TWI458829B

TWI458829B - 鑑定國內外稻米品種之方法

Info

Publication number: TWI458829B
Application number: TW101146175A
Authority: TW
Inventors: Men Chi Chang; Huu Sheng Lur; Hsue Yu Chuang
Original assignee: Univ Nat Taiwan
Priority date: 2012-12-07
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2014-11-01
Also published as: TW201422818A

Description

鑑定國內外稻米品種之方法

本發明係關於一種利用分子標誌作為稻米品種鑑定之方法，特別是關於一種利用新穎引子組多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(Multiplex SNP PCR)偵測單一核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism,SNP)以鑑別國內外稻米品種之方法。

稻米是國人的主食，也是種植面積最廣、農戶數最多的產業。台灣自2002年加入世界貿易組織(WTO)後，國外稻米可依關稅配額進口上市銷售，市售白米種類越來越多，對國內的稻米產業產生相當程度的衝擊。現階段政府積極推動稻米產業以「品種、品質、品牌」之三品策略，以提高國產稻米競爭力；三品策略中，稻米之「品種」純度是源頭，最為重要。因此，目前國內稻作為維持稻米優良品種之遺傳性及品質，農委會設有三級繁種制度以確保稻米種子的優良性，即透過原原種、原種、採種，計畫性的逐級增加優良種子數。

在田間造成品種內的變異性除來自突變、花粉汙染、種內異質性經多代後分離與種子混雜，在三級繁殖制度下亦可能產生遺傳變異。而農民整地後向育苗場購買秧苗進行插秧，之後經過補植、雜草防除、施肥、排灌水以及病蟲害防治等田間操作。稻穀田間收穫後運送至由碾米廠進行低溫乾燥、低溫倉儲、壟穀、色彩選別、精白和包裝等調製過程，最後上市販售，這些人為操作與調製的過程都有可能造成稻米品種的混雜。另外，有些不削的商人為提高銷售價格，刻意將價格較高的稻米品種內混雜其他較低廉的品種以增加收入。

過去稻米品種之鑑定多仰賴外觀表型，種子蛋白的組成、同功酶或酵素活性的區別等。然而由於此些型態、生理以及生化上的指標易受品種、環境乃至品種與環境間交錯之影響並不穩定，再現性也差。因此，針對品種間之遺傳組成相關的分子標記技術具有較佳之重複性及再現性，遂成為許多作物於種子純度檢查和品種鑑定的最佳工具。

隨著遺傳學的進展和分子生物學的興起，分子標記技術不斷演化改進，包括有限制片段長度多型性分析法(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、隨機增幅多型性核酸分子分析法(random amplified polymorphic DNA,RAPD)、增幅片段長度多型性分析法(amplified fragment length polymorphism,AFLP)、單一重覆性序列法(microsatellite或simple sequence repeat,SSR)、簡單序列重複區間(Inter-Simple Sequence Repeat,ISSR)以及序列插入與刪除標記(insertion/deletion,In/Del)等，其中以SSR/ISSR分子標記相關技術最為普遍，主要是以1至5個核苷酸為基本單位的串聯重複序列，其長度多在100至200bps。微衛星(microsatellite)DNA分佈於整個基因體的不同位點，因重複單位的大小和序列不同以及重複數不同，從而構成豐富的多型性。但由於核心序列重複數目不同，因而增幅出不同長度的PCR產物，是現今檢測DNA多型性的常用方法之一。該技術雖可判定國內外不同稻米品種，其係利用不同引子對經PCR反應後，針對各稻米品種因其基因體的簡單序列重複(simple sequence repeat)之數量不同所致產物大小的差異，進行高解析度電泳分析，由於生物體內相同類型之簡單重複序列多會普遍存在於基因體中，因此進行PCR時這些辨別簡單重複序列之引子可能會同時黏合在基因體之不同位置上，因此該分析過程極易發生非特異性(nonspecific)PCR產物的出現，使得電泳膠的背景複雜而干擾電泳帶(band)的判斷、有些品種間其重複數量差異太少或是混米小於10%導致無法以肉眼觀看並區別電泳膠片上DNA片段長度的差別等問題，而導致誤判稻米品種之情況。另一方面，國內米由於育種過程使用之親本極為接近，尤其是梗稻，由於早期台灣稻種多自日本引種，且主要親本多有侷限，親緣關係甚為接近，遺傳多樣性(genetic diversity)約為4/1000(0.4%)，以傳統SSR分子標誌並不容易加以區分出親緣關係相近之稻米品種，以致時有誤判之情形發生。因此該些分子標誌在稻米品種判別上仍有親緣太近之品種不易區分以及無法百分之百確認所測米樣品種等缺點。

單一核苷酸多型性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是指同一位點的不同等位基因之間個別核苷酸的差異，這種差異包括單個鹼基的缺失或插入，最常見的是單一核苷酸的置換，且常發生在嘌呤(A與G)或嘧啶(C與T)之間。SNP標記可區分兩個個體間遺傳物質的差異，被認為是應用前景最好的遺傳標記。SNP正迅速的取代SSR作為DNA分子標記在植物育種和遺傳學應用的首選技術，因為SNP具有豐富、穩定、適合自動化、高效，而且越來越具有成本效益等諸多優勢。近期逐漸發展出高通量和多重單一核苷酸多型性(Multiplex SNP)的方法，以SNP的技術為背景，將多個相容的標記合併，將多對SNP引子於單一反應中完成增幅，也就是於一個PCR反應中同時偵測多個位點的多型性，高通量且適合自動化分析。在先前技術中，已發展出10個SNP多重引子組(10-plex)和15個SNP多重引子組(15-plex)，但10-plex引子組主要是針對國內稉稻品種篩選SNP分子標記，所以對國內秈稻品種鑑別力較差。而15-plex引子組是以四引子擴增受阻突變體系聚合酶鏈鎖反應(Tetra-primer ARMS-PCR)進行偵測，是刻意將偵測同一位點SNP變化得到之PCR產物，使其中產物之等位基因特異性(allele specific)DNA電泳帶大小差異至少相差1.5倍以上以利SNP的判別，但是由需要對15個位點分別進行聚合酶連鎖反應後才能完全判別待測稻米品種，頗為耗時。而10-plex引子組15-plex引子組皆有無法鑑別之品種，兩者必需互相搭配使用。

據此，本發明提供一種鑑定國內外稻米品種之方法，係利用新穎的12個SNP多重引子組，其引子組於單一反應中進行多重單一核苷酸點圖變多型性聚合酶鏈鎖反應，更加便利且提升稻米鑑定技術之準確性及靈敏度，可同時鑑定國內外50種稻米品種。本發明可獎勵優良米廠生產高品種純率的良質品種標示米；同時由於稻米品種檢測技術之開發，配合市售稻米之抽檢及標示，逐步使稻米市場走向分級銷售制度，也有利稻米產銷專業區之建立，提昇國產米之區隔性和競爭力。

為達上述目的，本發明提供一種鑑定國內外稻米品種之方法，其步驟包含：(1)利用一引子組並藉由多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(Multiplex SNP PCR)增幅(amplify)複數種已知品種稻米之基因體DNA中包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：12所示核酸序列中具有一單一核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點之片段，以獲得該些已知品種稻米經該引子組增幅所得各PCR產物之片段長度；(2)利用一引子組並藉由多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(Multiplex SNP PCR)增幅(amplify)一待測稻米之基因體DNA，以獲得該待測稻米經該引子組增幅所得各PCR產物之片段長度；以及(3)以該待測稻米經該引子組增幅所得各PCR產物之片段長度比對步驟(1)該些已知品種稻米經該引子組增幅所得各PCR產物之片段長度，藉以鑑別出該待測稻米之品種，其中，該引子組係選自由第一引子組(SEQ ID NO：13與SEQ ID NO：14)、第二引子組(SEQ ID NO：15與SEQ ID NO：16)、第三引子組(SEQ ID NO：17與SEQ ID NO：18)、第四引子組(SEQ ID NO：19與SEQ ID NO：20)、第五引子組(SEQ ID NO：21與SEQ ID NO：22)、第六引子組(SEQ ID NO：23與SEQ ID NO：24)、第七引子組(SEQ ID NO：25與SEQ ID NO：26)、第八引子組(SEQ ID NO：27與SEQ ID NO：28)、第九引子組(SEQ ID NO：29與SEQ ID NO：30)、第十引子組(SEQ ID NO：31與SEQ ID NO：32)、第十一引子組(SEQ ID NO：33與SEQ ID NO：34)以及第十二引子組(SEQ ID NO：35與SEQ ID NO：36)所組成之族群；其中該已知品種稻米係選自由台稉2號(Taikeng 2，TK2)、台稉4號(Taikeng 4，TK4)、台稉5號(Taikeng 5，TK5)、台稉8號(Taikeng 8，TK8)、台稉9號(Taikeng 9，TK9)、台稉14號(Taikeng 14，TK14)、台稉16號(Taikeng 16，TK16)、高雄139號(Kaohsiung 139，KH139)、高雄145號(Kaohsiung 145，KH145)、桃園1號(Taoyuan 1，TY1)、桃園3號(Taoyuan 3，TY3)、台南11號(Tainan 11，TN11)、台農71號(Tainung 71，TNG71)、花蓮19號(Hualien 19，HL19)、花蓮20號(Hualien 20，HL20)、日本越光(Koshihikari)、桃園糯2號(Taoyuan glutinous 2，TYW2)、台秈2號(Taichung sen 2，TS2)、台中秈10號(Taichung sen10，TC S10)、台農秈22號(Tainung sen 22，TNGS22)、台中再來一號(Taichung Native 1，TN1)、泰國 Jasmine85、高雄141號(Kaohsiung 141，KH141)、高雄142號(Kaohsiung 142，KH142)、高雄143號(Kaohsiung 143，KH143)、高雄144號(Kaohsiung 144，KH144)、高雄146號(Kaohsiung 146，KH146)、高雄147號(Kaohsiung 147，KH147)、桃園4號(Taoyuan 4，TY4)、台南13號(Tainan 13，TN13)、台南14號(Tainan 14，TN14)、台東30號(Taitung 30，TT30)、台東32號(Taitung 32，TT32)、台農74號(Tainung 74，TNG74)、台農75號(Tainung 75，TNG75)、台農84號(Tainung 84，TNG84)、台中192號(Taichung 192，TC192)、台中194號(Taichung 194，TC194)、花蓮21號(Hualien 21，HL21)、苗栗1號(Miaoli 1，ML1)、台稉糯1號、(Taikeng glutinous 1，TKW1)、台稉糯3號(Taikeng glutinous 3，TKW3)、台稉糯12號(Taikeng glutinous 12，TKW12)、台東糯31號(Taitung glutinous 31，TTW31)、台農糯73號(Tainung glutinous 73，TNGW73)、台中秈17號(Taichung sen17，TC S17)、台農秈14號(Tainung sen 14，TNGS14)、台農秈糯21號(Tainung sen glutinous 21，TNGSW21)、台中秈糯1號(Taichung sen glutinous 1，TCSW1)及台中秈糯2號(Taichung sen glutinous 2，TCSW2)所組成之族群。

本發明提供一種鑑定國內外稻米品種之方法，利用一引子組並藉由多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應增幅一待測稻米之基因體DNA，其中該引子組之濃度為：第一引子組(SEQ ID NO：13與SEQ ID NO：14)係為1.0 μM、第二引子組(SEQ ID NO：15與SEQ ID NO：16)係為1.0 μM、第三引子組(SEQ ID NO：17與SEQ ID NO：18)係為1.6 μM、第四引子組(SEQ ID NO：19與SEQ ID NO：20) 係為3.0μM、第五引子組(SEQ ID NO：21與SEQ ID NO：22)係為1.0μM、第六引子組(SEQ ID NO：23與SEQ ID NO：24)係為2.0μM、第七引子組(SEQ ID NO：25與SEQ ID NO：26)係為4.0μM、第八引子組(SEQ ID NO：27與SEQ ID NO：28)係為2.0μM、第九引子組(SEQ ID NO：29與SEQ ID NO：30)係為4.0μM、第十引子組(SEQ ID NO：31與SEQ ID NO：32)係為2.0μM、第十一引子組(SEQ ID NO：33與SEQ ID NO：34)係為2.0μM以及第十二引子組(SEQ ID NO：35與SEQ ID NO：36)係為3.0μM。且之反應條件為先以94℃反應15分鐘，再以94℃，30秒、55℃，90秒、72℃，90秒為一循環，並重複此循29次後，溫度調整至60℃反應30分鐘。且稻米之基因體DNA係來自稻米之種子之胚乳或稻米種子萌芽後之植株。

本發明又提供一種可鑑別國內外稻米品種之引子組，係以一稻米之基因體DNA為模板(template)並經由藉由一聚合酶連鎖反應而獲得具有單一核苷酸多型(SNP)位點之片段長度，其中該引子組係選自由第一引子組(SEQ ID NO：13與SEQ ID NO：14)、第二引子組(SEQ ID NO：15與SEQ ID NO：16)、第三引子組(SEQ ID NO：17與SEQ ID NO：18)、第四引子組(SEQ ID NO：19與SEQ ID NO：20)、第五引子組(SEQ ID NO：21與SEQ ID NO：22)、第六引子組(SEQ ID NO：23與SEQ ID NO：24)、第七引子組(SEQ ID NO：25與SEQ ID NO：26)、第八引子組(SEQ ID NO：27與SEQ ID NO：28)、第九引子組(SEQ ID NO：29與SEQ ID NO：30)、第十引子組(SEQ ID NO：31與SEQ ID NO：32)、第十一引子組(SEQ ID NO： 33與SEQ ID NO：34)以及第十二引子組(SEQ ID NO：35與SEQ ID NO：36)所組成之族群，且該些引子組分析數種已知稻米品種及一待測待測稻米後進行比對，藉以鑑別出該待測稻米之品種。其中該已知品種稻米係上述50種稻米品種。且該聚合酶連鎖反應係使用該引子組分別進行聚合酶連鎖反應或使用該引子組同時進行多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(Multiplex SNP PCR)。

本發明另提供一種可鑑別國內外稻米品種方法，其步驟包含：(1)分析數種已知品種稻米之基因體DNA，以一聚合酶鏈鎖反應檢測12個單一核苷酸多型性之基因型，該些單一核苷酸多型性係位SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：12所組成之核酸序列中；(2)分析一待測稻米之基因體DNA，以一聚合酶鏈鎖反應檢測12個單一核苷酸多型性之基因型，該些單一核苷酸多型性係位於SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：12所組成之之核酸序列中；以及(3)該待測稻米經所得該12個單一核苷酸多型性之基因型比對步驟1該些已知品種稻米的該12個單一核苷酸多型性之基因型，藉以鑑別出該待測稻米之品種，其中SEQ ID NO：1所示核酸序列之第23個鹼基為A/T基因型、SEQ ID NO：2所示核酸序列之第21個鹼基為A/G基因型、SEQ ID NO：3所示核酸序列之第483個鹼基為A/G基因型、SEQ ID NO：4所示核酸序列之第20個鹼基為G/A基因型、SEQ ID NO：5所示核酸序列之第21個鹼基為C/T基因型、SEQ ID NO：6所示核酸序列之第21個鹼基為G/A基因型、SEQ ID NO：7所示核酸序列之第367個鹼基為G/A基因型、SEQ ID NO：8所示核酸序列之第22個鹼基為A/C基因型、SEQ ID NO：9所示核酸序列之第267個鹼基為G/A基因型、SEQ ID NO：10所示核酸序列之第20個鹼基為A/G 基因型、SEQ ID NO：11所示核酸序列之第20個鹼基為A/G基因型、SEQ ID NO：12所示核酸序列之第20個鹼基為T/C基因型。且該聚合酶鏈鎖反應係使用與該SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：12之核酸序列互補之引子對進行。且該引子對可用於以該些稻米品種之基因體DNA為模板，增幅出帶有該些基因型之核酸片段。且稻米之基因體DNA係來自稻米之種子之胚乳或稻米種子萌芽後之植株。

本發明之國內外稻米品種之鑑別方法，該第一引子組至第十二引子組係可以上列該些稻米核單酸為模板(template)，並由「單一微量試管」或「單一反應」中進行多重單一核苷酸點突變多型性聚合酶鏈鎖反應，獲得具有單一核苷酸多型性位點之核酸序列片段，藉以區別國內外稻米品種。因此，本發明可有效鑑定國內不同梗/梗或秈/秈稻米品種之係為差異，因大部分梗稻米品種之基因體成與標準品台農67號極為相似，因此本發明特別選取國內品種與台農67不同或具特殊性(如單一品種具有)之SNPs，利用該些SNP位點前後序列設計適合之SNP專一性引子對，之後進一步組合多組不同SNP專一引子對進行Multiplex SNP PCR反應及品種鑑定。

本發明之引子設計時依照SNP性質，設計3’端第3個鹼基為錯誤鹼基，已增加引子的專一性。其基本原則為強烈錯誤配對(strong mismatch)：G/A及C/T；微弱錯誤配對(weak mismatch)：C/A及G/T；中間錯誤配對(medium mismatch)：A/A、C/C、G/G及T/T，其中引子長度約為20~25mers左右。此外，為了該電泳帶於瓊脂膠上辨識方便，在引子設計上刻意將偵測同一各位點SNP變化得到之PCR產物，使其最終之DNA電泳帶大小差異至少相差15bps以上，並調整適當之黏合溫度、GC鹼基含量、引子長度等條件後，該條件會以程式自動進行引子對之設計，最後挑選最適合之一組序列進行SNP專一性引子對合成，以防止引子在PCR反應中相互競爭而導致錯誤的黏合產生雜訊。因此，本案12-plex引子組相較於先前技術15-plex引子組之以四引子擴增受阻突變體系聚合酶鏈鎖反應(Tetra-primer ARMS-PCR)，更加方便且易於推廣應用，同時又提升稻米鑑定技術之準確性及靈敏度。

本發明之另一特點為所有SNP位點皆位於具功能性表現的基因即外顯子(exon)上，相較於先前技術SNP位點位於內含子(intron)，本發明之基因標記具功能性而影響稻米的外表現，因此，也可利用在育種選拔方面。

本發明之國內外稻米品種之鑑別方法，合成完畢之引子全數些先以TAKARA DICE梯度聚合酶連鎖反應器進行台農67號與具有該SNP多型性品種之梯度(gradient)PCR，確認其專一性並尋找最適合之聚合溫度。最後以各SNP專一性引子組之平均溫度當作多重PCR之聚合溫度，優化最佳條件以利日後品種判別之應用。PCR反應時將各SNP專一性引子依比例加入單一微量試管或單一反應內，並使用市售多重試劑組(multiplex kit)，按照建議之PCR反應即可。因此，本發明之國內外稻米品種之鑑別方法，僅需一般性分生實驗室所擁有之設備，主要為聚合酶鏈鎖反應器(PCR machine)即可完成，具節省時間、成本且便利、快速及容易操作等優點。另，本發明為少量樣品(1ng gDNA)即可分析具有高靈敏度，且在植株生育期間任何階段皆可取樣分析；另外，樣品可以長期保存，鑑定結果穩定性及再現性高。

本發明之國內外稻米品種之鑑別方法，可應用於開放稻米貿易後，本國及外國稻米品種之鑑定之判別；稻米履歷認證制度之建立，建立市場稻米品質管制機制；配合糧食管理辦法。因應市售稻米品種標示之需求；提供農試單位，一般育種者對新育成或既有稻米種純度之維持，並提供政府管理單位即秧苗業者就水道良種繁殖制度之運作；可供農單位育種上親本品種鑑定，優良稻米品種種子繁殖之偵測維繫，市售稻米品種判定，米穀人員業者之稻米品種交易流通即施政單位對市售稻米之管理等。本發明之國內外稻米品種之鑑別方法，非再以SSR分子標記所依賴之重覆性DNA序列長度之變異(variable number tandem repeat,VNTR)為基礎，而是針對不同稻米品種之單一核苷酸多型性，利用各引子組所測得不同稻米品種之SNP組合，可提高稻米品種判別之靈敏度、穩定度以及精準度上皆較有現有稻米品種DNA指紋鑑定技術為佳，尤其是親緣關係甚為接近之本國稻米品種(例如台東32號(TT32)及台稉16號(TK16))，同時本發明之12組引子組之每個SNP位點樣品出現的對偶基因頻率(allelic frequency)為0.24至0.64之間，相較於先前技術的對偶基因頻率0.0143至0.471提升很多。

透過本發明，熟習此技藝者可運用任何已知的方法，對本發明所述之12個SNP位點對該50個稻米品種進行鑑定。具體而言，可是使用的方法包括，但是不限於，高分辨溶解曲線(high-resolution melt，HRM)、MALDI-TOF質譜分析(matrix assisted laser desertion/ionization time-of-flight mass spectrometry)以及各種定序法(Sequencing)等。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

首先收集國內外稻米樣品包含：台稉2號(Taikeng 2，TK2)、台稉4號(Taikeng 4，TK4)、台稉5號(Taikeng 5，TK5)、台稉8號(Taikeng 8，TK8)、台稉9號(Taikeng 9，TK9)、台稉14號(Taikeng 14，TK14)、台稉16號(Taikeng 16，TK16)、高雄139號(Kaohsiung 139，KH139)、高雄145號(Kaohsiung 145，KH145)、桃園1號(Taoyuan 1，TY1)、桃園3號(Taoyuan 3，TY3)、台南11號(Tainan 11，TN11)、台農71號(Tainung 71，TNG71)、花蓮19號(Hualien 19，HL19)、花蓮20號(Hualien 20，HL20)、日本越光(Koshihikari)、桃園糯2號(Taoyuan glutinous 2，TYW2)、台秈2號(Taichung sen 2，TS2)、台中秈10號(Taichung sen10，TC S10)、台農秈22號(Tainung sen 22，TNGS22)、台中再來一號(Taichung Native 1，TN1)、泰國Jasmine85、高雄141號(Kaohsiung 141，KH141)、高雄142號(Kaohsiung 142，KH142)、高雄143號(Kaohsiung 143，KH143)、高雄144號(Kaohsiung 144，KH144)、高雄146號(Kaohsiung 146，KH146)、高雄147號(Kaohsiung 147，KH147)、桃園4號(Taoyuan 4，TY4)、台南13號(Tainan 13，TN13)、台南14號(Tainan 14，TN14)、台東30號(Taitung 30，TT30)、台東32號(Taitung 32，TT32)、台農74號(Tainung 74，TNG74)、台農75號(Tainung 75，TNG75)、台農84號(Tainung 84，TNG84)、台中192號(Taichung 192，TC192)、台中194號(Taichung 194，TC194)、花蓮21號(Hualien 21，HL21)、苗栗1號(Miaoli 1，ML1)、台稉糯1號、(Taikeng glutinous 1，TKW1)、台稉糯3號(Taikeng glutinous 3，TKW3)、台稉糯12號(Taikeng glutinous 12，TKW12)、台東糯31號(Taitung glutinous 31，TTW31)、台農糯73號(Tainung glutinous 73，TNGW73)、台中秈17號(Taichung sen17，TC S17)、台農秈14號(Tainung sen 14，TNGS14)、台農秈糯21號(Tainung sen glutinous 21，TNGSW21)、台中秈糯1號(Taichung sen glutinous 1，TCSW1)及台中秈糯2號(Taichung sen glutinous 2，TCSW2)，共50種品種，除日本越光及泰國Jasmine85外其他皆為國內育成品種。

接著抽取各稻米樣品之基因體DNA(genomic DNA)，並以特定引子組經多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(Multiplex SNP PCR)偵測各稻米樣品之單一核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism,SNP)，藉由聚合酶鏈鎖反應產物大小(亦即電泳帶長短)判別稻米樣品是否具有該單一核苷酸多型性位點，進而得知該稻米樣品之品種，如第1圖所示。茲對前述實施方式詳盡說明如下：

實施例1：稻米基因體DNA萃取與定量 1.1 白米之基因體DNA萃取

取約10粒白米，使用Thermo Fisher QSP的2mL微量離心管並加入研磨用鋼珠(7mm)，使用均質機以14000rpm將米粒研磨成細粉狀。DNA的萃取方式使用溴化十六烷基三甲基銨(cetyl-trimethyl ammonium bromide，CTAB)的方法加以修飾。每管加入750μL 1% CTAB，置於65℃中20分鐘後，每管加入10μL proteinase K(20mg/mL)搖晃均勻，置於65℃中反應30分鐘(每10分鐘搖晃均勻一次)。加入800μL phenol/chloroform/isoamyl alcohol(25：24：1)，搖勻3分鐘再以14000rpm離心10分鐘。取上清液置入另一離心管，加入400μL chloroform/isoamyl alcohol(24：1)，14000rpm離心5分鐘後再取上清液，加入2/3體積的isopropanol，室溫下靜置20分鐘。以14000rpm離心10分鐘，使用70% EtOH脫水，離心數秒，倒掉廢液將沈澱物置於40℃下30 分鐘得到初步產物。初步產物加入200μL 1X TE緩衝液(Tris-HCl 10mM,EDTA 1mM,pH為8.0)後於40℃下1小時使之完全溶解，加入10μL RNase(500μg/mL)，混和均勻後置於37℃反應40分鐘以上。加入450μL之95% EtOH，於-20℃下沉澱30分鐘以上，以14000rpm離心10分鐘，去除廢液後風乾，即可得DNA產物。產物加入50μL TE緩衝液將DNA充分溶解後定量並保存於-20℃，將定量後DNA稀釋為1ng/μL，進行後續PCR反應分析。DNA定量以Qubit®螢光測定儀(Invitrogen，美國)及Qubit® dsDNA HS Assay Kit進行濃度測定(步驟10或步驟40)。

1.2 稻米種子萌芽之基因體DNA萃取

稻米種子萌芽後生長至2周大，剪取植株地上部後冷凍乾燥保存。乾燥後稻米植株採快速萃取DNA的方法，冷凍乾燥後的稻米葉片剪用約2~3mm大小2片，加入20mL葉部DNA萃取溶液(QuickExtract^TM ，EPICENTRE® Biotechnologies，美國)，並以65℃加熱6分鐘，緊接著98℃ 2分鐘加熱處理，即可快速提取DNA。注意此方法乃犧牲品質的快速DNA萃取方式，因此DNA無法長時間保存。DNA定量後亦稀釋為1ng/μL，再進行後續PCR反應分析(步驟10或步驟40)。

實施例2：可區隔前述50種國內外稻米之單一核苷酸多型性位點的建立

利用多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(Multiplex SNP PCR)偵測各稻米樣品之單一核苷酸多型性(步驟20)。本發明實施例2中找出可區隔前述50種國內外稻米之SNP差異位點，該些SNP位點係包含SEQ ID NO：1所示核酸序列之第23個鹼基為A/T基因型、SEQ ID NO：2所示核酸序列之第21個鹼基為A/G 基因型、SEQ ID NO：3所示核酸序列之第483個鹼基為A/G基因型、SEQ ID NO：4所示核酸序列之第20個鹼基為G/A基因型、SEQ ID NO：5所示核酸序列之第21個鹼基為C/T基因型、SEQ ID NO：6所示核酸序列之第21個鹼基為G/A基因型、SEQ ID NO：7所示核酸序列之第367個鹼基為G/A基因型、SEQ ID NO：8所示核酸序列之第22個鹼基為A/C基因型、SEQ ID NO：9所示核酸序列之第267個鹼基為G/A基因型、SEQ ID NO：10所示核酸序列之第20個鹼基為A/G基因型、SEQ ID NO：11所示核酸序列之第20個鹼基為A/G基因型、SEQ ID NO：12所示核酸序列之第20個鹼基為T/C基因型，共計12個SNP位點(步驟30)。

實施例3：多重單一核苷酸多型性聚合酶連鎖反應

多重聚合酶連鎖反應使用多重聚合酶連鎖反應試劑組(Multiplex PCR Kit，QIAGEN®，德國)，各成分反應體積依照該試劑組使用手冊做調整。12組引子組(12-plex)因引子專一性表現強弱不同，因此每一引子稀釋比例不相同，故在多重SNP聚合酶連鎖反應中的DNA量、Q緩衝液(Q buffer)的添加量與循環次數亦有所調整。Q buffer為該試劑組中添加至PCR反應，降低非專一性產物電泳帶生成的藥品。

各品種參考標準品12組引子組多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應，反應總體積為10 μL，包含5 μL 2X QIAGEN multiplex PCR master mix、1 μL 10X引子混合液(primer mix)、1 μL Q buffer、2 μL RNase-free water及1 μL的DNA(ng/μL)樣品。聚合酶連鎖反應使用熱循環反應器(PCR Thermal Cycler，Takara，日本)進行，其反應條件為：94℃反應15分鐘，再以94℃，30秒、55℃，90秒、72℃，90秒為一循環，並重複此循29次後，溫度調整至60℃反應30分鐘，1個循環，最後降至25℃結束反應(步驟50)。

其中引子混合液為每一引子組之正向與反向之混合液，每一引子需稀釋至不相同濃度，參閱表1：

實施例4：多重單一核苷酸多型性聚合酶連鎖反應產物分析 4.1毛細管電泳分析

進行PCR後產物以e-GENE HAD-GT12^TM DNA分析儀(QIAGEN®，德國)搭配高解析度毛細管電泳試劑組(QIAxcel DNAHigh Resolution Kit)進行毛細管電泳，內含QIAxcel DNA High Resolution Cartridge卡夾，將卡夾放入儀器內並搭配使用QIAxcel BioCalculator軟體。依照使用步驟以96孔樣品盤盛裝待測物體積約需15 μL，而PCR總體積約10 μL，因此需以Kit內附的QX DNA Dilution緩衝液將反應物稀釋至15 μL進行PCR產物分析。使用15 bp/1 kb之QX alignment marker，方法選擇廠商協助建立之OM820.mtd(單一樣本分析時間820秒)，並視當時氣溫狀況調整Adjust separation time 0-120秒。結果的判讀方法與常規膠體電泳判讀方法相似，其餘細節參照QIAxcel® DNA Handbook(步驟30或步驟60)。

參閱第2圖，利用本發明之鑑定國內外稻米品種之方法以Qiaxcel毛細管電泳進行12-plex SNP PCR之12組引子產物大小相對位置波峰圖，其每一個波峰即代表PCR產物之片段長度。參閱第3圖，為不同稻米品種台稉16號(Taikeng 16，TK16)、台農秈糯21號(Tainung sen glutinous 21，TNGSW21)及高雄142號(Kaohsiung 142，KH142)，利用本發明之鑑定國內外稻米品種之方法進行12-plex SNP PCR分析之Qiaxcel毛細管電泳波峰圖。以TK16為例，在第十二引子組(117bp)此位點野生型為A表現因此進行PCR時無法擴增產物，若117bp為G表現型則進行PCR反應則會有擴增產物作出，並於進行毛細管電泳時會有波峰表現，代表此品種在該等位基因有單一核苷酸多型性(SNP)。經由上述結果，每個片段結果都清晰易於判讀，且雜訊少，證實本發明使用之12組引子之專一性高。

1.2膠體電泳分析

以3%瓊脂膠(AMRESCO Agarose SFR^TM ，序號AM-J234，美國)進行電泳分析。以微波爐加熱至膠徹底溶解成完全透明狀，加入4 μL EtBr(10 mg/mL)後搖晃均勻。放置10分鐘後倒入製膠槽(長14.8 cm，寬13.8 cm)，將氣泡趕至邊緣，放上需要孔數之齒梳。靜置40分鐘以上待其凝固。所有PCR後的產物加入1μL 6X dye混和均勻後依序注入齒槽內。Loadingmarker使用GeneDirex®的2 μL 50bp DNA Ladder，以120V進行電泳，待膠片上下方之染劑(checking dye)跑至整片膠片最下緣處即可停止電泳，最後以UV觀察膠片上之DNA指紋條帶，拍照存檔以供分析(步驟30或步驟60)。

參閱第4圖，以本發明之12-plex SNP PCR分析2012台灣稻米推薦品種之電泳圖結果，1為TCS10、2為TK2、3為TK8、4為TK9、5為TK14、6為TK16、7為TNG71、8為KH139、9為KH145、10為TN11、11為TC192、12為HL21、13為TT30、14為Koshihikari、15為台農67(TNG67)、16為水、17為混合。以TCS10為例，在第二引子組556bp此位點通常為A表現因此進行PCR時無法擴增產物，若556bp為G表現型代表此品種在該等位基因有單一核苷酸多型性(SNP)，等位基因特異性引子會與此位點黏合，在PCR反應時擴增出產物，電泳分析時即可產生電泳帶。選用台農67號作為野生型標準品設計為無條帶表現之對照品種；17為TN11、KH139及KH142品種之混合，作為12組引子產物大小相對位置之對照組。

實施例5：稻米品種之結果分析

將50個品種間不同SNP位點的多型性整理於表2，作為12組引子組多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應之品種鑑定的參考標準(步驟70)：

本發明係提供一種利用多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(Multiplex SNP PCR)偵測單一核苷酸多型性以鑑別國內外稻米品種之方法，其係於單一反應中可同時完成多個位點的偵測具有快速且降低成本的優點，若搭配毛細管電泳的使用不啻可成為自動化分析的省時工具。

目前國內尚無可有效鑑別臺灣不同稻米品種及區分臺灣稻米品種與國外稻米品種的方法，本發明可建立我國稻米品種的準確鑑定判別方法，以作為進行市場管理的依據，同時可解決農民與水稻秧苗業者之品種認定之爭議，以確保品種之純正優良利於稻米產業永續發展。另外，市售小包裝白米將走向高品質及高單價之趨勢，本發明亦可作為商品認證之用，加強國人對國內品牌之信心，並提升我國稻米之品質。

10~70‧‧‧流程圖步驟

第1圖為本發明之鑑定國內外稻米品種之方法之流程圖。

第2圖為利用本發明之鑑定國內外稻米品種之方法以Qiaxcel毛細管電泳進行12-plex SNP PCR之波峰圖。

第3圖為不同稻米品種(TK16、TCSW21及KH142)利用本發明之鑑定國內外稻米品種之方法進行12-plex SNP PCR分析之Qiaxcel毛細管電泳波峰圖。

第4圖為利用本發明之鑑定國內外稻米品種之方法以膠體電泳分析進行12-plex SNP PCR之電泳圖；1為TCS10、2為TK2、3為TK8、4為TK9、5為TK14、6為TK16、7為TNG71、8為KH139、9為KH145、10為TN11、11為TC192、12為HL21、13為TT30、14為Koshihikari、15為TNG67、16為水、17為混合。

<110> 國立台灣大學

<120> 鑑定國內外稻米品種之方法

<130> 101B0555-I1

<160> 36

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 646

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

<210> 2

<211> 556

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

<210> 3

<211> 503

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

<210> 4

<211> 477

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

<210> 5

<211> 446

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 5

<210> 6

<211> 402

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 6

<210> 7

<211> 385

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 7

<210> 8

<211> 350

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 8

<210> 9

<211> 285

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 9

<210> 10

<211> 248

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 10

<210> 11

<211> 210

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 11

<210> 12

<211> 113

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 12

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> S607-1F

<400> 13

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> S607-1R

<400> 14

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> N1453-2F

<400> 15

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> N1453-2R

<400> 16

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> S186-3F

<400> 17

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> S186-3R

<400> 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> S353-1F

<400> 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> S353-1R

<400> 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> S486-2F

<400> 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> S486-2R

<400> 22

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> N1679F

<400> 23

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> N1679R

<400> 24

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> S1574-1F

<400> 25

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> S1574-1R

<400> 26

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> CH10-1F

<400> 27

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> CH10-1R

<400> 28

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> S1704-9F

<400> 29

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> S1704-9R

<400> 30

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> CH2-1F

<400> 31

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> CH2-1R

<400> 32

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> CH8-4F

<400> 33

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> CH8-4R

<400> 34

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> S1808-1F

<400> 35

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 1808-1R

<400> 36

Claims

一種鑑定國內外稻米品種之方法，其步驟包含：(1)利用一引子組並藉由多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(Multiplex SNP PCR)增幅(amplify)複數種已知品種稻米之基因體DNA中包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：12所示核酸序列中具有一單一核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點之片段，以獲得該些已知品種稻米經該引子組增幅所得各PCR產物之片段長度；(2)利用一引子組並藉由多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應增幅一待測稻米之基因體DNA，以獲得該待測稻米經該引子組增幅所得各PCR產物之片段長度；以及(3)以該待測稻米經該引子組增幅所得各PCR產物之片段長度比對步驟(1)該些已知品種稻米經該引子組增幅所得各PCR產物之片段長度，藉以鑑別出該待測稻米之品種，其中，該引子組係由第一引子組(SEQ ID NO：13與SEQ ID NO：14)、第二引子組(SEQ ID NO：15與SEQ ID NO：16)、第三引子組(SEQ ID NO：17與SEQ ID NO：18)、第四引子組(SEQ ID NO：19與SEQ ID NO：20)、第五引子組(SEQ ID NO：21與SEQ ID NO：22)、第六引子組(SEQ ID NO：23與SEQ ID NO：24)、第七引子組(SEQ ID NO：25與SEQ ID NO：26)、第八引子組(SEQ ID NO：27與SEQ ID NO：28)、第九引子組(SEQ ID NO：29與SEQ ID NO：30)、第十引子組(SEQ ID NO：31與SEQ ID NO：32)、第十一引子組(SEQ ID NO：33與SEQ ID NO：34)以及第十二引子組(SEQ ID NO：35與SEQ ID NO：36)所組成之族群。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該已知品種稻米係選自由台稉2號(Taikeng 2，TK2)、台稉4號(Taikeng 4，TK4)、台稉5號(Taikeng 5，TK5)、台稉8號(Taikeng 8，TK8)、台稉9號(Taikeng 9，TK9)、台稉14號(Taikeng 14，TK14)、台稉16號(Taikeng 16，TK16)、高雄139號(Kaohsiung 139，KH139)、高雄145號(Kaohsiung 145，KH145)、桃園1號(Taoyuan 1，TY1)、桃園3號(Taoyuan 3，TY3)、台南11號(Tainan 11，TN11)、台農71號(Tainung 71，TNG71)、花蓮19號(Hualien 19，HL19)、花蓮20號(Hualien 20，HL20)、日本越光(Koshihikari)、桃園糯2號(Taoyuan glutinous 2，TYW2)、台秈2號(Taichung sen 2，TS2)、台中秈10號(Taichung sen10，TCS10)、台農秈22號(Tainung sen 22，TNGS22)、台中再來一號(Taichung Native 1，TN1)、泰國Jasmine85、高雄141號(Kaohsiung 141，KH141)、高雄142號(Kaohsiung 142，KH142)、高雄143號(Kaohsiung 143，KH143)、高雄144號(Kaohsiung 144，KH144)、高雄146號(Kaohsiung 146，KH146)、高雄147號(Kaohsiung 147，KH147)、桃園4號(Taoyuan 4，TY4)、台南13號(Tainan 13，TN13)、台南14號(Tainan 14，TN14)、台東30號(Taitung 30，TT30)、台東32號(Taitung 32，TT32)、台農74號(Tainung 74，TNG74)、台農75號(Tainung 75，TNG75)、台農84號(Tainung 84，TNG84)、台中192號(Taichung 192，TC192)、台中194號(Taichung 194，TC194)、花蓮21號(Hualien 21，HL21)、苗栗1號(Miaoli 1，ML1)、台稉糯1號、(Taikeng glutinous 1，TKW1)、台稉糯3號(Taikeng glutinous 3，TKW3)、台稉糯12號(Taikeng glutinous 12，TKW12)、台東糯31號(Taitung glutinous 31，TTW31)、台農糯73號(Tainung glutinous 73，TNGW73)、台中秈17號(Taichung sen17，TCS17)、台農秈14號(Tainung sen 14，TNGS14)、台農秈糯21號 (Tainung sen glutinous 21，TNGSW21)、台中秈糯1號(Taichung sen glutinous 1，TCSW1)及台中秈糯2號(Taichung sen glutinous 2，TCSW2)所組成之族群。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該引子組之濃度為：第一引子組(SEQ ID NO：13與SEQ ID NO：14)係為1.0μM、第二引子組(SEQ ID NO：15與SEQ ID NO：16)係為1.0μM、第三引子組(SEQ ID NO：17與SEQ ID NO：18)係為1.6μM、第四引子組(SEQ ID NO：19與SEQ ID NO：20)係為3.0μM、第五引子組(SEQ ID NO：21與SEQ ID NO：22)係為1.0μM、第六引子組(SEQ ID NO：23與SEQ ID NO：24)係為2.0μM、第七引子組(SEQ ID NO：25與SEQ ID NO：26)係為4.0μM、第八引子組(SEQ ID NO：27與SEQ ID NO：28)係為2.0μM、第九引子組(SEQ ID NO：29與SEQ ID NO：30)係為4.0μM、第十引子組(SEQ ID NO：31與SEQ ID NO：32)係為2.0μM、第十一引子組(SEQ ID NO：33與SEQ ID NO：34)係為2.0μM以及第十二引子組(SEQ ID NO：35與SEQ ID NO：36)係為3.0μM。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應之反應條件為先以94℃反應15分鐘，再以94℃，30秒、55℃，90秒、72℃，90秒為一循環，並重複此循29次後，溫度調整至60℃反應30分鐘。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中稻米之基因體DNA係來自稻米之種子之胚乳或稻米種子萌芽後之植株。
一種可鑑別國內外稻米品種之引子組，係以一稻米之基因體DNA為模板(template)並經由藉由一聚合酶連鎖反應而獲得具有單一核苷酸多型(SNP)位點之片段長度，其中該引子組係由第一引子組(SEQ ID NO：13與SEQ ID NO：14)、第二引子組(SEQ ID NO：15與SEQ ID NO：16)、第三引子組(SEQ ID NO：17與SEQ ID NO：18)、第四引子組(SEQ ID NO：19與SEQ ID NO：20)、第五引子組(SEQ ID NO：21與SEQ ID NO：22)、第六引子組(SEQ ID NO：23與SEQ ID NO：24)、第七引子組(SEQ ID NO：25與SEQ ID NO：26)、第八引子組(SEQ ID NO：27與SEQ ID NO：28)、第九引子組(SEQ ID NO：29與SEQ ID NO：30)、第十引子組(SEQ ID NO：31與SEQ ID NO：32)、第十一引子組(SEQ ID NO：33與SEQ ID NO：34)以及第十二引子組(SEQ ID NO：35與SEQ ID NO：36)所組成之族群。
如申請專利範圍第6項所述之引子組，其中該已知品種稻米係選自由台稉2號(Taikeng 2，TK2)、台稉4號(Taikeng 4，TK4)、台稉5號(Taikeng 5，TK5)、台稉8號(Taikeng 8，TK8)、台稉9號(Taikeng 9，TK9)、台稉14號(Taikeng 14，TK14)、台稉16號(Taikeng 16，TK16)、高雄139號(Kaohsiung 139，KH139)、高雄145號(Kaohsiung 145，KH145)、桃園1號(Taoyuan 1，TY1)、桃園3號(Taoyuan 3，TY3)、台南11號(Tainan 11，TN11)、台農71號(Tainung 71，TNG71)、花蓮19號(Hualien 19，HL19)、花蓮20號(Hualien 20，HL20)、日本越光(Koshihikari)、桃園糯2號(Taoyuan glutinous 2，TYW2)、台秈2號(Taichung sen 2，TS2)、台中秈10號(Taichung sen10，TCS10)、台農秈22號(Tainung sen 22，TNGS22)、台中再來一號(Taichung Native 1，TN1)、泰國Jasmine85、高雄141號(Kaohsiung 141，KH141)、高雄142號(Kaohsiung 142，KH142)、高雄143號(Kaohsiung 143，KH143)、高雄144號(Kaohsiung 144，KH144)、高雄146號(Kaohsiung 146，KH146)、高雄147號(Kaohsiung 147，KH147)、桃園4號(Taoyuan 4，TY4)、台南13號(Tainan 13，TN13)、台南14號(Tainan 14，TN14)、台東30號(Taitung 30，TT30)、台東32號(Taitung 32，TT32)、台農74號(Tainung 74，TNG74)、台農75號(Tainung 75，TNG75)、台農84號(Tainung 84，TNG84)、台中192號(Taichung 192，TC192)、台中194號(Taichung 194，TC194)、花蓮21號(Hualien 21，HL21)、苗栗1號(Miaoli 1，ML1)、台稉糯1號、(Taikeng glutinous 1，TKW1)、台稉糯3號(Taikeng glutinous 3，TKW3)、台稉糯12號(Taikeng glutinous 12，TKW12)、台東糯31號(Taitung glutinous 31，TTW31)、台農糯73號(Tainung glutinous 73，TNGW73)、台中秈17號(Taichung sen17，TCS17)、台農秈14號(Tainung sen 14，TNGS14)、台農秈糯21號(Tainung sen glutinous 21，TNGSW21)、台中秈糯1號(Taichung sen glutinous 1，TCSW1)及台中秈糯2號(Taichung sen glutinous 2，TCSW2)所組成之族群。
如申請專利範圍第6項所述之引子組，其中該聚合酶連鎖反應係使用該引子組分別進行聚合酶連鎖反應或使用該引子組同時進行多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應(Multiplex SNP PCR)。
如申請專利範圍第8項所述之引子組，其中進行多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應，該引子組之濃度為：第一引子組(SEQ ID NO：13與SEQ ID NO：14)係為1.0μM、第二引子組(SEQ ID NO： 15與SEQ ID NO：16)係為1.0μM、第三引子組(SEQ ID NO：17與SEQ ID NO：18)係為1.6μM、第四引子組(SEQ ID NO：19與SEQ ID NO：20)係為3.0μM、第五引子組(SEQ ID NO：21與SEQ ID NO：22)係為1.0μM、第六引子組(SEQ ID NO：23與SEQ ID NO：24)係為2.0μM、第七引子組(SEQ ID NO：25與SEQ ID NO：26)係為4.0μM、第八引子組(SEQ ID NO：27與SEQ ID NO：28)係為2.0μM、第九引子組(SEQ ID NO：29與SEQ ID NO：30)係為4.0μM、第十引子組(SEQ ID NO：31與SEQ ID NO：32)係為2.0μM、第十一引子組(SEQ ID NO：33與SEQ ID NO：34)係為2.0μM以及第十二引子組(SEQ ID NO：35與SEQ ID NO：36)係為3.0μM。
如申請專利範圍第8項所述之引子組，其中進行多重單一核苷酸多型性聚合酶鏈鎖反應，其反應條件為先以94℃反應15分鐘，再以94℃，30秒、55℃，90秒、72℃，90秒為一循環，並重複此循29次後，溫度調整至60℃反應30分鐘。
如申請專利範圍第6項所述之引子組，其中稻米之基因體DNA係來自稻米之種子之胚乳或稻米種子萌芽後之植株。
一種可鑑別國內外稻米品種方法，其步驟包含：(1)分析數種已知品種稻米之基因體DNA，以一聚合酶鏈鎖反應檢測12個單一核苷酸多型性之基因型，該些單一核苷酸多型性係位SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：12所組成之核酸序列中；(2)分析一待測稻米之基因體DNA，以一聚合酶鏈鎖反應檢測12個單一核苷酸多型性之基因型，該些單一核苷酸多型性係位SEQ ID NO：1-12所組成之核酸序列中；以及 (3)該待測稻米經所得該12個單一核苷酸多型性之基因型比對步驟1該些已知品種稻米的該12個單一核苷酸多型性之基因型，藉以鑑別出該待測稻米之品種，其中SEQ ID NO：1所示核酸序列之第23個鹼基為A/T基因型、SEQ ID NO：2所示核酸序列之第21個鹼基為A/G基因型、SEQ ID NO：3所示核酸序列之第483個鹼基為A/G基因型、SEQ ID NO：4所示核酸序列之第20個鹼基為G/A基因型、SEQ ID NO：5所示核酸序列之第21個鹼基為C/T基因型、SEQ ID NO：6所示核酸序列之第21個鹼基為G/A基因型、SEQ ID NO：7所示核酸序列之第367個鹼基為G/A基因型、SEQ ID NO：8所示核酸序列之第22個鹼基為A/C基因型、SEQ ID NO：9所示核酸序列之第267個鹼基為G/A基因型、SEQ ID NO：10所示核酸序列之第20個鹼基為A/G基因型、SEQ ID NO：11所示核酸序列之第20個鹼基為A/G基因型、SEQ ID NO：12所示核酸序列之第20個鹼基為T/C基因型。
如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該已知品種稻米係選自由台稉2號(Taikeng 2，TK2)、台稉4號(Taikeng 4，TK4)、台稉5號(Taikeng 5，TK5)、台稉8號(Taikeng 8，TK8)、台稉9號(Taikeng 9，TK9)、台稉14號(Taikeng 14，TK14)、台稉16號(Taikeng 16，TK16)、高雄139號(Kaohsiung 139，KH139)、高雄145號(Kaohsiung 145，KH145)、桃園1號(Taoyuan 1，TY1)、桃園3號(Taoyuan 3，TY3)、台南11號(Tainan 11，TN11)、台農71號(Tainung 71，TNG71)、花蓮19號(Hualien 19，HL19)、花蓮20號(Hualien 20，HL20)、日本越光(Koshihikari)、桃園糯2號(Taoyuan glutinous 2，TYW2)、台秈2號(Taichung sen 2，TS2)、台中秈10號(Taichung sen10，TC S10)、台農秈22號(Tainung sen 22，TNGS22)、台中再來一號(Taichung Native 1，TN1)、泰國Jasmine85、高雄141號(Kaohsiung 141，KH141)、高雄142號(Kaohsiung 142，KH142)、高雄143號(Kaohsiung 143，KH143)、高雄144號(Kaohsiung 144，KH144)、高雄146號(Kaohsiung 146，KH146)、高雄147號(Kaohsiung 147，KH147)、桃園4號(Taoyuan 4，TY4)、台南13號(Tainan 13，TN13)、台南14號(Tainan 14，TN14)、台東30號(Taitung 30，TT30)、台東32號(Taitung 32，TT32)、台農74號(Tainung 74，TNG74)、台農75號(Tainung 75，TNG75)、台農84號(Tainung 84，TNG84)、台中192號(Taichung 192，TC192)、台中194號(Taichung 194，TC194)、花蓮21號(Hualien 21，HL21)、苗栗1號(Miaoli 1，ML1)、台稉糯1號、(Taikeng glutinous 1，TKW1)、台稉糯3號(Taikeng glutinous 3，TKW3)、台稉糯12號(Taikeng glutinous 12，TKW12)、台東糯31號(Taitung glutinous 31，TTW31)、台農糯73號(Tainung glutinous 73，TNGW73)、台中秈17號(Taichung sen17，TC S17)、台農秈14號(Tainung sen 14，TNGS14)、台農秈糯21號(Tainung sen glutinous 21，TNGSW21)、台中秈糯1號(Taichung sen glutinous 1，TCSW1)及台中秈糯2號(Taichung sen glutinous 2，TCSW2)所組成之族群。
如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該聚合酶鏈鎖反應係使用與該SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：12之核酸序列互補之引子對進行。
如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該引子對可用於以該些稻米品種之基因體DNA為模板，增幅出帶有該些基因型之核酸片段。
如申請專利範圍第12項所述之方法，其中稻米之基因體DNA係來自稻米之種子之胚乳或稻米種子萌芽後之植株。
一分離之核苷酸，其具有一由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：12所組成之核苷酸序列。
如申請專利範圍第17項所述之核苷酸，其中SEQ ID NO：1所示核酸序列之第23個鹼基為A/T基因型、SEQ ID NO：2所示核酸序列之第21個鹼基為A/G基因型、SEQ ID NO：3所示核酸序列之第483個鹼基為A/G基因型、SEQ ID NO：4所示核酸序列之第20個鹼基為G/A基因型、SEQ ID NO：5所示核酸序列之第21個鹼基為C/T基因型、SEQ ID NO：6所示核酸序列之第21個鹼基為G/A基因型、SEQ ID NO：7所示核酸序列之第367個鹼基為G/A基因型、SEQ ID NO：8所示核酸序列之第22個鹼基為A/C基因型、SEQ ID NO：9所示核酸序列之第267個鹼基為G/A基因型、SEQ ID NO：10所示核酸序列之第20個鹼基為A/G基因型、SEQ ID NO：11所示核酸序列之第20個鹼基為A/G基因型、SEQ ID NO：12所示核酸序列之第20個鹼基為T/C基因型。
如申請專利範圍第18項所述之核苷酸，其中該些核苷酸分析數種已知稻米品種及一待測待測稻米後進行比對，藉以鑑別出該待測稻米之品種。
如申請專利範圍第19項所述之核苷酸，其中該已知品種稻米係選自由台稉2號(Taikeng 2，TK2)、台稉4號(Taikeng 4，TK4)、台稉5號(Taikeng 5，TK5)、台稉8號(Taikeng 8，TK8)、台稉9號(Taikeng 9，TK9)、台稉14號(Taikeng 14，TK14)、台稉16號(Taikeng 16，TK16)、高雄139號(Kaohsiung 139，KH139)、高雄145號(Kaohsiung 145，KH145)、桃園1號(Taoyuan 1，TY1)、桃園3號(Taoyuan 3，TY3)、台南11號(Tainan 11，TN11)、台農71號(Tainung 71，TNG71)、花蓮19號(Hualien 19，HL19)、花運20號(Hualien 20，HL20)、日本越光(Koshihikari)、桃園糯2號(Taoyuan glutinous 2，TYW2)、台秈2號(Taichung sen 2，TS2)、台中秈10號(Taichung sen10，TC S10)、台農秈22號(Tainung sen 22，TNGS22)、台中再來一號(Taichung Native 1，TN1)、泰國Jasmine85、高雄141號(Kaohsiung 141，KH141)、高雄142號(Kaohsiung 142，KH142)、高雄143號(Kaohsiung 143，KH143)、高雄144號(Kaohsiung 144，KH144)、高雄146號(Kaohsiung 146，KH146)、高雄147號(Kaohsiung 147，KH147)、桃園4號(Taoyuan 4，TY4)、台南13號(Tainan 13，TN13)、台南14號(Tainan 14，TN14)、台東30號(Taitung 30，TT30)、台東32號(Taitung 32，TT32)、台農74號(Tainung 74，TNG74)、台農75號(Tainung 75，TNG75)、台農84號(Tainung 84，TNG84)、台中192號(Taichung 192，TC192)、台中194號(Taichung 194，TC194)、花蓮21號(Hualien 21，HL21)、苗栗1號(Miaoli 1，ML1)、台稉糯1號、(Taikeng glutinous 1，TKW1)、台稉糯3號(Taikeng glutinous 3，TKW3)、台稉糯12號(Taikeng glutinous 12，TKW12)、台東糯31號(Taitung glutinous 31，TTW31)、台農糯73號(Tainung glutinous 73，TNGW73)、台中秈17號(Taichung sen17，TC S17)、台農秈14號(Tainung sen 14，TNGS14)、台農秈糯21號(Tainung sen glutinous 21，TNGSW21)、台中秈糯1號(Taichung sen glutinous 1，TCSW1)及台中秈糯2號(Taichung sen glutinous 2，TCSW2)所組成之族群。