CN108753995A

CN108753995A - 一种与中华绒螯蟹性早熟性状显著相关的snp位点及应用

Info

Publication number: CN108753995A
Application number: CN201810794350.8A
Authority: CN
Inventors: 徐宇; 许志强; 林海; 邓燕飞; 李旭光; 陆全平; 潘建林
Original assignee: Freshwater Fisheries Research Institute of Jiangsu Province
Current assignee: Freshwater Fisheries Research Institute of Jiangsu Province
Priority date: 2018-07-19
Filing date: 2018-07-19
Publication date: 2018-11-06
Anticipated expiration: 2038-07-19
Also published as: CN108753995B

Abstract

本发明公开了一种与中华绒螯蟹性早熟性状显著相关的SNP位点及应用。所述的SNP位点位于中华绒螯蟹Vg基因5′‑侧翼区‑437bp处，碱基变异信息为SNP g.‑437T>G。用于检测该SNP位点的PCR引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，限制性内切酶为MboI。该SNP位点与中华绒螯蟹性早熟之间存在着显著的相关性，其中GG基因型中华绒螯蟹个体出现性早熟性状的风险是显著低于TT基因型个体。所述的SNP位点及基因分型用PCR引物在预测中华绒螯蟹性早熟风险和/或中华绒螯蟹品种选育中应用。

Description

一种与中华绒螯蟹性早熟性状显著相关的SNP位点及应用

技术领域

本发明属于水产养殖基因工程领域，涉及一种与中华绒螯蟹性早熟性状显著相关的SNP位点及应用。

背景技术

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)俗称河蟹，是我国最重要的淡水养殖品种之一。性早熟是影响当前河蟹养殖效益的瓶颈问题之一，性早熟幼蟹在培育过程中性腺当年发育成熟，不能继续顺利蜕壳，体重增长缓慢甚至停滞，绝大多数在翌年4～5月期间死亡，不能再继续饲养至2龄成蟹规格。此外，由于性早熟一龄蟹的大量存在，在蟹种培育阶段还导致了饲料的巨大浪费，严重影响了河蟹养殖效益。河蟹养殖过程中发现，即使在相同的外在环境条件下，也只有部分个体发生性早熟。这一现象表明，除了外部环境因素外，个体内在的遗传因素同样会影响河蟹性早熟的发生。卵黄蛋白原是卵细胞形成期间积累在卵黄颗粒中的一种主要蛋白组分，其在性腺及胚胎发育过程中发挥着重要的作用。由于卵黄蛋白原基因(Vg)在性早熟河蟹卵巢中呈现提前表达和过量积聚(与正常发育蟹种相比)，所以Vg基因相关遗传变异可能与河蟹性早熟之间存在着密切的相关性。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种与中华绒螯蟹性早熟性状显著相关的SNP位点。

本发明的另一目标是提供该SNP位点的PCR引物。

本发明的又一目的是提供该SNP位点及其应用。

本发明的目的可以通过如下技术方案实现：

一种与中华绒螯蟹性早熟性状显著相关的SNP位点，其特征在于所述的SNP位点位于中华绒螯蟹Vg基因5′-侧翼区-437bp处，碱基变异信息为SNP g.-437 T>G。

所述的SNP位点GG基因型中华绒螯蟹个体出现性早熟性状的风险显著低于TT基因型个体。

本发明所述的SNP标记在中华绒螯蟹新品系选育中的应用，品种选育时，选择所述的SNP位点基因型为GG的个体作为育种亲本。

一种预测中华绒螯蟹性早熟风险的方法，通过检测权所述的SNP标记，预测中华绒螯蟹性早熟风险。

所述的方法优选：提取不同中华绒螯蟹个体的基因组DNA，采用以PCR为基础的限制性片段长度多态法PCR-RFLP对不同个体进行基因分型，所述的SNP位点GG基因型中华绒螯蟹个体出现性早熟性状的风险显著低于TT基因型个体，从而预测中华绒螯蟹性早熟风险。

其中，所述的PCR-RFLP中使用的PCR上游引物为SEQ ID NO.1下游引物为SEQ IDNO.2；使用的限制性内切酶为MboI限制性内切酶。

作为所述的方法的另一种优选：提取不同中华绒螯蟹个体的基因组DNA，PCR扩增含有所述SNP位点的基因片段，通过直接测序获得所述SNP位点的序列，从而预测中华绒螯蟹性早熟

用于检测所述的SNP位点的PCR引物，上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQ IDNO.2。

本发明所述的PCR引物在预测中华绒螯蟹性早熟风险和/或中华绒螯蟹品种选育中的应用。

一种预测中华绒螯蟹性早熟风险的试剂盒，包含所述的PCR引物。

有益效果：

本发明在克隆获取河蟹Vg基因DNA序列全长(外显子和内含子序列)的基础上，通过锚定PCR技术获取了中华绒螯蟹Vg基因879bp的5′-侧翼调控区序列，生物信息学分析结果显示该区域内具有潜在的转录起始位点(含有潜在启动子序列)(GenBank accessionno.MH621336)。对河蟹Vg基因5′-侧翼调控区序列进行单核苷酸多态(SNP)筛查，共鉴定出8个SNP位点。以此为基础，我们采用性状-基因型关联分析方法对8个SNP位点与性早熟性状之间的相关性进行了研究，发现位于Vg基因5′-侧翼调控区的一个SNPs(SNP g.-437T>G)与河蟹性早熟之间存在着显著的相关性(OR＝0.448(95％CI 0.299-0.672)，P<0.001)，其中GG基因型河蟹个体出现性早熟性状的风险是显著低于TT基因型个体(比值比为0.448)。在以低性早熟为选育指标的河蟹遗传育种研究过程中，通过对河蟹育种群体进行SNP g.-437T>G基因分型，结合形态特征分析，可以优先选择基因型为GG的个体作为育种亲本，本研究对于河蟹新品系选育工作具有重要的指导意义。

附图说明

图1.中华绒螯蟹SNP g.-437 T>G位点基因分型情况

注:泳道M为DL2000marker；泳道1为TT基因型；泳道2为TG基因型；泳道3为GG基因型。

具体实施方式

实施例1Vg基因的5′-侧翼区序列SNP筛查及其与性早熟的相关性分析：

①性早熟相关SNP位点的初步筛查

随机选取正常及性早熟河蟹各100个样本进行基因组DNA提取。设计引物对Vg基因的5′-侧翼区序列进行PCR扩增，扩增引物为：Vg1F:ACTCTCGTCTATTTCCACTATC(SEQ IDNO.3)；Vg1R:CCATCCTGCGACAATCAC(SEQ ID NO.4)；扩增长度为801bp，对扩增PCR产物进行纯化后双向测序，根据测序结果筛选鉴定Vg基因5′-侧翼调控区序列的SNP位点。

针对测序所发现的SNP位点，对性早熟和正常发育蟹种群体进行单个位点的性状-基因型关联分析(基于共显性模型和相加模型的Logistic回归分析)，并计算相对应的P值、比值比(Odds Ratio,OR)及其95％可信区间(confidence interval,CI)，筛查与性早熟性状具有显著相关性的SNP位点。

表1.中华绒螯蟹Vg基因5′-侧翼调控区遗传变异与性早熟的相关性分析

注：^a实验组(Case；性早熟蟹)和对照组(Control；正常蟹)纯合子/杂合子/稀有纯合子的数量关系

^b最小等位基因频率

^c对照组Hardy-Weinberg平衡检验的P值

P值研究发现，位于Vg基因5′-侧翼区-437bp处的SNP位点与河蟹性早熟性状之间存在显著的相关性(OR＝0.481(95％CI 0.260-0.887)，P＝0.019)，碱基变异信息为SNPg.-437 T>G。

②性早熟相关SNP位点的进一步验证

在初步获得了与性早熟显著相关SNP位点的基础上，我们另外选取200对样本(200正常蟹种、200性早熟蟹种)对结果进行验证。采用PCR-RFLP技术对所发现的阳性SNP位点进行基因分型；随机挑选不同基因型个体进行PCR产物直接测序，验证PCR-RFLP分型结果的准确性。

首先采用PCR扩增包含有SNP g.-437 T>G位点的基因片段，PCR产物扩增长度为243bp，SNP位点位于扩增引物的第46bp；PCR引物为：F-CGGCTCACCAATACTACC(SEQ IDNO.1)；R-GACATCACTCTATCAGGACTT(SEQ ID NO.2)。

PCR扩增序列信息如下(小写碱基为引物锚定位点)：

cggctcaccaatactaccGAGTCAGGCGCCTTTGTCTCGTCGTGAYCGTCACCAGGTTGGCACTCGCCGATACCACGAAAACAACGACTGTGACAGCGGGTTGAGATGGTAATGCCTGGTACCAGGATGGCAGGGGCTTTCGTTAGGGAGGGTGCATGGCGACTGTAGTGAAAGCAGCCCTTAGAGATCACAGCACATGTGAGTGGGCGAGCTTTTGCCGAAaagtcctgatagagtgatgtc(SEQ ID NO.5)；其中Y代表选自T或G的碱基。

PCR反应体系为25μL，其中包括2×Taq Master Mix 12.5μL，正反向引物各1μL(10nmol/L)，DNA模板1μL(100ng/μL)，双蒸水补足体积至25μL。PCR反应共计30个循环，循环前94℃预变性5min，每个循环包括94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s；循环结束后于72℃延伸5min。扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测后于于-20℃保存用于后续的酶切反应。

采用MboI限制性内切酶(Takara)对所得到的PCR产物进行酶切，酶切体系包括10×H Buffer 1μL，PCR产物5μL，MboI 2.5U，双蒸水补足体积至10μL。37℃酶切过夜后用3％的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，以确定每个样本的基因型(图1)。

表2 SNP g.-437 T>G与河蟹性早熟性状相关性的两阶段相关研究

^a野生纯合子/杂合子/突变纯合子河蟹个体数；

^b最小等位基因频率

进一步的样本验证结果表明：Vg基因SNP g.-437 T>G与河蟹性早熟之间存在着显著的相关性(OR＝0.448(95％CI 0.299-0.672)，P＝0.000)。在以低性早熟为选育指标的河蟹遗传育种研究过程中，通过对河蟹育种群体进行SNP g.-437 T>G基因分型，结合形态特征分析，优先选择基因型为GG的个体作为育种亲本，对于选育低性早熟河蟹新品种具有重要的指导意义。

序列表

<110> 江苏省淡水水产研究所

<120> 一种与中华绒螯蟹性早熟性状显著相关的SNP位点及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggctcacca atactacc 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacatcactc tatcaggact t 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actctcgtct atttccacta tc 22

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccatcctgcg acaatcac 18

<210> 5

<211> 243

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (46)

<223> y=t或g

<400> 5

cggctcacca atactaccga gtcaggcgcc tttgtctcgt cgtgaycgtc accaggttgg 60

cactcgccga taccacgaaa acaacgactg tgacagcggg ttgagatggt aatgcctggt 120

accaggatgg caggggcttt cgttagggag ggtgcatggc gactgtagtg aaagcagccc 180

ttagagatca cagcacatgt gagtgggcga gcttttgccg aaaagtcctg atagagtgat 240

gtc 243

Claims

1.一种与中华绒螯蟹性早熟性状显著相关的SNP位点，其特征在于所述的SNP位点位于中华绒螯蟹Vg基因5′-侧翼区-437bp处，碱基变异信息为SNP g.-437 T>G。

2.根据权利要求1所述的SNP位点，其特征在于所述的SNP位点GG基因型中华绒螯蟹个体出现性早熟性状的风险显著低于TT基因型个体。

3.权利要求1或2所述的SNP标记在中华绒螯蟹新品系选育中的应用，其特征在于品种选育时，选择权利要求1中所述的SNP位点基因型为GG的个体作为育种亲本。

4.一种预测中华绒螯蟹性早熟风险的方法，其特征在于通过检测权利要求1所述的SNP标记，预测中华绒螯蟹性早熟风险。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于提取不同中华绒螯蟹个体的基因组DNA，采用以PCR为基础的限制性片段长度多态法PCR-RFLP对不同个体进行基因分型，所述的SNP位点GG基因型中华绒螯蟹个体出现性早熟性状的风险显著低于TT基因型个体，从而预测中华绒螯蟹性早熟风险。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的PCR-RFLP中使用的PCR上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQ ID NO.2；使用的限制性内切酶为MboI限制性内切酶。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于提取不同中华绒螯蟹个体的基因组DNA，PCR扩增含有所述SNP位点的基因片段，通过直接测序获得所述SNP位点的序列，从而预测中华绒螯蟹性早熟风险；其中PCR扩增上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQ ID NO.2。

8.用于检测权利要求1所述的SNP位点的PCR引物，其特征在于上游引物为SEQ IDNO.1，下游引物为SEQ ID NO.2。

9.权利要求8所述的PCR引物在预测中华绒螯蟹性早熟风险和/或中华绒螯蟹品种选育中的应用。

10.一种预测中华绒螯蟹性早熟风险的试剂盒，其特征在于包含权利要求8所述的PCR引物。