CN104651523A - Inha基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵分子标记的应用及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及INHA基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵分子标记的应用及检测方法。该湘西黄牛INHA基因存在Reference SNP Cluster Report：rs41257116位点，当该位点杂合为“A/G”时，表现出超数排卵的优势。用PCR-SSCP技术检测待测湘西黄牛INHA基因Reference SNP Cluster Report：rs41257116位点的部分片段，确定待测湘西黄牛INHA基因为AA或AG型，选取以INHA基因为AG型的湘西黄牛，作为可获得较好的超数排卵性状的湘西黄牛。本方法可提高湘西黄牛超数排卵的效率。本发明所用的方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，实施方便。

Description

INHA基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵分子标记的应用及检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及INHA基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵分子标记的应用及检测方法。

背景技术

自20世纪20年代，Smith和Engle首次发现超数排卵现象以来，超数排卵技术应用于不同哺乳动物，并发挥重要作用。利用超排技术，可以充分发挥优良母畜的繁殖潜力，为胚胎移植技术提供更多的胚胎，加快育种速度。另外，超数排卵技术还用于克隆、胚胎冷冻、转基因动物生产中。湘西黄牛具有耐粗饲、抗病能力强、繁殖性能好、遗传性稳定等优点，是湖南省优良的肉役兼用型地方黄牛品种。但是目前，湘西黄牛的遗传资源的开发和利用工作同国内其他黄牛品种相比相对滞后。DNA标记技术，不会受到环境、年龄、组织的限制，是一种比较理想的遗传标记，受到了遗传育种工作者的重视。

现有的用于超数排卵的黄牛，基本上是按照牛的表型，如发情的情况、体重、体质健康、有无疾病等来选取，而且需要个体长到性成熟后才可以获得相应的超排数据信息才能去评估该个体是否具有超数排卵优势。超数排卵是一种重要的数量性状，由多个基因控制，因此，从遗传特性之一的DNA分子标记着眼，找到使湘西黄牛高效超数排卵的相关分子标记，辅助湘西黄牛育种，具有重要的现实意义。

抑制素(inhibin，INH)是一种糖蛋白类激素，主要来源于动物性腺中，由A、B两个亚单位构成的异二聚体蛋白，其主要生理功能是在下丘脑-垂体-性腺轴中起重要的调控作用，反馈性的抑制垂体促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)的释放，调控动物的生殖活动。研究表明INH是动物卵巢卵泡发育过程中的一种主要反馈调控因素，牛在发情周期中FSH、INH二者呈负相关关系。INH的α亚基(INHA)是INH发挥生物活性的重要组成部分。但未见其用作超数排卵的报道。

SNP是一种碱基替换型DNA标记，SNP作为遗传标记具有以下优势：①SNP分布广泛、数量多，基因的编码区和非编码区都可能存在大量的SNP。②SNP适于快速、规模化检测，在基因组筛选中SNP只需有无的分析，而不用分析片段的长度。③由于只存在一对等位基因，SNP等位基因频率容易估计，易于基因分型。

SSCP作为SNP的检测方法之一，它的基本原理是：单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，使其空间构象发生改变。空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。SSCP的优越性在于不需要测序就可以快速检出碱基突变。将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性。

PCR-RELP技术的基本原理是：先用PCR扩增出目的DNA片段，当DNA片段上有碱基突变时，仅一个碱基的变异就会阻止限制酶在那个区域的作用，因此在突变和不突变的个体间会产生长度的多态性；再用特异性内切酶酶切，当有碱基突变时，该DNA片段被切割成不同大小片段，酶切产物可直接在凝胶电泳上分辨；不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。

利用PCR-RFLP技术也可挑选出与超数排卵性状相关的SNP位点。但是，RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制。

发明内容

有鉴于此，本发明提供INHA基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵分子标记的应用及检测方法。本发明提供INHA基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵分子标记的应用。还提供了一种有利于准确选择出有超数排卵优势的湘西黄牛的方法，即利用PCR-SSCP技术，为湘西黄牛的超数排卵提供一种分子标记，以此分子标记作为辅助选择超数排卵湘西黄牛的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明公开了INHA基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵的分子标记的应用。

所述INHA基因的Genbank登录号为：281254。

在本发明的一些具体实施案例中，所述INHA基因含有多态性位点，所述多态性位点为INHA基因自5’端第264位，所述多态性位点具有A/G碱基的变异。

INHA基因全长为3046bp，基因序列如下所示：

也可参见序列表，如SEQ ID No.2所示。

在本发明的一些具体实施案例中，所述INHA基因自5’端第264位的碱基为A/G的杂合体。

在本发明的一些具体实施案例中，INHA基因的单链核苷酸序列自5’端第264位的碱基为G，所述INHA基因的单链核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

在本发明的一些具体实施案例中，所述动物为湘西黄牛。

本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定动物超数排卵的方法，包括如下步骤：

步骤1：获得动物基因组DNA；

步骤2：扩增INHA基因片段，对扩增产物进行检测，根据所述INHA基因片段的单链核苷酸自INHA基因5’端第264位的碱基判断所述动物是否超数排卵。

在本发明的一些具体实施案例中，所述检测为SSCP分型，当所述INHA基因片段的单链核苷酸自INHA基因5’端第264位的碱基为G，所述SSCP分型电泳图具有四条带时，所述动物超数排卵。

在本发明的一些具体实施案例中，所述检测为基因型测序，当所述INHA基因片段的自INHA基因5’端第264位碱基为A/G的杂合体时，所述动物超数排卵。

在本发明的一些具体实施案例中，所述INHA基因片段的序列如SEQ IDNo.2所示；

在本发明的一些具体实施案例中，所述扩增的引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No.3所示；所述下游引物的序列如SEQ ID No.4所示；

所述扩增的扩增体系为10×PCR Buffer 2.5μL；ddH₂O 18.3μL；dNTP2.0μL；模板1.0μL；所述上游引物和所述下游引物各0.5μL；rTaq酶0.2μL；总体积25.0μL；

所述扩增的反应条件为：

预变性：95℃，5min；

35个循环：94℃，30s；57℃，30s；72℃，30s；

延伸：72℃，10min。

本发明提供了INHA基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵分子标记的应用及检测方法。该湘西黄牛INHA基因存在Reference SNP ClusterReport：rs41257116位点，当该位点杂合为“A/G”时，表现出超数排卵的优势。用PCR-SSCP技术检测待测湘西黄牛INHA基因的Reference SNP ClusterReport：rs41257116位点的所在的部分片段，确定待测湘西黄牛INHA基因为AA或AG型，选取以INHA基因为AG型的湘西黄牛，作为可获得较好的超数排卵性状的湘西黄牛。

本发明的有益效果包括：

1、本方法可提高湘西黄牛超数排卵的效率。

2、本发明所用的方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，实施方便。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳的电泳图；其中，marker：DL2000，PCR产物249bp；

图2示实施例1中PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分型电泳图；其中泳道从左至右依次为AG、AG、AA、AG；

图3示实施例1中PCR产物的测序图谱；其中图3(A)示AA基因型的测序图谱；图3(B)示AG基因型的测序图谱。

具体实施方式

本发明公开了INHA基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵分子标记的应用及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

超数排卵：是指在母畜发情周期的适当时间，利用外源促性腺激素，增进卵巢的生理活动，激发较多个卵泡在一个发情中成熟排卵，使其比在自然情况下排出较多的卵子，从而获得更多胚胎的技术，称为超数排卵(superovulation)，简称超排。

SNP：单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),是指在某个DNA区域的单碱基替代，而这种替代在群体中表现出显著多态。

PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)，是DNA在体外酶促扩增技术，模仿体内DNA的复制过程，由变性、复性以及延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有灵敏度高、操作简便等特点。

SSCP：单链构象多态性(single strand conformation polymorphism)，当双链DNA在95℃变性变成单链DNA后，单链DNA形成一种二级结构，碱基序列的不同会导致二级结构的不同，这种不同可以通过其在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度不同被检测出来。

INHA基因：编码抑制素α亚基的DNA序列。

本发明提供的INHA基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵分子标记的应用及检测方法中所用试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1、用天根生化科技有限公司的基因组DNA提取试剂盒从湘西黄牛血液中提取基因组DNA。

2、湘西黄牛INHA基因部分片段扩增：

引物：

PCR过程：

PCR结果见图1。

3、对不同个体PCR扩增产物SSCP分型：

3μl的PCR产物与7μl的变性缓冲液(98％的去离子甲酰胺、10mmol/L的EDTA(pH8.0)、0.025％二甲苯青FF、0.025％溴酚蓝)混匀，使用PCR仪95℃变性10min，之后在冰上静置5min，以免变性的产物复性，从而获得变性的单链DNA。变性的DNA用12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶在140V电压下，4℃冰箱中电泳14h。用0.4％硝酸银将凝胶银染后显色。统计分析不同的带型，然后测定不同带型的DNA样本序列比对分析。研究发现，SSCP分型后共有两种带型(如图2)，分别命名为AA(有三条带)、AG(有四条带)。

4、对两种带型的PCR产物分别进行测序，得到AA、AG两种基因型测序图谱，如图3所示，其中图3(A)示AA，图3(B)示AG。

AA带型：INHA基因自5’末端第264位的碱基为A的纯合体；AG带型：INHA基因自5’末端第264位的碱基为A/G的杂合体。测序结果与NCBI数据库中的SNP数据库比对，发现该位点为已知突变位点(Reference SNP ClusterReport：rs41257116)。

5、对两种带型在群体中的分布进行统计，并与超数排卵性状进行相关性分析。

用SPSS 13.0中的一般线性模型(GLM)分析湖南省慈利县湘西黄牛保种区共41头湘西黄牛的INHA基因的突变与超数排卵性状之间的关系。见表1。

表1性状检测结果

左5、右5是两头不同的牛，打耳标时打了两个5号，为了区分，分别写成左5、右5。

表2电泳结果结果分析

将49头牛根据PAGE电泳的带型结果以及测序的结果进行分类，分为A、B、C、T1和T1五种类型，其中：

A指未发生突变的样本，即序列与genbank上的序列相同；

B指INHA基因自5’端第264位，具有A/G碱基的变异；

C、T1和T2指扩增片段的其他区域的变异，样本数只有编号为20、29、31(C)的三头牛，编号为13(T1)的一头牛以及牛编号为32(T2)的一头，样本数较少，因此未做统计；

没有P出的样：因为DNA的质量问题，导致编号为2、4、16的三头牛的INHA基因的PCR片段没有扩增出来，因此也未做统计。

综上，统计的时候只取了A和B两种，其中A类(即AA型)有24头、B类(即AG型)有17头，总计为41头。

研究发现AG基因型湘西黄牛个体(17头)所获得的总卵数(9.000±2.174)显著(p<0.05)高于AA基因型湘西黄牛个体(24头)所获得的总卵数(4.292±0.672)。因此，该SNP位点优势等位基因G可以作为湘西黄牛超数排卵性状的分子标记。

综上所述，湘西黄牛的AG基因型个体可获得的总卵数显著(P＜0.05)高于AA基因型个体，可以通过PCR-SSCP检测技术对湘西黄牛INHA基因进行分型，选择AG基因型个体作为超数排卵的湘西黄牛个体。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.INHA基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵的分子标记的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述INHA基因含有多态性位点，所述多态性位点为INHA基因自5’端第264位，所述多态性位点具有A/G碱基的变异。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述INHA基因自5’端第264位的碱基为A/G的杂合体。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，INHA基因的单链核苷酸序列自5’端第264位的碱基为G，所述INHA基因的单链核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述动物为湘西黄牛。

6.一种鉴定或辅助鉴定动物超数排卵的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：获得动物基因组DNA；

步骤2：扩增INHA基因片段，对扩增产物进行检测，根据所述INHA基因片段的单链核苷酸自INHA基因5’端第264位的碱基判断所述动物是否超数排卵。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测为SSCP分型，当所述INHA基因片段的单链核苷酸自INHA基因5’端第264位的碱基为G，所述SSCP分型电泳图具有四条带时，所述动物超数排卵。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测为基因型测序，当所述INHA基因片段的自INHA基因5’端第264位碱基为A/G的杂合体时，所述动物超数排卵。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述INHA基因片段的序列如SEQ ID No.2所示。

10.根据权利要求6至9任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No.3所示；所述下游引物的序列如SEQ ID No.4所示；

所述扩增的扩增体系为10×PCR Buffer 2.5μL；ddH₂O 18.3μL；dNTP2.0μL；模板1.0μL；所述上游引物和所述下游引物各0.5μL；rTaq酶0.2μL；总体积25.0μL；

所述扩增的反应条件为：

预变性：95℃，5min；

35个循环：94℃，30s；57℃，30s；72℃，30s；

延伸：72℃，10min。