CN105087820A - 基于fshr基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用 - Google Patents

基于fshr基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于FSHR基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用。所述的分子标记为猪FSHR基因片段，所述的猪FSHR基因片段含有多态性位点，所述的多态性位点为如SEQ？ID？NO.1所示序列中第1166位，所述的多态性位点具有C/T碱基的变异。所述的检测方法，包括：根据所述的分子标记的核苷酸序列设计引物；以待检测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增；判断PCR扩增产物中多态性位点的类型。本发明还公开了所述的分子标记在猪繁殖性状选择中的应用。本发明根据FSHR基因突变位点提供了基于FSHR基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用，为猪分子育种、研究猪繁殖生理机制提供基础。

Description

基于FSHR基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用
技术领域
本发明涉及动物分子育种领域，尤其涉及一种基于FSHR基因的猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用。
背景技术
分子标记辅助选择是基因工程在现代家畜育种中的一项重要应用，利用与育种性状相关的各种标记代替以表型为基础的选择，从分子水平上分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，可克服直接选择的弊端，提高选择的准确性和缩短世代间隔。
总产仔数、产活仔数等猪的繁殖性状是重要的经济性状，直接关系到养猪业的经济效益。
促卵泡素(FSH)是由垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种糖蛋白激素，在卵巢卵泡的生长、发育、分化、成熟和排卵过程中起重要作用。由于FSH是一种生物大分子，不能透过细胞膜，只有通过位于靶细胞膜上促卵泡素受体(FSHR)的介导，将信息传递到靶细胞膜内，从而发挥其生物学功能。FSHR基因的多态性研究报道主要集中在人、牛、绵羊、山羊上，目前未见FSHR基因与猪繁殖性状之间关系的研究报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种基于FSHR基因的猪繁殖性状相关的分子标记。本发明还提供了该分子标记的检测方法和应用。
为达到上述目的，本发明是通过以下的技术方案来实现的：
本发明所述的基于FSHR基因的猪繁殖性状相关的分子标记，它为猪FSHR基因片段，所述的猪FSHR基因片段含有多态性位点，所述的多态性位点为如SEQIDNO.1所示序列中第1166位，所述的多态性位点具有C/T碱基的变异。
序列表中SEQIDNO.1所示的序列为猪FSHRmRNA序列，其第1166位为多态性位点，与猪总产仔数、产活仔数紧密相关，可利用该位点开发与猪繁殖性状相关的分子标记。
本发明所述的猪FSHR基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；或所述的猪FSHR基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。当然，本发明所述的猪FSHR基因片段也可以为包含如SEQIDNO.2所示核苷酸序列的DNA片段。根据检测方法，可以选择合适长度的能够包含多态性位点的DNA片段。
本发明还提供了所述的分子标记的检测方法，包括：
(1)根据所述的分子标记的核苷酸序列设计引物；
(2)以待检测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增；
(3)判断PCR扩增产物中多态性位点的类型。
步骤(3)中，可对PCR产物进行测序或电泳分析，判断多态性位点的碱基类型。
优选的，步骤(1)中，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。利用该引物，可采用PCR-SSCP的方法准确方便的检测多态性位点的类型。
作为另一种可选择的，步骤(1)中，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。
本发明还提供了所述的分子标记在猪繁殖性状选择中的应用。
具体的，猪可以为小梅山猪、枫泾猪或大白猪。繁殖性状为总产仔数或产活仔数。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明研究发现，猪FSHR基因第10外显子存在一个突变位点(即多态性位点)，该位点位于如SEQIDNO.1所示序列的第1166位，该突变位点与猪的繁殖性状尤其是总产仔数或产活仔数相关，且容易检测，从而本发明根据该突变位点提供了一种基于FSHR基因的猪繁殖性状相关的分子标记，并提供了该分子标记的检测方法及在猪繁殖性状选择中的应用，为猪分子育种、研究猪繁殖生理机制提供基础。
附图说明
图1为实施例1猪FSHR基因第10外显子SNPs筛选结果；
图2为实施例1猪FSHR基因第10外显子SNPs上氨基酸序列比对结果；
图3为实施例1猪FSHR基因第10外显子C1166T的PCR-SSCP检测部分样本的电泳结果；
图4为实施例1基因型分型检测中AA基因型个体的测序结果；
图5为实施例1基因型分型检测中BB基因型个体的测序结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
2013年采集106头小梅山猪、42头枫泾猪和70头大白猪的耳样；同时整理了江苏农林职业技术学院小梅山猪育种中心2004年～2012年期间上述106头小梅山母猪的生产档案，共有698窝仔猪记录，主要收集产仔年份、胎次、TNB、NBA等指标。耳样(约0.15g)用耳号钳采集，-20℃冻存。用常规的酚氯仿抽提法提取猪耳样的基因组DNA，对基因组DNA进行OD值测定，计算其浓度，并用ddH2O稀释至终浓度为100ng/μL，原液-20℃保存，稀释液4℃保存。
第一步：获取猪FSHR基因外显子序列。
根据GenBank公布的人FSHR基因全序列(登录号：NG_008146)和猪FSHRmRNA序列(登录号：NM_214386，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)，比对两者的蛋白质序列，确定猪FSHR基因的所有外显子区域。猪FSHR基因共10个外显子，除外显子1、9、10外，其余外显子大小均低于100bp，不能有效扩增，并会影响测序结果的判读。
第二步：应用生物软件设计引物，引物扩增覆盖外显子区域。
采用Primer5.0软件设计3对引物，扩增猪FSHR基因第10外显子区域。3对引物分别为：FSHR-10.1、FSHR-10.2和FSHR-10.3。引物基本信息见表1。
表1猪FSHR基因引物序列
注：F代表上游引物，R代表下游引物。
第三步：PCR扩增和产物测序。
将每个个体基因组DNA样本吸取5μL进行混合，形成DNA池，混合后分别采用上述3对引物进行PCR扩增，扩增产物直接送上海生工生物公司进行测序。FSHR-10.1扩增靶向序列如SEQIDNO.3所示)。
PCR扩增反应体系为20μL，包括：10×Buffer2.0μL、25mMMg2+2.2μL、10mMdNTPs0.8μL、10μM上、下游引物各1μL、DNA模板1μL(100ng)、5U·μL-1Taq酶0.2μL、ddH2O11.8μL。
PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；31个循环(94℃变性1min，60℃～63℃退火30s，72℃延伸1min)；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。退火温度根据表1中的引物进行选择。
对不同基因型个体的PCR扩增产物进行测序分析。
第四步：序列比对，寻找突变位点。
测序结果与GenBank公布的序列进行比对，寻找突变位点。猪FSHR基因第10外显子中检测到3个SNP，分别为C1166T、T1491C、T1977C(图1)。
第五步：对突变位点进行氨基酸比对分析和酶切位点分析。
利用DNAMAN软件将SNPs所在的外显子核苷酸翻译为氨基酸序列，对突变前后的氨基酸序列进行比对，结果表明C1166T导致苏氨酸(Thr)变为异亮氨酸(Ile)，即T377I，其余突变均未能引起氨基酸的改变，属于同义突变(图2)；酶切位点分析结果表明，C1166T未能产生新的酶切位点或丧失某个酶切位点。
第六步：突变位点的分型检测。
利用PCR-SSCP技术对小梅山猪、枫泾猪和大白猪三个猪群体的FSHR基因突变位点C1166T进行分型检测。采用的引物为FSHR-10.4，引物信息见表1。引物FSHR-10.4所针对的靶向序列如SEQIDNO.2所示。
PCR-SSCP检测中，
PCR扩增反应体系为20μL，包括：10×Buffer2.0μL、25mMMg2+2.2μL、10mMdNTPs0.8μL、10μM上、下游引物各1μL、DNA模板1μL(100ng)、5U·μL-1Taq酶0.2μL、ddH2O11.8μL。
PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；31个循环(94℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸1min)；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。
SSCP检测程序为：2.5μLPCR产物和7.5μL上样缓冲液混匀，98℃变性10min，然后冰浴10min。变性后的PCR产物用10％的聚丙烯酰胺凝胶120V电泳12h，银染，拍照保存。选取不同的基因型交由上海生物工程有限公司进行测序。
结果表明，C1166T上检测到3种基因型，分别为AA、AB、BB，泳道1、2、5、6、9的基因型为AA，泳道3、4、7的基因型为AB，泳道8、10～14的基因型为BB(图3)，测序结果表明，基因型AA个体在1166bp的碱基为C(野生型)，基因型BB个体为T(突变型)(图4，图5)。
第七步：分析该位点C1166T在不同猪群中的分布情况。
在PCR-SSCP方法进行分型检测后，利用Excel软件计算3个猪群体C1166T位点基因型频率、等位基因频率、χ2和P值。
如表2，C1166T位点上，3个猪群中共检测到3种基因型与2个等位基因；小梅山猪和枫泾猪2个群体中，等位基因A为优势基因，基因频率分别为0.759、0.690，大白猪群体中，未能检测到AA型个体，等位基因B的频率达到0.964；经χ2检验，3个猪群在C1166T位点上均处于哈代-温伯格平衡状态(P值分别为0.997、0.780、0.953)。
表23个猪群FSHR基因C1166T位点的基因型频率与等位基因型频率
注：括号内数字为猪群头数。
第八步：关联分析该突变位点与繁殖性状间的关系。
应用SPSS(Version10.0)软件的GLM程序分析突变位点不同基因型与猪总产仔数和产活仔数等繁殖性状间的关系。
C1166T位点上(表3)，1～2胎小梅山母猪中，AA型个体的TNB、NBA均高于BB型个体，但差异不显著(P>0.05)；2胎以上小梅山母猪中，AA型个体的TNB、NBA最高，分别为12.88头、12.13头，与AB、BB型个体比较，差异达到极显著水平(P<0.01)，但AB、BB型个体间差异不显著(P>0.05)；所有胎次的小梅山母猪中，AA型个体的TNB比AB、BB型个体分别高0.91头(P<0.01)、1.56头(P<0.01)，AA型个体的NBA分别高0.83头(P<0.01)、1.30头(P<0.01)；3个阶段中，3种基因型个体的TNB与NBA均表现出相同的趋势：AA>AB>BB。
表3FSHR基因C1166T位点与小梅山猪繁殖性状的关联分析
注：N为窝数；TNB为总产仔数；NBA为产活仔数。
因此，在猪FSHR基因第10外显子错义突变C1166T位点上，等位基因A是在小梅山猪和枫泾猪中优势基因，基因型AA是有利基因型，能显著或极显著提高猪的总产仔数或产活仔数；同时该位点在上个群体中均处于基因平衡状态，表明该位点之前未受到自然选择压或常规选种选育压力的影响，今后该位点提升的空间较大，可以作为影响猪繁殖性状的一个重要标记。

Claims (8)

1.一种基于FSHR基因的猪繁殖性状相关的分子标记，其特征在于，它为猪FSHR基因片段，所述的猪FSHR基因片段含有多态性位点，所述的多态性位点为如SEQIDNO.1所示序列中第1166位，所述的多态性位点具有C/T碱基的变异。
2.如权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述的猪FSHR基因片段包含如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的分子标记，其特征在于，所述的猪FSHR基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；或所述的猪FSHR基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
4.一种如权利要求1～3任一项所述的基于FSHR基因的猪繁殖性状相关的分子标记的检测方法，其特征在于，包括：
(1)根据权利要求1～3任一项所述的分子标记的核苷酸序列设计引物；
(2)以待检测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增；
(3)判断PCR扩增产物中多态性位点的类型。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。
6.一种如权利要求1～3任一项所述的分子标记在猪繁殖性状选择中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，猪为小梅山猪、枫泾猪或大白猪。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，繁殖性状为总产仔数或产活仔数。
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