CN111304337B - 鉴定黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交子一代的srap分子标记、试剂盒和方法及应用 - Google Patents

鉴定黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交子一代的srap分子标记、试剂盒和方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及鉴定黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼及其杂交子一代的SRAP分子标记、试剂盒和鉴定方法及应用,属于水产养殖的杂交品种选育技术领域。本发明所述SRAP分子标记的扩增用引物为:核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物Me3和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物Em3。本发明提供的分子标记,能够较为简单、准确地区分出黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼与其杂交子一代黄颡鱼,从而增加亲本选育与苗种培育效果。

Description

鉴定黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交子一代的SRAP分子标记、试剂 盒和方法及应用
技术领域
本发明涉及水产养殖的杂交品种选育技术领域,具体涉及鉴定黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼及其杂交子一代的SRAP分子标记、试剂盒和鉴定方法及应用。
背景技术
黄颡鱼是我国重要的名优特色水产养殖品种之一,其肉质细嫩且无肌间刺,味道鲜美,营养丰富,具有滋补作用和药用价值,因此深受消费者的喜爱,在国内外水产市场中需求量很大。随着养殖新技术不断推广,养殖方式日趋多样,我国的黄颡鱼产量显著提升,据《中国渔业年鉴》统计数据,2018年已达到48万吨,连续几年都是以20%左右的幅度在增长。其中苏、浙、湖北、西、广东五省的黄颡鱼养殖总产量占全国总量的70%以上。主要养殖的黄颡鱼品种有瓦氏黄颡鱼,YY黄颡鱼与杂交黄颡鱼“黄优1号”等,这些品种具有明显的生长优势。
将黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼进行杂交,繁育的杂交子一代黄颡鱼具有生长快,抗逆性强等特点,拥有很好地推广与养殖前景。通常,黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼与其杂交子一代黄颡鱼在苗种阶段很难区分,需要长至成鱼阶段通过外形与体色来区分,不同品种的苗种混在一起往往会影响养殖效果。目前缺少一种在苗种阶段对黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼与其杂交子一代黄颡鱼进行区分的有效方法。
发明内容
为了克服现有筛选黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼与其杂交子一代黄颡鱼(黄颡鱼♀×瓦氏黄颡鱼
Figure GDA0002572974690000012
)仅能通过形体与颜色来辨别的瓶颈,本发明的目的在于提供鉴定黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼及其杂交子一代的SRAP分子标记、试剂盒和鉴定方法及应用。本发明提供的分子标记,能够较为简单、准确地区分出黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼与其杂交子一代黄颡鱼,从而增加亲本选育与苗种培育效果。
本发明提供了一种鉴定黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼及其杂交子一代的SRAP分子标记,所述SRAP分子标记的扩增用引物为:核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物Me3和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物Em3。
本发明还提供了基于上述技术方案所述分子标记的鉴定黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼及其杂交子一代的试剂盒,所述试剂盒包括上述技术方案所述引物。
优选的是,所述试剂盒还包括10×buffer、dNTP、γ-Taq酶和灭菌水。
本发明还提供了基于上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述试剂盒的鉴定黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼及其杂交子一代的SRAP分子标记方法,所述方法的反应体系每30μL包括:10×buffer 3μL,dNTP 2.4μL,上述技术方案所述正向引物1μL,上述技术方案所述反向引物1μL,γ-Taq酶0.2μL,待测样品的DNA模板2μL和灭菌水20.4μL。
优选的是,所述方法的PCR反应程序包括:94℃5min;94℃30s,38℃30s,72℃1min,共5个循环;94℃30s,52℃30s,72℃1min,共35个循环;72℃8min。
优选的是,当扩增产物在100~250bp有三条特异性条带,则鉴定为黄颡鱼;当扩增产物在250~1000bp有二条特异性条带,则鉴定为瓦氏黄颡鱼;当扩增产物在100~250bp和250~1000bp处均存在亲本的特异性条带,则鉴定为杂交子一代黄颡鱼。
本发明还提供了上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述试剂盒在鉴定黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼及其杂交子一代中的应用。
本发明提供了鉴定黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼及其杂交子一代的SRAP分子标记。本发明所述SRAP分子标记能够在苗种阶段快速有效的鉴定与区分黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼亲本与杂交子一代,并且对苗种无损伤;结果稳定可靠、重复性好、多态性高,具有成本低、适用性强的特点,能够较为简单、准确地区分出黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼与其杂交子一代黄颡鱼,从而增加亲本选育与苗种培育效果。
附图说明
图1为本发明提供的利用不同引物对筛选三种不同品种黄颡鱼的差异条带结果图;
图2为本发明提供的SRAP分子标记鉴定三种不同品种黄颡鱼的差异条带结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种鉴定黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼及其杂交子一代的SRAP分子标记,所述SRAP分子标记的扩增用引物为:核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物Me3和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物Em3。利用本发明所述SRAP分子标记能够在苗种阶段快速有效的鉴定与区分黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼亲本与杂交子一代,并且对苗种无损伤。在本发明中,所述杂交子一代优选以“黄颡鱼♀×瓦氏黄颡鱼
Figure GDA0002572974690000031
”的亲本组合杂交得到。
本发明还提供了基于上述技术方案所述分子标记的鉴定黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼及其杂交子一代的试剂盒,所述试剂盒包括上述技术方案所述引物。
在本发明中,所述试剂盒还包括10×buffer、dNTP、γ-Taq酶和灭菌水。
本发明还提供了基于上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述试剂盒的鉴定黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼及其杂交子一代的SRAP分子标记方法,所述方法的反应体系每30μL包括:10×buffer 3μL,dNTP 2.4μL,上述技术方案所述正向引物1μL,上述技术方案所述反向引物1μL,γ-Taq酶0.2μL,待测样品的DNA模板2μL和灭菌水20.4μL。
在本发明中,所述待测样品的DNA模板的获得方法优选包括以下步骤:分别取黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼与其杂交子一代黄颡鱼尾鳍样本,采用酚氯仿方法提取尾鳍基因组DNA,用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度,DNA的OD260和OD280的比值优选为1.65~1.85,浓度优选为750ng~1200ng/L,此条件提取的DNA较为理想,将其稀释为50ng/uL,-80℃保存备用。
在本发明中,所述方法的PCR反应程序包括:94℃5min;94℃30s,38℃30s,72℃1min,共5个循环;94℃30s,52℃30s,72℃1min,共35个循环;72℃8min。
本发明优选将PCR扩增产物通过8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测,银染法染色进行显色。依据特异条带来筛选不同品种的黄颡鱼。在本发明中,当扩增产物在100~250bp有三条特异性条带,则鉴定为黄颡鱼;当扩增产物在250~1000bp有二条特异性条带,则鉴定为瓦氏黄颡鱼;当扩增产物在100~250bp和250~1000bp处均存在亲本的特异性条带,则鉴定为杂交子一代黄颡鱼。
本发明还提供了上述技术方案所述分子标记或上述技术方案所述试剂盒在鉴定黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼及其杂交子一代中的应用。
在本发明中,所述引物可以制备成相应的探针,应用于黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼及其杂交子一代的鉴定中。
下面结合具体实施例对本发明所述的鉴定黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼及其杂交子一代的SRAP分子标记、试剂盒和鉴定方法及应用做进一步详细的介绍,本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
一、不同品种黄颡鱼尾鳍的选取。分别选取黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼与其杂交子一代黄颡鱼各30尾,剪取尾鳍后分别放入液氮中保存备用。
二、基因组DNA的提取。分别取三种不同品种的黄颡鱼尾鳍样本各30个/组,采用酚氯仿方法提取尾鳍基因组DNA,用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度,DNA的OD260和OD280的比值处于1.65到1.85之间,浓度在750ng-1200ng/L之间,说明提取的DNA较为理想,并将其稀释为50ng/uL,-80℃保存备用。
三、引物筛选。设计正向引物8个,反向引物8个,共64对SRAP引物(表1)。
表1引物序列
Figure GDA0002572974690000051
每个样本取10μL DNA溶液混合构成不同品种黄颡鱼的样本池。以64对SRAP引物分别对三个DNA池进行PCR扩增。SRAP反应体系与扩增条件:
Figure GDA0002572974690000052
PCR反应条件:94℃5min;94℃30s,38℃30s,72℃1min,共5个循环;94℃30s,52℃30s,72℃1min,共35个循环;72℃8min。
根据BSA池是否出现明显差异条带,筛选1对最合适引物。根据图1,使用引物Me3/Em3组合,三种不同品系黄颡鱼呈现明显的差异条带。然而,其他组合的引物对无法明显区分不同品种黄颡鱼。图1为利用不同引物对筛选三种不同品种黄颡鱼的差异条带结果图,注:瓦氏(瓦氏黄颡鱼);杂交(子一代杂交黄颡鱼);普通(黄颡鱼)。
四、样本的SRAP-PCR扩增。根据筛选出的三个DNA池扩增出现差异基因片段的SRAP引物对Me3/Em3组合,按照建立的黄颡鱼SRAP反应体系与程序分别对三种不同品种黄颡鱼的30个试验样本进行扩增,将反应产物通过8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测,银染法染色进行显色筛选扩增产生的特异条带。由图2(SRAP分子标记鉴定三种不同品种黄颡鱼的差异条带结果图)可见,黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼相比,分别在100~250bp和250~1000bp处有多条特异性条带。然而,杂交子一代黄颡鱼(黄颡鱼♀×瓦氏黄颡鱼
Figure GDA0002572974690000061
)在100~250bp与250~1000bp处均存在亲本的特异性条带。通过本发明方法可以较为准确、快捷地区分出黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼与其杂交子一代黄颡鱼。同时,只要选取少量尾鳍作为实验样本,对鱼体的损伤较小。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
<120> 鉴定黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交子一代的SRAP分子标记、试剂盒和方法及应用
<140> 2020101756863
<141> 2020-03-13
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgagtccaaa ccggata 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gactgcgtac gaattgcg 18
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgagtccaaa ccggatt 17
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gactgcgtac gaattgca 18
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgagtccaaa ccggatc 17
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gactgcgtac gaattgct 18
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgagtccaaa ccggatg 17
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gactgcgtac gaattgcc 18
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgagtccaaa ccggaca 17
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gactgcgtac gaattgta 18
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgagtccaaa ccggact 17
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gactgcgtac gaattgtt 18
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgagtccaaa ccggacc 17
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gactgcgtac gaattgtc 18
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgagtccaaa ccggacg 17
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gactgcgtac gaattgtg 18

Claims (3)

1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物Me3和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物Em3在鉴定黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼及其杂交子一代中的应用,当所述正向引物和反向引物扩增黄颡鱼时,扩增产物在100~250bp有三条特异性条带;当所述正向引物和反向引物扩增瓦氏黄颡鱼时,扩增产物在250~1000bp有二条特异性条带;当所述正向引物和反向引物扩增杂交子一代黄颡鱼时,扩增产物在100~250bp和250~1000bp处均存在亲本的特异性条带。
2.基于权利要求1所述应用中正向引物和反向引物的鉴定黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼及其杂交子一代的SRAP分子标记方法,其特征在于,所述方法的反应体系每30μL包括:10×buffer3μL,dNTP 2.4μL,正向引物 1μL,反向引物 1μL,γ-Taq酶 0.2μL,待测样品的DNA模板 2μL和灭菌水 20.4μL。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述方法的PCR反应程序包括:94℃ 5min;94℃ 30s,38℃ 30s,72℃ 1min,共5个循环;94℃ 30s,52℃ 30s,72℃ 1min,共35个循环;72℃ 8 min。
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