CN112280882B - 西瓜网纹果皮覆纹特征snp位点、其caps分子标记、引物及应用 - Google Patents

西瓜网纹果皮覆纹特征snp位点、其caps分子标记、引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种西瓜网纹果皮覆纹特征SNP位点、其CAPS分子标记、引物及应用。所述西瓜网纹果皮覆纹特征的SNP位点为西瓜基因组6号染色体上第25950735位核苷酸G→A；所述CAPs标记的引物组包括正向引物5’‑TGGACTTCTAAATCGGATTCTC‑3’、反向引物5’‑TTCTTAACGGTTTCTTCTTGGT‑3’。所述SNP位点或CAPS分子标记及其引物能够应用于西瓜果皮覆纹特征的鉴定和辅助筛选育种。本发明所确认的SNP位点和CAPS标记具有快速、直接、特异性高等特点，可在较短时间内完成大批量西瓜网纹果皮覆纹特征材料的筛选好预测工作，可有效服务于西瓜果皮覆纹特征育种工作。

Description

西瓜网纹果皮覆纹特征SNP位点、其CAPS分子标记、引物及 应用
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种西瓜网纹果皮覆纹特征SNP(单核苷酸多态性)位点、其CAPS分子标记、引物及应用。
背景技术
果皮覆纹特征是西瓜最为重要的外观品质性状之一，在一定程度上会影响消费者的购买需要，从而影响市场销量。肖光辉（2012）综述了果皮花纹相关的基因，斑驳果皮基因m产生具有绿白色斑点的中-深绿色果皮(Weetman., 1937)，基因p控制本色果皮上很窄的线条，研究还发现了间歇性条纹基因ins（Gusmini et al., 2006），说明了果皮覆纹特征性状的复杂性。随着西瓜全基因组测序的完成（Luo et al., 2013），Gama等（2014）发现了两个与西瓜果皮覆纹特征（clearly defined or diffuse）连锁的SSR标记，均位于6号染色体上。韦小敏等（2016）开发了鉴定齿条和网纹果皮覆纹特征的的In Del分子标记。
然而西瓜表型变异丰富，常见的果皮覆纹特征有网纹、条带、齿条、放射条、黑皮（参见图1）等。当前，在涉及果皮覆纹特征的选择育种过程中，尚缺乏有效的此类分子标记。
发明内容
为解决上述西瓜果皮覆纹特征育种过程中有效的分子标记缺乏的技术问题，本发明提供了一种西瓜网纹果皮覆纹特征SNP位点、其CAPS分子标记、引物及应用。
本发明的第一个方面提供了一种用于检测西瓜网纹果皮覆纹特征的SNP位点，所述SNP位点为西瓜基因组（http://cucurbitgenomics.org/organism/1）6号染色体上第25950735位核苷酸G → A。
本发明的第二个方面提供了一种用于检测西瓜网纹皮覆纹特征的CAPS标记，其引物核苷酸序列如下所示：
上游引物：5’- TGGACTTCTAAATCGGATTCTC -3’
下游引物：5’- TTCTTAACGGTTTCTTCTTGGT -3’。
进一步的，所述SNP位点的CAPS分子标记的限制性内切酶，所述引物酶切反应所用限制性内切酶为EcoRII。
本发明的第三个方面，提供了一种CAPS标记鉴定西瓜网纹果皮覆纹特征的方法：
提取西瓜叶片全基因组DNA；
利用所述CAPS标记的引物对西瓜基因组DNA进行PCR扩增；
酶切PCR扩增产物；
电泳酶切产物，根据酶切产物的带型判断西瓜果皮覆纹特征的表型，网纹果皮覆纹特征显示177bp的带型，其它果皮覆纹特征显示82bp和95bp两条带或者82bp、95bp和177bp三条带。
设计一种鉴定西瓜网纹果皮覆纹特征的试剂盒，包括所述引物、限制性内切酶EcoRII。
本发明具有积极有益的技术效果：
本发明所确认的SNP位点和CAPS标记具有快速、直接、特异性高等特点，可在较短时间内完成大批量西瓜网纹果皮覆纹特征材料的筛选好预测工作，可有效服务于西瓜果皮覆纹特征育种工作。
附图说明
图1为西瓜多样化的果皮覆纹特征对比照片。
图2为果皮覆纹特征（网纹是否）的全基因组关联分析图谱。
图3 利用网纹果皮覆纹特征CAPS标记的引物在部分西瓜资源基因组DNA中的扩增结果照片，方框中条带为目的条带。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中所涉及的原料，如无特别说明均为市售，所涉及检测方法如无特别说明，则均为常规方法。
实施例1西瓜网纹果皮覆纹特征SNP位点的获取
本发明以中国农业科学院郑州果树研究所“国家西瓜甜瓜中期库”挑选的1022份西瓜种质资源为样品，利用Illumina HiSeq4000测序仪进行简化基因组测序，获得142.19Gb 数据，覆盖到参考基因组的平均覆盖度为3.54%，覆盖到的区域平均测序深度为6.3X。通过鉴定筛选最终获得121405个SNP标记位点。把1022份西瓜资源按照果皮覆纹特征为网纹是否分为两类作为表型进行GWAS（全基因组关联分析），得到了和西瓜果皮覆纹特征相关的候选区域，位于西瓜基因组6号染色体的第25547784位核苷酸和第26782244位核苷酸之间（图2）。
实施例2 网纹果皮覆纹特征CAPS标记引物的设计与鉴定
结合部分资源的深度重测序结果挖掘候选区域内峰值附近的SNP和InDel位点，并开发共显性的分子标记在资源中进行验证，最终获得本发明用于检测西瓜网纹皮覆纹特征的CAPS标记，其引物序列如下（参见序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2）：
上游引物：5’- TGGACTTCTAAATCGGATTCTC -3’
下游引物：5’- TTCTTAACGGTTTCTTCTTGGT -3’。
利用上述分子标记鉴定西瓜网纹果皮覆纹特征的方法，主要包括以下步骤：
（1）利用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
取1 g新鲜叶片放入研钵，加入液氮研成粉末状，随即转入加有1 ml CTAB 抽取液的离心管中，使二者充分混匀，然后置于65℃恒温水浴60 min，其间颠倒混合2～3次；
Figure DEST_PATH_IMAGE002
从水浴锅取出后，8000 rpm离心1 min；
Figure DEST_PATH_IMAGE003
取上清液置于另一离心管中，加等体积的氯仿：异戊醇（24：1，V/ V），轻轻颠倒使其充分混匀；
Figure DEST_PATH_IMAGE004
10000 rpm离心5 min，取上清液（尽量不取到中层沉淀）；
Figure DEST_PATH_IMAGE005
加入0.7倍体积的异丙醇（需提前预冷30 min），混匀后置于-20°C冷冻不超过30 min让DNA析出；取出后10000 rpm离心5 min，留沉淀弃上清液；
Figure DEST_PATH_IMAGE006
用无水乙醇清洗沉淀数次，倒掉浸泡液，打开离心管盖子晾干；
Figure DEST_PATH_IMAGE007
加入200 μl的蒸馏水溶解DNA；用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20°C冰箱中保存备用。
（2） PCR反应体系和程序
反应体系如下：西瓜叶片总DNA (100ng/μl) 1μl、Forward primer (10μmol/L) 1μl、Reverse primer (10μmol/L) 1 μl、2×Power Taq PCR MasterMix 12.5 μl、ddH2O9.5 μl。
PCR反应程序为：94℃ 5分钟，35个循环的94℃ 20秒钟、55℃ 1分钟、72℃ 30秒、72℃ 5分钟。
（3）酶切反应和程序
反应体系为：PCR产物5μl， EcoRII限制性内切酶0.5μl，10×buffer 1.5 μl，ddH2O 8 μl；
反应程序为：65℃恒温处理10小时；
（4）对酶切产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。
Figure 316525DEST_PATH_IMAGE001
试剂配制：
A．5×TBE ：
Tris-base 53.9克
EDTA　 3.72克
硼酸 27.5克
用蒸馏水定容至1升。
B. 40%聚丙烯酰胺溶液：
聚丙烯酰胺 193.34克
甲叉双丙烯酰胺 6.66克
用蒸馏水定容至500毫升。
C. 8%聚丙烯酰胺凝胶（现配现用）：
40%聚丙烯酰胺溶液 10毫升
5 × TBE 5毫升
10% 过硫酸铵（APS） 200微升
四甲基乙二胺（TEMED） 80微升
蒸馏水 22毫升
D. 银染液：
硝酸银 1克
冰醋酸 5毫升
无水乙醇 50毫升
用去离子水定容至500毫升。
E. 显影液：
氢氧化钠 15克
甲醛（37%） 2.5毫升
用去离子水定容至500毫升。
Figure 499244DEST_PATH_IMAGE002
凝胶板准备：玻璃板用蒸馏水洗净、晾干后，用浸泡过无水乙醇的脱脂棉球擦拭，晾干。将凹板和平板叠合紧密后放入制胶器中压紧并扣好其两边的夹子（一个制胶器可制作两板凝胶）。在洗瓶内配置8%聚丙烯酰胺凝胶溶液（两份），混匀后快速注入两板中间的缝隙内，注满后插入有齿的梳子（不要让梳子齿的下方产生气泡）；若此时液面有所下降，可用移液器吸取未凝固的溶液来补充。等待溶液充分凝固。
Figure 810140DEST_PATH_IMAGE003
电泳：将制胶器支架从底座上取下，直接放入配套的电泳槽中，在电泳槽底部及支架上两块玻璃板中间倒入适量的1×TBE缓冲液。在PCR产物中加入0.2倍体积的6×DNALoading Buffer，混匀后取0.8微升加入点样孔内，260伏电泳35分钟。
Figure 470928DEST_PATH_IMAGE004
染色和显影：电泳完成后，从电泳槽中取出玻璃板，撬去凹板，凝胶会贴附于平板上，凝胶面向上将平板放入银染液中，置于脱色摇床上轻摇15分钟，凝胶会自动脱落下来；银染完毕，将凝胶取出放入去离子水中清洗10秒；清洗完毕后将凝胶转入显影液中，轻摇摇床，待条带清晰后取出凝胶，放置在阅片器上肉眼观察条带的位置差异，并拍照保存。
Figure 816459DEST_PATH_IMAGE005
带型判读：将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，肉眼观察两亲本条带的位置差异。
实施例3 CAPS标记在西瓜种质中的鉴定和验证
网纹果皮覆纹特征CAPS标记在西瓜果皮覆纹特征鉴定中的应用，主要步骤如下：
（1）利用实施例2所记载的CAPS分子标记和方法步骤对62份已知果皮覆纹特征的西瓜种质进行基因型鉴定。
（2） 根据酶切产物电泳结果，若仅得到177bp的带型，则待测材料表现为网纹果皮覆纹特征；若仅得到82bp和95bp的两条带，则待测材料表现为非网纹果皮覆纹特征；若得到82bp、95p、177bp的三条带，则待测材料表现为非网纹果皮覆纹特征；参见图3。
（3）鉴定结果
62份西瓜种质的检测结果显示，40份表现网纹基因型（仅177bp的一条带），22份表现非网纹基因型（82bp和95bp的两条带或82bp、95bp、177bp的三条带）。种质的表型结果显示，40份表现网纹基因型的资源全部为网纹，22份表现非网纹基因型的资源有13份表现为齿条、7份表现条带，1份表现放射条，1份表现黑皮（表1）。62份西瓜种质表型与基因型的符合率达到100%。
以上的结果足以说明以本发明网纹果皮覆纹特征CAPS标记来预测西瓜果皮覆纹特征，可以显著提高西瓜果皮覆纹特征育种的选择效率，从而加速育种进程，实现西瓜果皮覆纹特征的定向遗传改良。
表1 CAPS标记在西瓜种质中的鉴定和验证
Figure DEST_PATH_IMAGE009
续表1 CAPS标记在西瓜种质中的鉴定和验证
Figure DEST_PATH_IMAGE010
。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 西瓜网纹果皮覆纹特征SNP位点、其CAPS分子标记、引物及应用
<130> /
<160> 2
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tggacttcta aatcggattc tc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcttaacgg tttcttcttg gt 22

Claims (4)

1.一种西瓜网纹果皮覆纹特征SNP标记，其特征在于，其为http://cucurbitgenomics.org/organism/1中所记载的西瓜基因组6号染色体上第25950735位核苷酸由非网纹果皮覆纹特征的G 突变为网纹果皮覆纹特征的A。
2.一种鉴定西瓜网纹果皮覆纹特征的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a. DNA提取：利用CTAB法提取西瓜两片真叶期叶片总DNA；
b. PCR扩增：
反应体系为：100 ng/μL的西瓜叶片总DNA 1μl、上游引物1μl、下游引物1μl、2×Power TaqPCR MasterMix 12.5μl、ddH2O 9.5μl；所述上游引物序列为：5’- TGGACTTCTAAATCGGATTCTC-3’，所述下游引物序列为：5’- TTCTTAACGGTTTCTTCTTGGT -3’；
反应程序为：94℃ 5 min，35个循环的94℃ 20 s、55℃ 1 min、72℃ 30 s、72℃ 5min；
c. 酶切反应体系和程序：
反应体系为：PCR产物5μl，EcoRII限制性内切酶0.5μl，10×buffer 1.5 μl，ddH2O 8μl；
反应程序为：65℃恒温处理10小时；
d.电泳图谱分析：对所述酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读，找到目标条带，根据所述扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型，网纹果皮覆纹特征显示177p的条带，其它果皮覆纹特征显示82bp和95bp两条带或者82bp、95bp和177bp三条带。
3.权利要求1所述SNP标记在鉴定和辅助筛选西瓜果皮覆纹特征育种中的应用。
4.一种鉴定西瓜网纹果皮覆纹特征的试剂盒，包括权利要求2中所述引物、限制性内切酶EcoRII。
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