部及我国南海海域，主要栖息在珊瑚礁砂质底中，是珊瑚礁生态系统的主要关键框架生物之一。近年来由于过度捕捞，砗蚝资源受到了严重的破坏，《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)将砗蚝列为世界稀有海洋生物加以保护，对其国际贸易加以管制。为了保护砗蚝的野生种质资源，制定相应的保护策略，对其进行群体遗传多样性分析、群体遗传结构分析等相关工作已经非常迫切。

发明内容:

本发明的目的是提供5个稳定性高、特异性强的砗蚝多态性微卫星位点，以及相应的多态性微卫星引物，为砗蚝群体遗传结构分析、亲权鉴定及分子标记辅助育种提供有效的工具。

本发明通过构建砗蚝微卫星(CA)₁₆、(GA)₁₆富集文库，筛选砗蚝多态性微卫星引物及利用8个砗蚝野生个体对这些微卫星位点进行遗传多态性检测，确定了砗蚝5个多态性丰富的微卫星标记：HH101、HH102、HH103、HH104、HH105，测定其中一个砗蚝的5个多态性丰富的微卫星标记的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1-NO.5。

因此，本发明的第一个目的是提供5个砗蚝微卫星位点，分别为HH101、HH102、HH103、HH104、HH105，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3、4、5所示。

本发明针对上述5个砗蚝微卫星位点的核苷酸序列的微卫星重复的两端侧翼序列上分别设计的正向、反向引物，具体如下：

针对HH101位点，引物对为R：5’-TCTATCCCTCCTCTGTTC-3’，F：5’-GTGACTGGTTAAGCTCGT-3’；

针对HH102位点，引物对为R：5’-ATCCAACATCCCAACCTG-3’，F：5’-TGCTCACAATGACCAAGC-3’；

针对HH103位点，引物对为R：5’-TCGACGCTTACAGACAAC-3’，F：5’-ATCCCATCTGACAGTGGT-3’；

针对HH104位点，引物对为R：5’-GCGTCTCGATGAATAAGA-3’，F：5’-ATGTGAAAGAGGAAGGGA-3’；

针对HH105位点，引物对为R：5’-GTTGTTAAACTGCCTATTAGTG-3’，F：5’-CAAAGAATCGCTTGAGGT-3’。

本发明的第三个目的是提供一种试剂盒，其包括针对上述任一个砗蚝微卫星位点的引物对。

本发明提供了5个砗蚝的新的微卫星位点及扩增这5个微卫星位点的引物序列和扩增方法，其具有稳定性高、特异性强的优点，可应用于砗蚝的群体遗传结构分析、亲权鉴定及分子标记辅助育种等领域，是一种可靠有效的分子标记。

附图说明

图1：HH101位点的特异性引物扩增8个砗蚝个体的银染PAGE图。

图2：HH102位点的特异性引物扩增8个砗蚝个体的银染PAGE图。

图3：HH103位点的特异性引物扩增8个砗蚝个体的银染PAGE图。

图4：HH104位点的特异性引物扩增8个砗蚝个体的银染PAGE图。

图5：HH105位点的特异性引物扩增8个砗蚝个体的银染PAGE图。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明做详细的说明：

实施例1：

1、砗蚝微卫星DNA富集文库的构建：

1.1基因组DNA的提取和酶切：

剪取70％酒精固定的砗蚝(Hippopus hippopus)闭壳肌组织20mg，用蒸馏水浸泡4次，每次20min后换水，以彻底除去肌肉中残存的酒精。将肌肉充分剪碎，用干净的滤纸吸除水分后放入1.5mL离心管中，再加入400μl裂解液和10μl蛋白酶K(10mg/ml)，在振荡器上混匀，55℃水浴消化3～5h，直到裂解液澄清为止。加入等体积饱和酚(200μL)、氯仿/异戊醇(24:1)(200μL)混合液抽提三次。用1mL的无水乙醇沉淀DNA，经70％酒精洗涤，室温晾干后溶于100μL的超纯水中。紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。用限制性核酸内切酶Sau3AI酶切基因组。1％的琼脂糖凝胶电泳后，胶回收试剂盒回收400-1000bp的DNA片段，得到酶切产物。

1.2连接接头和第一次PCR扩增

寡核苷酸链A(Sau 3AI-L:5’-GCGGTACCCGGGAAGCTTGG-3’)和B(Sau 3AI-R:5’-GATCCCAAGCTTCCCGGGTACCGC-3’)溶液各10μl于PCR小管中混合，在95℃变性10min，然后自然冷却。酶切产物与双链接头的连接采用T4DNA接酶，16℃过夜连接。以连接产物为模板，Sau 3AI-L为引物进行第一次PCR扩增，25uL反应体系如下：12.5uL Green MasterMix(Promega公司)，2.5uL引物，2uL连接产物，加灭菌水补至25uL。PCR反应程序：95℃预变性5min，94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复25次，72℃延伸10min。对PCR产物进行胶回收，回收400bp以上的片段并去除多余的引物、dNTP等，得到胶回收产物。

1.3磁珠富集及第二次PCR扩增

将胶回收产物与生物素标记的寡核苷酸探针(CA)₁₆、(GA)₁₆在58℃杂交2小时。用链霉亲和素包裹的磁珠(Streptavidin Paramagnetic Particles(PMPs)(Promega公司)捕获含有微卫星核心的DNA单链，再通过多次洗脱去除非目的片段，最后通过95℃变性5分钟收集含有微卫星核心的片段。以磁珠富集产物为模板，Sau 3AI-L为引物进行第二次PCR扩增，反应体系和程序同第一次PCR。用PCR产物纯化试剂盒(天根生物公司)对第二次PCR产物进行纯化。

1.4连接转化

将第二次PCR纯化产物与pGEM-T Easy载体(Promega公司)进行连接，4℃连接过夜，转化入JM109感受态细胞，涂布于LB平板上进行培养直至长出单菌落。

1.5三引物法检测阳性克隆、测序及引物设计

挑取单菌落到96孔培养板中，进行扩大培养。用SP6(CATACGATTTAGGTGACACTATAG)、T7(TAATACGACTCACTATAGGGCGA)和核心序列(CA)₁₆和(GA)₁₆为引物，反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min。取PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，出现两条或两条以上的为含有微卫星核心的阳性克隆，利用ABI3730进行单向或双向测序。用Primer5.0对获得的微卫星序列共设计了20对微卫星引物，对这些引物进行PCR扩增检测，最终有5对引物能稳定扩增出目的条带，5对引物序列如表1所示。

2、砗蚝多态性微卫星引物的筛选及结果分析

2.1筛选有多态性的引物

按1.1方法提取8尾砗蚝个体的基因组DNA，然后用1.5得到的微卫星引物进行RCR扩增。扩增反应体系为25uL，反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s(退后温度见表1)，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min。PCR产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，银染法染色，UMAX扫描仪进行扫描。共得到5个具有多态性的微卫星标记(见表1)，HH101，HH102，HH103，HH104，HH105。测定其中一个砗蚝的微卫星位点标记序列，具体的核苷酸序列如下所示：HH101为242个核苷酸，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。HH102为328个核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。HH103为363个核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。HH104为364个核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。HH105为298个核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

表1引物特性表

2.2结果分析

由附图1-5可知，本发明的5个微卫星序列的长度在供试的8个砗蚝中都出现了多态性，具有扩增稳定性高、特异性强的优点。由此可见，这5个微卫星标记今后能用于砗蚝的种质资源评价和遗传连锁图谱构建等工作。

本发明提供了5个砗蚝的新的微卫星位点及扩增这5个微卫星位点的引物序列和扩增方法，可应用于砗蚝的群体遗传结构分析、亲权鉴定及分子标记辅助育种等领域的研究，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 一种砗蚝微卫星位点及鉴定引物

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 242

<212> DNA

<213> 砗蚝(Hippopus hippopus)

<400> 1

gatcaaaagc gaaccacctt tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctcacac 60

acacacacac acacacacac acacacacaa atttaatcag tcacttctat ccctcctctg 120

ttcgtatttg acacgcgcaa tttttttttc caaacctccg cgacaaggca aaactttatt 180

cgagtacatt ttacttctta atatttaaag cattcatacg agcttaacca gtcacaatca 240

at 242

<210> 2

<211> 328

<212> DNA

<213> 砗蚝(Hippopus hippopus)

<400> 2

gatcatggca tacctctctc tctctctctc tctctctctc tctcttgtat ccaacatccc 60

aacctgcatc ctacccttca cccatcaccc gacaccctac ccctctcccg cacacacaca 120

ctacactaca cctctcctat accctatctg tctgccatac accttacgta gtacacacca 180

tcttacacac cccaaccgac acccagtgtt acacccaccc tatcctactc cctaccctac 240

cctaccctaa accccaccct atgaaataaa ctgcaacaaa gtaatgagct tggtcattgt 300

gagcaaaatc actttttgtt gtgctggt 328

<210> 3

<211> 363

<212> DNA

<213> 砗蚝(Hippopus hippopus)

<400> 3

gatcgacgct tacagacaac attgtaactc tagattagca agatgtcagt gtgcttcaat 60

aaattttccc ttgtaaatgg acgacgtctt acagctactt ctccatacga atcgtgttca 120

ccagagacca ctgtcagatg ggatttatag aatcattgtg tcacaatgtg gtttgtctag 180

aaagctagaa tgaatggtat ttataccaac ttaggtaaat tttcgaggag atgaaccatg 240

tgttaaaaag acagtacagt aacaatctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 300

ctctctctct ctgcctctct ctctttcccg ctaaaaagaa gatagtacag taacaatcga 360

gat 363

<210> 4

<211> 364

<212> DNA

<213> 砗蚝(Hippopus hippopus)

<400> 4

gatcaacaaa gcgtctcgat gaataagata atatctctct ctctctctct ctctctctct 60

ctctctctct ctctctctat gtctctctct ctatgtctct ctcaccctca cacatacaca 120

aaaaaaaaaa accaaacaca ctctctctct caacacacac acacacacac tctctctctt 180

tctctttctc tctctctctc tctctctctc tctctcttta atccctctcc aatcctctcc 240

ccgccttctt tctttttccc ttcctctttc acatatggta gcagcttggt tgccactaat 300

gaggagaatc tttttcgtat ctaagataga gatatgttta gcaacaccat ttatttgaca 360

tagc 364

<210> 5

<211> 298

<212> DNA

<213> 砗蚝(Hippopus hippopus)

<400> 5

gatcatctgc actctaatgt tcaaagatta tctccccttg aacttaaaaa gttgttgtta 60

aactgcctat tagtgttagt tacacacaca cacaacaaac acacccacac gcacacaggt 120

agtattttag aaaccttcga ataaccagtt agaatatctc ttctataatc gtctgttgtc 180

tatattattc ggcaaacctc aagcgattct ttgaccaggt atttcattgg tacagggacg 240

gccgagtttt gatgagtgct gttcgtatat ggtcacttgc tcttgctttg taactatt 298

Claims

1.砗磲微卫星位点的鉴定引物组，其特征在于，包括如下引物对：

针对HH101位点，引物对为R：5’-TCTATCCCTCCTCTGTTC-3’，F：5’-GTGACTGGTTAAGCTCGT-3’，

针对HH102位点，引物对为R：5’-ATCCAACATCCCAACCTG-3’，F：5’-TGCTCACAATGACCAAGC-3’，

针对HH103位点，引物对为R：5’-TCGACGCTTACAGACAAC-3’，F：5’-ATCCCATCTGACAGTGGT-3’，

针对HH104位点，引物对为R：5’-GCGTCTCGATGAATAAGA -3’，F：5’-ATGTGAAAGAGGAAGGGA-3’，

2.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的砗磲微卫星位点的鉴定引物组。