CN112522426A - 一种鉴定法系长白猪产仔性能高低的方法和引物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定法系长白猪产仔性能高低的方法和引物。本发明同时也公开了FSHR 91773610 C>T,MEP1A 41617218 G>T,PLA2G4A 128109061 T>C扩增的引物及利用该引物进行检测、分析和鉴定法系长白猪产仔性能高低的方法。此引物和方法可以实现母猪高产仔性能的早期选育，提高猪的总产仔数、产活仔数和健仔数，节省饲养成本，缩短选育时间。该方法实施简单，便于操作，具有很高的实践应用价值。

Description

一种鉴定法系长白猪产仔性能高低的方法和引物
技术领域
本发明是关于母猪繁殖性能的单基因单位点选择及多基因多位点联合选择的分子育种技术及引物对。
背景技术
2018年非洲猪瘟的影响，致使我国养猪业受到重创，能繁母猪头数下降，猪价暴涨。在暴利驱使下，使得全国选留能繁母猪标准降低，甚至商品母猪也被留种，种质资源下降，母猪繁殖性能降低严重。繁殖性能的传统选育方式需要至少1.2年，时间周期长。繁殖性能相关的分子育种目前集中于单突变位点的选择。而繁殖性能是低遗传力性状，它由微效多基因控制，所以单突变位点的分子选育结果存在一定局限性。所以本发明研究繁殖性能的多基因联合育种方法及应用。
有研究发现甲基多巴A亚基α（Meprin a subunit alpha, MEP1A）为繁殖性能的重要候选基因，多群体全基因组关联分析发现白杜洛克猪与二花脸猪的F2群体的总产仔数和产活仔数具有全基因组水平的关联显著性（周礼渝. 多群体全基因组关联性分析鉴别母猪繁殖性状的遗传位点[D]. 江西农业大学, 2016.）。MEP1A基因的突变与人类女性的多囊卵巢综合症有关。另外MEP1A基因也与葡萄糖代谢失衡，胰岛素敏感性降低有一定联系（UyenD.P. Lam, Elisabeth Lerchbaum, Natascha Schweighofer, Olivia Trummer,Katharina Eberhard, Bernd Genser, Thomas R. Pieber, Barbara Obermayer-Pietsch, Association of MEP1A gene variants with insulin metabolism incentral European women with polycystic ovary syndrome, Gene, 2014, 537（2）:245-252）。另有报道表明，MEP1A基因与动物的早期发育与肠道健康及相关代谢性疾病有关（Marín I. Origin and Diversification of Meprin Proteases. PLoS One. 2015 Aug19;10(8):e0135924. doi: 10.1371/journal.pone.0135924. PMID: 26288188; PMCID:PMC4545420.）。MEP家族成员的缺失可导致动物的生存能力下降（Norman LP, Jiang W,Han X, Saunders TL, Bond JS. Targeted disruption of the meprin beta gene inmice leads to underrepresentation of knockout mice and changes in renal geneexpression profiles. Mol Cell Biol. 2003; 23: 1221-1230. PMID: 12556482）。
另外也有研究发现磷脂酶A2家族IVA基因(Phospholipase A2 group IVA,PLA2G4A)为大白猪和长白猪黄体素浓度性状的重要候选基因（Bergfelder-Drüing etal., 2015）(Bergfelder-Drüing S, Grosse-Brinkhaus C, Lind B, Erbe M,Schellander K, Simianer H, Tholen E. A genome-wide association study in largewhite and landrace pig populations for number piglets born alive. PLoS One.2015 , 10(3):e0117468.)。PLA2G4A在排卵期的颗粒细胞中高表达，利用促卵泡素和人绒毛膜促性腺激素刺激后，PLA2G4A基因表达量显著升高（Diouf MN, Sayasith K, LefebvreR, Silversides DW, Sirois J, Lussier JG. Expression of phospholipase A2 groupIVA (PLA2G4A) is upregulated by human chorionic gonadotropin in bovinegranulosa cells of ovulatory follicles. Biol Reprod. 2006, 74(6):1096-103.doi: 10.1095/biolreprod.105.048579. Epub 2006 Mar 1. PMID: 16510840）。牛体外颗粒细胞受到FSK的刺激后，可以促进PLA2G4 A基因mRNA和蛋白的表达（Sayasith K,Lussier JG, Sirois J. Role of upstream stimulatory factor phosphorylation inthe regulation of the prostaglandin g/h synthase-2promoter in granulosacells. J Biol Chem 2005; 280:28885-28893）。另外也有报道称PLA2G4A基因敲除鼠表现出了低生育能力和排卵能力（. Bonventre JV, Huang Z, Taheri MR, O’Leary E, Li E,Moskowitz MA, Sapirstein A. Reduced fertility and postischaemic brain injuryin mice deficient in cytosolic phospholipase A2. Nature, 1997; 390:622-625.）。为卵巢内注射PLA2G4A特异性抑制剂，可以使得大鼠排卵数降低，总前列腺素降低（KurusuS, Iwao M, Kawaminami M, Hashimoto I. Involvement of cytosolic phospholipaseA2 in the ovulatory process in gonadotropin primed immature rats.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 1998, 58: 405-411.）。
卵泡刺激素基因受体基因(Follicle-stimulating hormone gene receptor,FSHR)为目前较为明确的繁殖性能的重要基因。FSHR基因为促卵泡素基因的受体，为G蛋白的偶联受体。FSHR在猪的子宫内膜上皮细胞、血管平滑肌细胞中均有表达。另外在卵泡期子宫内膜上皮细胞中FSHR基因的表达量高于黄体期。对FSHR基因的多态位点研究发现，有4个错义突变位点（非本专利所涉位点），这些突变位点与大白猪的总产仔数、产活仔数和健仔数均具有显著的相关性（周伟伟. 大白猪哺乳期背膘损失对繁殖性能的影响及其与候选基因FSHR多态性关联研究[D]. 中国农业科学院, 2018.）。FSHR基因也是太湖流域母猪早期胚胎发育有关的重要候选基因（赵默然,贺丽春,马翔,顾岳清,黄媛,邱玉华,李平华,黄瑞华.与太湖流域地方猪种产仔性状相关的候选基因和QTL研究进展[J].畜牧与兽医,2016,48(02):119-123.）。FSHR基因的第一外显子和第十外显子上的突变位点与小梅山猪、枫泾猪和大白猪具有不同程度的相关性（吴井生, 张跟喜, 戴国俊, 叶兰, 王金玉. FSHR基因第1外显子多态性及其与小梅山猪产仔数的关系[J].畜牧兽医学报,2012, 43(04):509-515. 吴井生, 王金玉. FSHR基因第10外显子多态性及其与小梅山猪产仔数的相关性[J].中国农业科学, 2012, 45 (13): 2728-2736.）。
以上MEP1A、PLA2G4和FSHR基因为繁殖性能的候选基因，具有研究的价值和意义。
发明内容
本发明公开了一种鉴定法系长白猪产仔性能高低的扩增含有FSHR 91773610 C>T, MEP1A 41617218 G>T, PLA2G4A 128109061 T>C 的PCR引物对和质谱鉴定的扩增引物对：见SEQ ID NO: 1-15所示；
Figure 780259DEST_PATH_IMAGE001
FSHR 91773610 C>T位点的GenBank Accession Number XM_021085881.1 突变的位点为Ssc.3: 91773610；MEP1A 41617218 G>T 位点GenBank Accession Number XM_001928416 突变的位点为Ssc.7: 41617218；PLA2G4A 128109061 T>C位点GenBankAccession Number XM_005667844 位点为Ssc.9: 12810906。
本发明进一步公开了鉴定法系长白猪产仔性能高低的试剂盒，其特征在于它包含上述的引物对和序列产物；其中鉴定猪繁殖性能高低包括：总产仔数、产活仔数和健仔数。
本发明同时也公开了一种单SNP位点鉴定方法，此方法是上述的引物对，以每个猪的DNA为模板进行PCR扩增，将扩增获得的产物进行普通测序或直接将猪的DNA利用质谱引物进行测序；测序获得测序序列、测序峰图或质谱测序获得的plot图、测序分型结果，通过测序峰图、测序序列见SEQ ID NO: 16-18或质谱测序获得的plot图、测序分型结果可知每个猪的FSHR 91773610位点、MEP1A 41617218位点和PLA2G4A 128109061位点的突变类型。这3个位点的突变类型即可用于后期母猪繁殖性能的分子育种，这些位点的特征及选育原则：FSHR 91773610位点的TT型个体作为总产仔数选育；MEP1A 41617218位点TG型杂合个体的产活仔数选育；PLA2G4A 128109061位点的TT型个体的总产仔数、产活仔数和健仔数的选育；其中FSHR 91773610位点的TT型个体为FSHR 91773610 C>T多态位点的碱基均为T的猪；MEP1A 41617218位点GT型个体为MEP1A 41617218G>T多态位点的碱基为G和T的猪；PLA2G4A128109061位点的TT型个体为PLA2G4A 128109061 T>C多态位点的碱基均为T的猪。本发明所述FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点在育种实践中的应用：其中FSHR 91773610 C>T位点选择TT型、MEP1A 41617218 G>T位点选择GT型和PLA2G4A 128109061 T>C位点选择TT型个体可以进行早期的留种选育。
本发明进一步公开了FSHR 91773610 C>T位点和MEP1A 41617218 G>T 位点联合鉴定的方法；此方法是利用上述的引物对，以每个猪的DNA为模板进行PCR扩增，将扩增获得的产物进行普通测序或直接将猪的DNA利用质谱引物进行测序；测序获得测序序列、测序峰图或质谱测序获得的plot图、测序分型结果；通过测序峰图、测序序列见SEQ ID NO: 16-18或质谱测序获得的plot图、测序分型结果可知每个猪的FSHR 91773610位点和MEP1A41617218位点的突变类型。这2个位点的突变类型即可用于后期母猪繁殖性能的分子育种，其特征及选育原则包括：FSHR 91773610 C>T位点和MEP1A 41617218 G>T 位点联合鉴定获得的所有结果；其中FSHR 91773610 C>T位点和MEP1A 41617218 G>T 位点联合TTGT个体用于产活仔数和健仔数的选育；联合分析是指FSHR 91773610位点的TT型个体为FSHR91773610 C>T多态位点的碱基均为T的猪，同时 MEP1A 41617218位点GT型个体为MEP1A41617218 G>T多态位点的碱基为G和T的猪。其中FSHR 91773610 C>T位点和MEP1A41617218 G>T位点联合TTGT个体的雌性个体可以进行早期的留种选育或选种选配。
本发明更进一步公开了MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合鉴定方法。此方法是利用所述的引物对，以每个猪的DNA为模板进行PCR扩增，将扩增获得的产物进行普通测序或直接将猪的DNA利用质谱引物进行测序；测序获得测序序列、测序峰图或质谱测序获得的plot图、测序分型结果。通过测序序列、测序峰图见SEQ ID NO: 16-18或质谱测序获得的plot图、测序分型结果可知每个猪的MEP1A 41617218G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点的突变类型。这2个位点的突变类型即可用于后期母猪繁殖性能的分子育种，其特征及选育原则包括：MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合鉴定所得的所有结果和应用；MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061T>C位点联合分析GTTT个体和TTTT个体用于总产仔数、产活仔数和健仔数的选育。联合分析是指MEP1A 41617218位点的GT型个体为MEP1A 41617218 G>T多态位点的碱基为G和T的猪，同时 PLA2G4A 128109061位点TT型个体为PLA2G4A 128109061 T>C多态位点的碱基均为T的猪。或者MEP1A 41617218位点的TT型个体为MEP1A 41617218 G>T多态位点的碱基均为T的猪，同时 PLA2G4A 128109061位点TT型个体为PLA2G4A 128109061 T>C多态位点的碱基均为T的猪。其中MEP1A 41617218G>T位点、PLA2G4A 128109061 T>C位点联合GTTT个体和TTTT的雌性个体可以进行早期的留种选育或选种选配。
本发明还公开了FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A128109061 T>C位点联合鉴定方法，此方法是利用上述的引物对，以每个猪的DNA为模板进行PCR扩增，将扩增获得的产物进行普通测序或直接将猪的DNA利用质谱引物进行测序；测序获得测序序列、测序峰图或质谱测序获得的plot图、测序分型结果。通过测序序列、测序峰图见SEQ ID NO: 16-18或质谱测序获得的plot图、测序分型结果可知每个猪的FSHR91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109 061 T>C位点的突变类型。这3个位点的突变类型即可用于后期母猪繁殖性能的分子育种，其特征及选育原则包括：FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合分析所得的所有结果；FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A128109061 T>C位点联合分析TTGTTT个体和CTGGCT个体在总产仔数、产活仔数和健仔数方面的选育；其中联合分析是FSHR 91773610 C>T多态位点的碱基均为T的猪，同时具有MEP1A41617218 G>T多态位点的碱基为G和T的猪，另外同时具有PLA2G4A 128109061 T>C多态位点的碱基均T的猪； FSHR 91773610 C>T多态位点的碱基为C和T的猪，同时具有MEP1A41617218 G>T多态位点的碱基均为G的猪，另外PLA2G4A 128109061 T>C多态位点的碱基为C和T的猪。
FSHR 91773610 C>T相关引物扩增产物的测序序列 见SEQ ID NO: 16
AAGCTTCTGGCGAGATGGTGAGTCCAGTTTAGCCAAAGAATTTGACACGATGTACAGTGAATTTGACTATGACTTATGCAATGAAGTGGTTGATGTGATTTGCTCCCCTGAGCCAGATGCCTTCAATCCATGTGAAGATATCATGGGGCATGATATTCTCAGAGTCTTAATATGGTTTATTAGTATCCTTGCCATCACTGGGAACATCATAGTGCTGGTGATCCTGATCACCAGCCAATACAAACTCACAGTCCCTCGGTTCCTTATGTGTAATCTGGCCTTTGCCGATCTCTGCATTGGAATCTACCTCCTGCTCATAGCATCAGTTGATATCCATACCAAAACCCAAATACCACAAA
MEP1A 41617218 G>T相关引物扩增产物的测序序列见SEQ ID NO: 17
GGTTTTGCTCGTCCGAGATTTCTCCRGGTCCTGCAGGACACCGGTTCAGGGGGACAAGCTCGGAGCCCTCGATTCTATAGCTCASAGGGCTACGGCTTGGGGCTGACCGTATACCCTCATGGTGGCATGAACTCCKAGCMCTCTGAGTACKTGGGACTTGCCTTTCATCTGTGCASTGSAGAGAATGACGCGGTCCTGGAGTGGCCCGTGCAGYCAGGCASGTGATCATGACGATCCTGGACCAGGAACCGGATGTCARGAAGAGAATGTCCTCWRGCTTGGTGTTCWCTACCTCCCAGTCCCARACCTCTCCGGSTASGTGGTTATWAAAACTGTGCACCCCAGCCCCACCCCCGCCCTGGAGGGCCAACAGATGTGATTCTCATCTGTGCTGGAGGGATTAACTTTCCTCTCACATTTTCCTSSCTCGGAGGA
PLA2G4A 128109061 T>C相关引物扩增产物的测序序列见SEQ ID NO: 18
GGGCATGAYATGTCAGCCACAACCCTCTTTTACTTCTCACACCACAGAAAATTAAAAGATACGTTGAGTCTTTATGGAAGAAGAAGAGCTCTGGACAACCTGTCACCTTTACTGATATCTTTGGGATGTTAATAGGAGAAACACTAATTCATAATGTAAGCTCTGGCTTAGTCTACAATCCTTCTGGTACAAGAAGGCCATGACTCTCATAATGTTCTGAATGAGACAAAATATGATACATTTTGTAAAAGTCAGTTGACTCAGCTTATCCTATCTAAATGTCCTGAGTACATACTCCCTGCCAGATGTTGACTCTCCCACCTTTCATTCTACYAAAAA
本发明所述FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合鉴定方法在育种实践中的应用：其中FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合TTGTTT个体、CCTTTT个体和CTGGCT的雌性个体进行早期的留种选育。实验结果显示：FSHR 91773610 C>T位点和MEP1A41617218 G>T 位点联合鉴定所得的所有结果；其中FSHR 91773610 C>T位点和MEP1A41617218 G>T 位点联合TTGT个体的产活仔数和健仔数表型指标和估计育种值的综合指标更好。
上述联合分析在育种实践中的应用FSHR 91773610 C>T位点和MEP1A 41617218 G>T 位点联合TTTT型雌性个体与TTGT型雌性个体进行早期留种选育。选配计划的制订过程中：这两个位点为TTTT型个体与TTGT型个体的父本和母本（或母本和父本）杂交的后代均可用于留种，注意避免同型父本和母本杂交。注意此方法适用于长白猪、大白猪和杜洛克猪品种。
利用上述引物对和方法，进行选育的试验结果表明：FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合分析TTGTTT个体和CTGGCT个体的总产仔数、产活仔数和健仔数表型指标和估计育种值的综合指标更好。
本发明更加详细的描述如下：
本发明提供了一种鉴定猪繁殖性能高低的方法和引物对。提供了扩增FSHR91773610 C>T,MEP1A 41617218 G>T, PLA2G4A 128109061 T>C 的普通PCR的引物对和质谱鉴定的扩增引物对（序列命名方式基因名称+位点染色体位置（sus scrofa 11.1）+突变核苷酸类型）。
本发明提供的鉴定猪繁殖性能（总产仔数、产活仔数和健仔数）高低的试剂盒也属于本发明的保护范围。利用上述引物对，以猪DNA为模板，扩增序列DNA的序列顺序和组成。
另外一种单SNP位点鉴定并辅助选择的方法属于本发明的保护范围。该方法为FSHR 91773610位点的TT型个体的总产仔数估计育种值更高。MEP1A 41617218位点TG型杂合个体的产活仔数表型值更高。PLA2G4A 128109061位点的TT型个体的健仔数表型值更高，总产仔数、产活仔数和健仔数的估计育种值更高。
上述FSHR 91773610位点的TT型个体为FSHR 91773610 C>T多态位点的碱基均为T的猪；
上述MEP1A 41617218位点GT型个体为MEP1A 41617218 G>T多态位点的碱基为G和T的猪；
上述PLA2G4A 128109061位点的TT型个体为PLA2G4A 128109061 T>C多态位点的碱基均为T的猪。
上述的FSHR 91773610 C>T位点的GenBank Accession Number XM_021085881.1突变的位点为Ssc.3: 91773610。MEP1A 41617218 G>T 位点GenBank Accession NumberXM_001928416 突变的位点为Ssc.7: 41617218，属于本专利权力要求范围；PLA2G4A128109061 T>C位点GenBank Accession Number XM_005667844 位点为Ssc.9:128109061，属于本专利权力要求范围。
本发明提供的一种FSHR 91773610 C>T位点和MEP1A 41617218 G>T 位点联合鉴定并辅助选择的方法属于本发明的保护范围。包括：FSHR 91773610 C>T位点和MEP1A41617218 G>T 位点联合鉴定所得的所有结果和应用；尤其是FSHR 91773610 C>T位点和MEP1A 41617218 G>T 位点联合TTGT个体的产活仔数和健仔数表型指标和估计育种值的综合指标更好；利用于繁殖性能的分子育种。
上述联合分析是指FSHR 91773610位点的TT型个体为FSHR 91773610 C>T多态位点的碱基均为T的猪，同时MEP1A 41617218位点GT型个体为MEP1A 41617218 G>T多态位点的碱基为G和T的猪。
上述联合分析在育种实践中的应用FSHR 91773610 C>T位点和MEP1A 41617218 G>T 位点联合TTTT型个体与TTGT型雌性个体进行早期留种选育。选配计划的制订过程中：这两个位点为TTTT型个体与TTGT型个体的父本和母本（或母本和父本）杂交的后代均可用于留种，注意避免同型父本和母本杂交。注意此方法适用于长白猪、大白猪和杜洛克猪品种。
本发明提供的MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合鉴定并辅助选择的方法属于本发明的保护范围。包括：MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A128109061 T>C位点联合鉴定所得的所有结果和应用；MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A128109061 T>C位点联合分析GTTT个体和TTTT个体的产活仔数和健仔数表型指标及总产仔数、产活仔数和健仔数的估计育种值的综合指标更好；利用于繁殖性能的分子育种。
上述联合分析是MEP1A 41617218 G>T多态位点的碱基为G和T的猪，同时PLA2G4A128109061 T>C多态位点的碱基均T的猪； MEP1A 41617218 G>T多态位点的碱基均为T的猪，同时PLA2G4A 128109061 T>C多态位点的碱基均T的猪。
上述联合分析在育种实践中的应用MEP1A 41617218 G>T 位点和PLA2G4A128109061 T>C位点联合GTTT型个体与TTTT型雌性个体进行早期留种选育。选配计划的制订过程中：这两个位点为GTTT型个体与TTTT型个体的父本和母本（或母本和父本）杂交的后代均可用于留种，注意避免同型父本和母本杂交。注意此方法适用于长白猪、大白猪和杜洛克猪品种。
本发明公开的FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A128109061 T>C位点联合鉴定并辅助选择的方法属于本发明的保护范围。包括：FSHR91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合分析所得的所有结果和应用；FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A128109061 T>C位点联合分析TTGTTT个体和CTGGCT个体的总产仔数、产活仔数和健仔数表型指标和估计育种值的综合指标更好，利用于繁殖性能的多基因分子育种。
上述联合分析是FSHR 91773610 C>T多态位点的碱基均为T的猪，同时具有MEP1A41617218G>T多态位点的碱基为G和T的猪，另外同时具有PLA2G4A 128109061 T>C多态位点的碱基均T的猪；FSHR 91773610 C>T多态位点的碱基为C和T的猪，同时具有MEP1A41617218 G>T多态位点的碱基均为G的猪，另外PLA2G4A 128109061 T>C多态位点的碱基为C和T的猪；
上述联合分析在育种实践中的应用：FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合TTGTTT个体、CCTTTT个体和CTGGCT的雌性个体可以进行早期的留种选育。选配计划的制订过程中：FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合位点为TTGGTT个体作为父本与TTGTTT个体作为母本（TTGGTT个体作为母本与TTGTTT个体作为父本）杂交的后代选留TTGTTT个体后代均可用于留种，其余TTGGTT型个体择优留种。FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合位点为TTGGTT个体作为父本与CTGGCT个体作为母本（或者TTGGTT个体作为母本与CTGGCT个体作为父本）杂交的后代选留CTGGCT个体后代均可用于留种，其余TTGGTT型个体择优留种。注意此方法适用于长白猪、大白猪和杜洛克猪品种。
上述方法中，利用猪DNA样品为模板，利用上述引物进行PCR扩增。得到PCR产物，进行测序和比对，获得FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A128109061 T>C位点的碱基类型进行选育。本发明提供的引物对和方法可对待选母猪进行繁殖性能的早期筛选和繁殖性能的选种选配计划。解决了实际生产中繁殖性能选育时间长，育种费用大的问题。此方法和技术检测费用低，在猪的育种应用中具有实践意义。
本发明主要解决了母猪繁殖性能的分子育种问题，重点考察了对母猪总产仔数、产活仔数和健仔数进行FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A128109061 T>C位点的单SNP位点选育和双SNP位点联合选育及三SNP位点联合选育的方法、效果及应用，主要的难点在于突变位点的发现，SNP位点选育和双SNP位点联合选育及三SNP位点联合选育及应用。
本发明公开的一种鉴定法系长白猪产仔性能高低的方法和引物与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）FSHR 91773610位点的TT型个体的总产仔数估计育种值更高。MEP1A 41617218位点TG型杂合个体的产活仔数表型值更高。PLA2G4A 128109061位点的TT型个体的健仔数表型值更高，总产仔数、产活仔数和健仔数的估计育种值更高。
（2）MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合分析GTTT个体和TTTT个体的产活仔数和健仔数表型指标及总产仔数、产活仔数和健仔数的估计育种值的综合指标更好。
（3）FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合分析TTGTTT个体和CTGGCT个体的总产仔数、产活仔数和健仔数表型指标和估计育种值的综合指标更好。
附图说明
图1 FSHR 91773610 C>T位点碱基突变测序结果；
图2 MEP1A 41617218 G>T位点碱基突变测序结果；
图3 PLA2G4A 128109061 T>C位点碱基突变测序结果；
图4 FSHR 91773610 C>T位点的质谱plot图；其中（1）为75头猪的质谱结果，（2）为265头猪的质谱结果；
图5 MEP1A 41617218 G>T位点的质谱plot图；其中（1）为75头猪的质谱结果，（2）为265头猪的质谱结果；
图6 PLA2G4A 128109061 T>C位点的质谱plot图；其中（1）为75头猪的质谱结果，（2）为265头猪的质谱结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
该猪样品、繁殖性能数据和系谱数据来自于广西首牧种猪育种有限公司的法系大白猪。
一、猪FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061T>C突变位点的确定。
（1）采集猪耳样，利用DNA提取试剂盒，提取猪耳组织DNA.
（2）根据猪FSHR、MEP1A和PLA2G4A的基因GenBank Accession Number XM_021085881.1、XM_001928416 和XM_005667844，设计并合成引物如下表1：
表1突变位点的PCR扩增引物
Figure 875254DEST_PATH_IMAGE002
FSHR的引物在附图部分说明。
（3）以猪耳DNA为模板，利用上引物及PCR 扩增体系：基因组 DNA 200 ng，10×PCR扩增缓冲液 5µL，dNTPs 终浓度为 10 mM，上、下游引物各 50 ng，Taq DNA 聚合酶 0.75mmol/L，用 ddH2O 补足体系至50 µL。
PCR 扩增程序：95℃预变性 5 min；95℃变性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 30s，共 35 个循环；最后 72℃延伸 10 min；4℃ ∞。扩增后，产生产物1和2和3。
（4）测序及测序结果如下：
将PCR扩增产物进行测序，测序后获得测序峰图如图1-3。如箭头所示，在染色体Ssc7：41617218 和9：128109061位置出现G>T和T>C的突变。
（5）利用飞行质谱测序进行大群体测序（小群体可不用此部分）
质谱测序所有如下表2引物。获得所有位点突变信息表3。如下图4-6。
表2突变位点位置质谱引物信息
Figure 805250DEST_PATH_IMAGE003
表3突变位点位置信息及突变类型信息
Figure 971789DEST_PATH_IMAGE004
（6）对猪的基因型与母猪的总产仔数、产活仔数、健仔数的表型值和估计育种值以最小二乘法开展关联分析。具体方法参照（蒲蕾,代宇星,张跃博,张龙超,郭亮,王立贤.杜洛克猪HLCS基因多态位点与生长发育性状的相关性分析[J].中国畜牧兽医, 2020, 47(06):1800-1808. 和蒲蕾,张龙超,王立刚,施辉毕,王立贤. 杜洛克猪饲料利用效率性状的遗传参数估计及其相关性分析[A]. 中国畜牧兽医学会.中国猪业科技大会暨中国畜牧兽医学会2015年学术年会论文集[C].中国畜牧兽医学会:中国畜牧兽医学会,2015:1.）
遗传参数估计利用动物模型多性状约束最大似然法（DFREML）计算估计育种值。
关联分析使用的模型为：
Y＝μ＋G＋P＋W＋e
式中，Y为测得性状，μ为总体均数，G为基因型效应；P为胎次；W初配日龄为协变量；e为随机误差。
（7）单位点关联结果如下：
表4 FSHRC>T基因突变位点与法系长白猪繁殖性能的表型性状关联分析结果
Figure 596806DEST_PATH_IMAGE005
表5 FSHR C>T基因突变位点与法系长白猪繁殖性能的表型性状关联分析结果
Figure 190598DEST_PATH_IMAGE006
同列上标不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母表示差异不显著。
表6 MEP1A T>G基因突变位点与法系长白猪繁殖性能的表型性状关联分析结果
Figure 330592DEST_PATH_IMAGE007
同列上标不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母表示差异不显著。
表7 MEP1A T>G基因突变位点与法系长白猪繁殖性能的EBV性状关联分析结果
Figure 238505DEST_PATH_IMAGE008
表8 PLA2G4AC>T基因突变位点与法系长白猪繁殖性能的表型性状关联分析结果
Figure 45924DEST_PATH_IMAGE009
同列上标不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母表示差异不显著。
表9 PLA2G4AC>T基因突变位点与法系长白猪繁殖性能的EBV性状关联分析结果
Figure 748301DEST_PATH_IMAGE010
同列上标不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母表示差异不显著。
通过表4-9表明，FSHR C>T基因突变位点TT型个体的总产仔数方面较其他类型个体更高。MEP1A T>G基因突变位点的TG型杂合个体的健仔数表型值较其他类型更高。PLA2G4AC>T基因突变位点的TT型的总产仔数、产活仔数和健仔数的估计育种值更高，表型值方面健仔数也更高。
（8）突变位点联合分析结果如下
表10 FSHR与MEP1A2位点与法系长白猪繁殖性能的表型性状联合分析结果
Figure 375592DEST_PATH_IMAGE011
同列上标不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母表示差异不显著。
表11 FSHR与MEP1A2位点与法系长白猪繁殖性能的EBV性状联合分析结果
Figure 883933DEST_PATH_IMAGE012
同列上标不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母表示差异不显著。
表12 FSHR与PLA2G4A2位点与法系长白猪繁殖性能的表型性状联合分析结果
Figure 483542DEST_PATH_IMAGE013
同列上标不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母表示差异不显著。
表13 FSHR与PLA2G4A2位点与法系长白猪繁殖性能的EBV性状联合分析结果
Figure 419137DEST_PATH_IMAGE014
同列上标不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母表示差异不显著。
表14 MEP1A与PLA2G4A2位点与法系长白猪繁殖性能的表型性状联合分析结果
Figure 533723DEST_PATH_IMAGE015
同列上标不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母表示差异不显著。
表15 MEP1A与PLA2G4A2位点与法系长白猪繁殖性能的EBV性状联合分析结果
Figure 517860DEST_PATH_IMAGE016
同列上标不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母表示差异不显著。
表9-15可知，FSHR 91773610 C>T位点和MEP1A 41617218 G>T 位点联合TTGT个体的产活仔数和健仔数表型指标和估计育种值的综合指标更好；MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合分析GTTT个体和TTTT个体的产活仔数和健仔数表型指标及总产仔数、产活仔数和健仔数的估计育种值的综合指标更好。
表16 FSHR、MEP1A与PLA2G4A3位点与法系长白猪繁殖性能的表型性状联合分析
Figure 299871DEST_PATH_IMAGE017
同列上标不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母表示差异不显著。
表17 FSHR、MEP1A与PLA2G4A3位点与法系长白猪繁殖性能的EBV性状联合分析
Figure 344051DEST_PATH_IMAGE018
同列上标不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母表示差异不显著。
FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合分析TTGTTT个体和CTGGCT个体的总产仔数、产活仔数和健仔数表型指标和估计育种值的综合指标更好（表16-17）。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津农学院
<120> 一种鉴定法系长白猪产仔性能高低的方法和引物
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgagcaggtg gaggca 16
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
catggggctg aacagg 16
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
actttgacgg aaacccc 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccgaggagga aatgtga 17
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaagggccgg agga 14
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtagaatgaa aggtgggaga 20
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acgttggatg tgagccagat gccttcaatc 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acgttggatg tcaggatcac cagcactatg 30
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cccgtgttta ttagtatcct tgcca 25
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acgttggatg agcgggtagg tggttataag 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acgttggatg aaagttaatc cctccggcac 30
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gagggccaac agatg 15
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
acgttggatg ggacaacctg tcacctttac 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
acgttggatg tcatggcctt cttgtaccag 30
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggaactcata atgtaagctc tggcttag 28
<210> 16
<211> 359
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aagcttctgg cgagatggtg agtccagttt agccaaagaa tttgacacga tgtacagtga 60
atttgactat gacttatgca atgaagtggt tgatgtgatt tgctcccctg agccagatgc 120
cttcaatcca tgtgaagata tcatggggca tgatattctc agagtcttaa tatggtttat 180
tagtatcctt gccatcactg ggaacatcat agtgctggtg atcctgatca ccagccaata 240
caaactcaca gtccctcggt tccttatgtg taatctggcc tttgccgatc tctgcattgg 300
aatctacctc ctgctcatag catcagttga tatccatacc aaaacccaaa taccacaaa 359
<210> 17
<211> 435
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggttttgctc gtccgagatt tctccrggtc ctgcaggaca ccggttcagg gggacaagct 60
cggagccctc gattctatag ctcasagggc tacggcttgg ggctgaccgt ataccctcat 120
ggtggcatga actcckagcm ctctgagtac ktgggacttg cctttcatct gtgcastgsa 180
gagaatgacg cggtcctgga gtggcccgtg cagycaggca sgtgatcatg acgatcctgg 240
accaggaacc ggatgtcarg aagagaatgt cctcwrgctt ggtgttcwct acctcccagt 300
cccaracctc tccggstasg tggttatwaa aactgtgcac cccagcccca cccccgccct 360
ggagggccaa cagatgtgat tctcatctgt gctggaggga ttaactttcc tctcacattt 420
tcctssctcg gagga 435
<210> 18
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gggcatgaya tgtcagccac aaccctcttt tacttctcac accacagaaa attaaaagat 60
acgttgagtc tttatggaag aagaagagct ctggacaacc tgtcaccttt actgatatct 120
ttgggatgtt aataggagaa acactaattc ataatgtaag ctctggctta gtctacaatc 180
cttctggtac aagaaggcca tgactctcat aatgttctga atgagacaaa atatgataca 240
ttttgtaaaa gtcagttgac tcagcttatc ctatctaaat gtcctgagta catactccct 300
gccagatgtt gactctccca cctttcattc tacyaaaaa 339

Claims (7)

1.一种鉴定法系长白猪产仔性能高低的扩增含有FSHR 91773610 C>T, MEP1A 41617218 G>T, PLA2G4A 128109061 T>C 的PCR的引物对和质谱鉴定的扩增引物对：见SEQID NO: 1-15所示；
Figure 797108DEST_PATH_IMAGE001
Figure 894377DEST_PATH_IMAGE002
。
2.一种鉴定法系长白猪产仔性能高低的引物对和试剂盒，其特征在于它包含权利要求1中的引物对和序列产物；其中鉴定猪繁殖性能高低包括：总产仔数、产活仔数和健仔数。
3.一种单SNP位点鉴定方法，此方法是利用权利要求1的引物对，以每个猪的DNA为模板进行PCR扩增，将扩增获得的产物进行普通测序或直接将猪的DNA利用质谱引物进行测序；测序获得测序序列、测序峰图或质谱测序获得的plot图、测序分型结果，通过测序峰图、测序序列见SEQ ID NO: 16-18或质谱测序获得的plot图、测序分型结果可知每个猪的FSHR91773610位点、MEP1A 41617218位点和PLA2G4A 128109061位点的突变类型；这3个位点的突变类型即可用于后期母猪繁殖性能的分子育种，这些位点的特征及选育原则：FSHR91773610位点的TT型个体在母猪总产仔数方面的应用；MEP1A 41617218位点TG型杂合个体在产活仔数方面的选育；PLA2G4A 128109061位点的TT型个体在母猪总产仔数、产活仔数和健仔数方面的选育。
4.一种FSHR 91773610 C>T位点和MEP1A 41617218 G>T 位点联合鉴定的方法；此方法是利用权利要求1所述的引物对，以每个猪的DNA为模板进行PCR扩增，将扩增获得的产物进行普通测序或直接将猪的DNA利用质谱引物进行测序；测序获得测序序列、测序峰图或质谱测序获得的plot图、测序分型结果；通过测序峰图、测序序列见SEQ ID NO: 16-18或质谱测序获得的plot图、测序分型结果可知每个猪的FSHR 91773610位点和MEP1A 41617218位点的突变类型；这2个位点的突变类型即可用于后期母猪繁殖性能的分子育种，其特征及选育原则包括：FSHR 91773610 C>T位点和MEP1A 41617218 G>T 位点联合鉴定所得的所有结果及其应用；其中FSHR 91773610 C>T位点和MEP1A 41617218 G>T 位点联合TTGT个体在母猪产活仔数和健仔数的应用。
5.一种MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合鉴定方法，此方法是利用权利要求1所述的引物对，以每个猪的DNA为模板进行PCR扩增，将扩增获得的产物进行普通测序或直接将猪的DNA利用质谱引物进行测序；测序获得测序序列、测序峰图或质谱测序获得的plot图、测序分型结果；通过测序峰图、测序序列见SEQ ID NO: 16-18或质谱测序获得的plot图、测序分型结果可知每个猪的MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A128109061 T>C位点的突变类型；MEP1A 41617218 G>T 位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合GTTT型个体与TTTT型雌性个体进行早期留种选育。
6.一种FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合鉴定方法，此方法是利用权利要求1的引物对，以每个猪的DNA为模板进行PCR扩增，将扩增获得的产物进行普通测序或直接将猪的DNA利用质谱引物进行测序；测序获得测序峰图、测序序列见SEQ ID NO: 16-18或质谱测序获得的plot图、测序分型结果；通过测序序列、测序峰图或质谱测序获得的plot图、测序分型结果可知每个猪的FSHR 91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点的突变类型；其中FSHR91773610 C>T位点、MEP1A 41617218 G>T位点和PLA2G4A 128109061 T>C位点联合TTGTTT个体、CCTTTT个体和CTGGCT的雌性个体进行早期的留种选育。
7.权利要求1所述鉴定法系长白猪产仔性能高低的扩增含有FSHR 91773610 C>T,MEP1A 41617218 G>T, PLA2G4A 128109061 T>C 的PCR的引物对和质谱鉴定的扩增引物对及分析结果在猪育种过程中应用。
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