CN109251995B - 一种鉴定西瓜果皮底色的caps分子标记及其应用 - Google Patents

一种鉴定西瓜果皮底色的caps分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明的CAPS分子标记在墨绿色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，CAPS分子标记在绿色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。用于检测所述的CAPS分子标记的引物组，由如SEQ ID NO:3所示的上游引物序列和SEQ ID NO:4所示的下游引物序列组成。用该引物组鉴定西瓜果皮底色，包括以下步骤：基因组DNA提取，PCR扩增，BccI酶酶切，电泳判断。本发明的CAPS分子标记特异性高，对105份西瓜种质资源进行果皮底色的鉴定，结果显示，该分子标记对墨绿色和绿色果皮底色鉴定的准确率为100%，说明该分子标记可快速准确的鉴定西瓜果皮底色，加速育种进程。

Description

一种鉴定西瓜果皮底色的CAPS分子标记及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于鉴定西瓜果皮底色的CAPS分子标记及其应用。
技术背景
在传统的植物育种过程中，由于难以获得植物后代的基因型，通常只能根据植物的表现型进行田间的筛选鉴定及后续的培育。这种选择耗时较长，容易受环境的影响，依赖于育种工作者的经验限制，导致育种时间较长且与基因型有偏离，选择效率低，选择准确性较差。分子标记辅助育种基于与相关基因连锁的分子标记或者基因本身特异性标记进行选择，效率高，准确性高，不受环境因素干扰，在生产上已经被证实是非常有经济效益的。通过分子标记辅助育种可快速的对目标性状的前景和遗传材料的背景进行选择，极大地提高选择效率，缩短育种时间。
西瓜是一种重要的园艺作物，作为世界十大水果之一在世界范围内广泛种植，我国是世界第一的西瓜生产和消费大国，加速西瓜产业育种过程具有重要的经济和生产意义。然而目前我国西瓜的育种过程仍以传统的与育种为主，可用于实际生产和育种的分子标记较少，育种效率较低，阻碍了西瓜的育种进程。早在上世纪三十年代末，Weetman(1937)等育种工作者就根据传统的遗传分析对西瓜果皮底色的遗传规律进行了预测。随着西瓜参考基因组的发布和高通量测序技术的发展，Yang(2015)通过构建遗传图谱的方法定位到三个独立的位点，提出了三点模型，及西瓜果皮颜色受三个独立的基因控制，即S(foregroundstripe) 控制果皮条纹，D(deep color vs.standard color)控制颜色深度，Dgo(background color)控制果皮背景颜色。西瓜绿色相关果皮底色(墨绿色、绿色)在西瓜品种中占主要地位，目前还未有关于区分墨绿色和绿色两种西瓜最常见果皮底色的分子标记的报道。
目前关于西瓜果皮底色的研究报道较少，西瓜果皮底色的选育工作主要还是通过传统的育种方法进行表型鉴定，效率低且易受环境影响。因此开展西瓜果皮底色的研究，开发与西瓜性状紧密连锁的分子标记，通过分子辅助育种可以极大地缩短育种工作的时间和提高育种选择的准确性。
发明内容
本发明目的在于提供一种可以快速准确地鉴定墨绿色和绿色果皮底色西瓜的CAPS 分子标记。本发明提供的分子标记具有检测方便、扩增产物稳定、特异性高的特点。
本发明的另一目的是提供一种检测上述标记的引物组。
本发明的再一目的是提供一种鉴定西瓜果皮底色的方法。
本发明的解决方案如下：
本发明提供一种鉴定西瓜果皮底色的CAPS分子标记，记为RC-1D，其在墨绿色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，在绿色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
本发明的CAPS分子标记RC-1D，在墨绿色和绿色果皮底色西瓜中的序列的395bp处存在一个G→C的SNP位点不同，本发明对比了大量西瓜品种的CAPS分子标记RC- 1D，结果证明其与果皮底色性状完全连锁，显示本发明提供的特异性分子标记RC-1D可用来鉴定西瓜墨绿色和/或绿色果皮底色。
因此，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的特异性分子标记RC-1D在鉴定西瓜果皮底色中的应用在本发明的保护范围内。
一种用于检测上述特异性分子标记RC-1D的引物组，引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；其中上游引物(SEQ ID NO:3)：5’-GCCCGCCTGTTGAAAATTCC- 3’；下游引物(SEQ ID NO:4)5’-CCAACGTTCCCTCTCCAACT-3’。
上述引物组可作为扩增CAPS分子标记的引物组，进而用于鉴定西瓜果皮底色，因此，所述引物组在鉴定西瓜墨绿色和/或绿色果皮底色中的应用在本发明的保护范围内。而且，包含上述的引物组、用于鉴定西瓜果皮底色的试剂盒也在本发明的保护范围内。
利用上述引物组鉴定西瓜果皮底色的方法，包括以下步骤：
步骤1：提取西瓜组织的基因组DNA；
步骤2：以上述的引物组对步骤1得到的基因组DNA进行PCR扩增；
步骤3：将步骤2的PCR扩增产物经BccI酶切后电泳，得到酶切产物；
步骤4：若酶切产物为715bp一条电泳条带或者715pb、403bp和312pb三条电泳条带，则该西瓜样品为墨绿色果皮底色，若得到403bp和312pb两条电泳条带则该西瓜为绿色果皮底色。
所述PCR扩增的反应体系为：2×PCR Mix 12.5μL、DNA 2μL、上游引物1.25μ L、下游引物1.25μL，补充去离子水至25μL。
所述PCR的反应程序为：94℃1min30sec；94℃20sec，57℃20sec，72℃50sec，共30个循环；72℃5min；4℃保存。
在墨绿色果皮底色和绿色果皮底色西瓜的核苷酸序列中，本发明的特异性CAPS分子标记RC-1D存在一个SNP位点变化(G→C)，绿色果皮底色的西瓜在该位点傍序列可被限制性内切酶BccI识别，酶切识别序列为CCATC(N)4。墨绿色果皮底色的西瓜因为发生 SNP变化，造成在该位点的序列GCATC(N)4无法被限制性内切酶BccI识别。PCR扩增产物经BccI限制性内切酶识别并酶切后，墨绿色纯合材料保持715bp的DNA片段大小，杂合材料有715bp、403bp和312bp三种大小的DNA片段；绿色果皮底色的西瓜被酶切为403bp、 312bp大小的DNA片段。所以，上述特异性CAPS分子标记RC-1D还可以用来检测西瓜材料关于果皮底色性状基因型的纯合度，本发明所述特异性CAPS分子标记RC-1D在鉴定西瓜墨绿色和/或绿色果皮底色性状基因型纯度中应用在本发明的保护范围内。
与现有技术相比，本发明具有以下积极有益效果：
1、本发明利用全基因组重测序技术(WGR)获得了控制西瓜果皮底色(墨绿色/绿色)性状的确切基因区间，并通过F2群体实现目的基因的精细定位，开发出与目的性状紧密连锁的 CAPS标记，该标记为共显性标记，可用于西瓜分子标记辅助选择育种，提高育种效率，加速育种过程。
2、本发明的CAPS分子标记RC-1D，特异性强，可用于鉴定墨绿色和绿色西瓜果皮底色，在鉴定过程中稳定性强，灵敏度高，不受环境因素的影响，可广泛地用于西瓜果皮底色的鉴定中，适合用于生产实践。
3、该方法适用于各个生育期的西瓜果皮底色的鉴定，特异性高、通量大，可在苗期鉴定出所需的植株，不仅节省了育种所需的人力物力，而且提高了育种的效率。
附图说明
图1为特异性CAPS分子标记RC-1D在105份西瓜种质资源中的验证结果图。图中电泳条带由左到右、从上至下依次对应表1中的1～105的西瓜品种，最后两个样品分别是亲本9904和Handel。
图2为特异性CAPS分子标记RC-1D在9904和Handel构建的F2群体中的部分验证结果图。图中有三条带的表示杂合植株。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特殊说明，本发明采用的试剂、方法和设备为为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1、鉴别西瓜果皮底色的CAPS分子标记和引物的开发
首先通过构建高密度遗传图谱进行皮色相关基因的精细定位，具体如下：通过对重组自交系126个单株及其亲本(9904为母本，Handel为父本)进行重测序，构建了一张西瓜高密度遗传图谱，亲本间共检测到178762个适用于RILs且深度不低于4X的SNP标记，图谱总长度1508.94cM，包含11个连锁群，Bin marker 2132个，平均图距为0.74cM。通过生物信息学分析定位到控制果皮底色性状的候选基因位于第8号染色体末端2.07Mb范围。通过设计CAPS标记和SNP标记进行精细定位，将控制西瓜果皮底色的基因定位到 CAPS20869654与SNP29901009标记间，在此区间在第29880100位碱基存在一个非同义 SNP突变位点，根据此位点在第8号染色体上获得了与西瓜果皮底色性状紧密连锁的分子标记RC-1D，其在墨绿果皮底色西瓜品种9904中的序列如SEQ ID NO:1所示，在绿色果皮底色西瓜品种Handel中的序列如SEQ ID NO.2所示，标记片段大小均为715bp，在395bp 处，存在一个G→C的SNP突变，分析发现其可用于鉴定西瓜果皮底色(墨绿色/绿色)。在绿色果皮底色西瓜中此SNP位点傍邻的序列具有限制性内切酶BccI的酶切识别位点： CCATC(N)4，而在墨绿色果皮底色西瓜中由于在酶切识别位点发生了SNP位点的突变 GCATC(N)4，导致无法被限制性内切酶BccI识别，因此可以通过上述CAPS分子标记RC- 1D去鉴定西瓜果皮底色，当BccI可识别酶切位点时，绿色果皮底色西瓜的目标DNA条带会被切成403bp和312bp大小的两个DNA片段，而墨绿色果皮底色的西瓜不会被限制性内切酶识别，而保持715bp大小的DNA片段。当鉴定的育种材料的果皮底色性状不是纯合的时候，会出现三条DNA条带(715bp、403bp、312bp)，因此该标记可用于鉴定育种材料的果皮底色性状的纯度。
通过对比CAPS分子标记RC-1D在Handel和9904中的序列，设计如下用于PCR扩增CAPS分子标记的引物：
上游引物：5’-GCCCGCCTGTTGAAAATTCC-3’(SEQ ID NO:3)，
下游引物：5’-CCAACGTTCCCTCTCCAACT-3’(SEQ ID NO:4)，
PCR扩增的反应体系为：2×PCR Mix 12.5μL、DNA 2μL、上游引物1.25μL、下游引物1.25μL，补充去离子水至25μL。
PCR的反应程序为：94℃1min30sec；94℃20sec，57℃20sec，72℃50sec，共30 个循环；72℃5min；4℃保存。
实施例2、利用上述CAPS分子标记鉴定西瓜果皮底色的方法
1、西瓜样本基因组DNA的提取
采用常规的CTAB方法对西瓜叶片进行基因组DNA提取，去除RNA污染，用紫外分光光度计检测DNA样品在260nm、280nm处的OD值，测定DNA浓度及OD260/280，选择OD260/280在1.8～2.0的高质量DNA样品，浓度稀释到100ng/μL。
2、PCR扩增
以实施例1中的用于扩增CAPS分子标记的引物组对上述西瓜样品基因组DNA进行扩增； PCR扩增的反应体系为：2×PCR Mix 12.5μL、DNA 2μL、上游引物1.25μL、下游引物1.25μL、补充去离子水至25μL。
PCR的反应程序为：94℃1min30sec；94℃20sec，57℃20sec，72℃50sec，共30 个循环；72℃5min；4℃保存。
3、酶切鉴定
对上述的PCR扩增产物使用限制性内切酶BccI进行酶切，酶切反应结束后取6μL酶切产物在1.2％的琼脂糖凝胶上进行电泳分离鉴定，溴化乙锭(EtBr)染料染色，然后在凝胶成像仪上观察、记录鉴定结果。
实施例3、上述CAPS分子标记对105份西瓜种质资源果皮底色表型的验证
以中国农业科学院郑州果树研究所收集的105份西瓜种质资源为材料，利用本发明得到的 CAPS分子标记，采用实施例2中的方法对105份西瓜种质资源的进行果皮底色鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果见图1。鉴定结果显示，105份西瓜种质资源材料的表型与电泳结果的条带类型相符合，准确性100％。因此本发明的CAPS分子标记可用来鉴定西瓜果皮底色。
上述105份种质资源中墨绿色果皮底色的西瓜31份，绿色果皮底色的西瓜74份，具体品种及表型见表1，其中墨表示墨绿色，绿表示绿色。
表1 105份西瓜种质资源的果皮底色
Figure BDA0001861879190000051
Figure BDA0001861879190000061
实施例4、上述CAPS分子标记对9904和Handel构建的F2群体的果皮底色的纯度鉴定
以9904(母本)和Handel(父本)构建的F2群体中的42份西瓜植株为材料，利用本发明得到的CAPS分子标记，采用实施例2中的方法对42份西瓜资源的进行果皮底色鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果见图2。鉴定结果显示，该42份材料中，有20份含有三条电泳条带，为杂合植株，果皮底色为墨绿色，有12份含有与母本条带大小一致的单个电泳条带，为墨绿色果皮底色，有10份含有与父本条带大小一致的两条电泳条带，为绿色果皮底色。
综上所述，本发明的特异性CAPS分子标记RC-1D能够对西瓜果皮底色进行大规模鉴定，在苗期就可以进行过快速鉴定，可有效的提高育种效率。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 一种鉴定西瓜果皮底色的CAPS分子标记及其应用
<130> 无
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 715
<212> DNA
<213> 西瓜（Citrullus lanatus）
<400> 1
gcccgcctgt tgaaaattcc ttgatggatt tagacagata tttatagtcc tcggcaaggc 60
cataaccaga tgcgactggg acaacgatgt tgttgatcat ccattccttg catagaggaa 120
gttcaggaga aacaagcaaa ataagtaggg gctttagagg taaacactga gtagagactc 180
tgctaaattt gaagtgtgca ccacacataa aaaatttagg ccttcacaca aaagtacctg 240
aatagcagca gtagtcggtt gtgtagtctt gttaaagtcg agaattgata ccttactacc 300
tggaaagacc acttgaattt tgtaactgaa tgaccatgtt aacaatcaag aaggaccaaa 360
aaaaaaaaac aaaaaccttc ttttagtact ctacgcatct cctctaatgc tctccgttta 420
tccaccacat ttcgtagacc gtagcccatt gtaatggcat cgaaagagcc gtcaggaaat 480
ggcaaattga gtgcatcacc ctccacccac cttcactttg gcagcagcgt tattaggttg 540
ttaatttcac aaatcaatta ccaattacaa ttctcactga agcaaaactg tatcgtgaaa 600
tacacagagg aatgcttcaa tattttcaaa atagtagagg ccaacacatt aattgttcaa 660
gtttagtaat gctcactcaa tgttgtcata gcaggagttg gagagggaac gttgg 715
<210> 2
<211> 715
<212> DNA
<213> 西瓜（Citrullus lanatus）
<400> 2
gcccgcctgt tgaaaattcc ttgatggatt tagacagata tttatagtcc tcggcaaggc 60
cataaccaga tgcgactggg acaacgatgt tgttgatcat ccattccttg catagaggaa 120
gttcaggaga aacaagcaaa ataagtaggg gctttagagg taaacactga gtagagactc 180
tgctaaattt gaagtgtgca ccacacataa aaaatttagg ccttcacaca aaagtacctg 240
aatagcagca gtagtcggtt gtgtagtctt gttaaagtcg agaattgata ccttactacc 300
tggaaagacc acttgaattt tgtaactgaa tgaccatgtt aacaatcaag aaggaccaaa 360
aaaaaaaaac aaaaaccttc ttttagtact ctacccatct cctctaatgc tctccgttta 420
tccaccacat ttcgtagacc gtagcccatt gtaatggcat cgaaagagcc gtcaggaaat 480
ggcaaattga gtgcatcacc ctccacccac cttcactttg gcagcagcgt tattaggttg 540
ttaatttcac aaatcaatta ccaattacaa ttctcactga agcaaaactg tatcgtgaaa 600
tacacagagg aatgcttcaa tattttcaaa atagtagagg ccaacacatt aattgttcaa 660
gtttagtaat gctcactcaa tgttgtcata gcaggagttg gagagggaac gttgg 715
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcccgcctgt tgaaaattcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccaacgttcc ctctccaact 20

Claims (9)

1.一种鉴定西瓜果皮底色的CAPS分子标记，其特征在于，所述的CAPS分子标记在墨绿色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，CAPS分子标记在绿色果皮底色西瓜中的核苷酸序列如 SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的分子标记在鉴定西瓜墨绿色和/或绿色果皮底色中的应用。
3.一种用于检测权利要求1所述的CAPS分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组由如SEQ ID NO:3所示的上游引物序列和SEQ ID NO:4所示的下游引物序列组成。
4.权利要求3所述的引物组在鉴定西瓜墨绿色和/或绿色果皮底色中的应用。
5.用于鉴定西瓜果皮底色的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求3所述的引物组。
6.利用权利要求3所述引物组鉴定西瓜果皮底色的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：提取西瓜组织的基因组DNA；
步骤2：以权利要求3所述的引物组对步骤1得到的基因组DNA进行PCR扩增；
步骤3：将步骤2的PCR扩增产物经BccI酶切后电泳，得到酶切产物；
步骤4：若酶切产物为715bp一条电泳条带或者715pb、403bp和312pb三条电泳条带，则该西瓜样品为墨绿色果皮底色，若得到403bp和312pb两条电泳条带则该西瓜为绿色果皮底色。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：2×PCR Mix12.5μL、 DNA 2μL、上游引物1.25μL、下游引物1.25μL，补充去离子水至25μL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应程序为：94℃ 1min30sec；94℃ 20sec，57℃ 20sec，72℃ 50sec，共30个循环；72℃ 5min；4℃保存。
9.权利要求1所述CAPS分子标记在鉴定西瓜果皮底色性状基因型纯度中的应用，所述的果皮底色为墨绿色和/或绿色。
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