CN116083596B - 一种与牛初生体高相关的snp位点及应用 - Google Patents
一种与牛初生体高相关的snp位点及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了牛X染色体上与牛初生体高相关的SNP位点，所述SNP标记的位点为牛参考基因组ARS‑UCD1.3版本X染色体上第801328个核苷酸位点，该位点的碱基是A或G。本发明通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，提高牛的初生体高，加快牛遗传改良进展从而有效提高肉牛育种的经济效益。
Description
用技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及牛染色体上与初生体高相关的SNP位点及其应用。
背景技术
肉牛业是我国畜牧业的重要组成部分，现阶段国内活牛及牛肉价格节节攀升，肉牛存栏量持续下降，牛源极度紧张。从市场供应来看，我国牛肉需求仍存在巨大缺口。从牛肉消费情况来看，我国牛肉仍呈刚性需求。随着人民生活水平的提高，我国牛肉需求已经进入质与量并举的时代，人们对高档牛肉的消费需求日益增长，由于高档肉牛的繁育、饲养及高档牛肉生产的技术要求较高，国产高档牛肉市场占有率还很低。
要提高牛的产肉量，改善肉的品质，除选择好品种和改善管理条件以外，必须认识牛的生长发育规律。初生体高，是初生体尺中遗传力较高的性状之一。初生体重和初生体尺是衡量犊牛胎儿期生长发育情况的重要指标，同时也与家畜对环境的适应能力、畜体经济价值、生产价值和繁殖性能等密切相关。不同体尺的犊牛被饲喂到同一体重,其增重率和饲养效率也不同，且体尺受遗传影响很大,可以直接影响体重。所以，初生体高具有很高的经济价值，为加速该性状的分子育种进程，可采用全基因组关联分析鉴定影响中国牛初生体高的显著位点。有研究表明，初生体高属于高等遗传力性状，因此，利用遗传手段对资源群体牛初生体高进行改良是可行的。目前，利用全基因组关联分析(genome-wideassociation study,GWAS)的方法已在牛基因组上鉴别到诸多与初生体高相关的QTLs和大量单核苷酸多态位点(single nucleotide polymorphisms,SNPs)。然而，初生体高是受多个基因控制的数量性状，牛基因组上还存在大量未被发掘的影响初生体高的数量性状基因座(quantitative trait loci,QTLs)，鉴定新的影响初生体高的分子标记，将其中具有显著效应的分子标记加入到分子标记辅助选择(marker assisted selection,MAS)、基因组选择(Genomic selection，GS)中则能加快初生体高的遗传改良进展，进而提高后代肉牛初生体高，增加养殖企业的经济效益。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供通过GWAS分析策略鉴别到了影响牛初生体高的显著SNP，将其用于分子标记辅助选择和基因组选择中，选择对提高初生体高有利的基因型进行留种，从而逐代提高优势等位基因的基因频率，则能加快种牛育种改良的进程，为肉牛养殖带来巨大经济效益。
首要目的在于确定一种影响牛初生体高的SNP分子标记。所述分子标记位于牛基因组ARS-UCD1.3版本参考序列X染色体(NC_037357.1)上。
所述的分子标记的SNP位点对应于牛基因组ARS-UCD1.3版本参考序列X染色体(NC_037357.1)上第801328位A>G突变。
所述SNP标记如SEQ ID NO:1所示的序列自5’端起第209位碱基是A或G,
SEQ ID NO.1
CCCTGCAATTGTGCCATACGAACTCCCTTTTGTAAAGGCGTCATTTTATTAGGCACAGTTATCTGTGGTTTAAAAGCAAATCCATCATCCCAAGGGGTTTCAGGATTGAAAGGAGGAGGCTCGACCAAAGGTGCAGTTGGTCCAGAGAGAAAGATCTGTTCTTGACTTCTATCATTCTTTTGGCTCTTATTTTTCATTTTTATGGATTR(A>G)TTTCTCTTCCTCATCACCTATGTTATCATATAAATTCATTTCCTCCATTTGTTCTTGTATTTGTTCTACAGAATTCCCTGAATCCGAGGTTTTGGATTGCAGAGGTTCAAAAGCTGTACTAATAAGATTCCGTACTGATCATACAGACAAAGGAATCTTTTTGCCGCGTTTGTAGGCATGGCACAGGCAACGCATAACTTCTTGCCATTCCTCATGCCTCAAAGTCCCTTTATCTGGATCTAGCCAGTAGCAATATTTTTCAATGGCAGAAAACAATTCTTAAAAGAGGAATGAGAAACCTCAACCCCTGAACTTTTTAATAAAGTTTTTAACTCTTGCATATAGTCACTATGCTTAGAAGGATTTTGCCCCATTGTTACCCTGATTGACAAATCTGCAGGGGTGTACTTACCAAGTACATTCCTCGTCCTCTGAGCTGGCCGGATTTCCCTG；
本发明的另一目的在于提供上述的分子标记在筛选高初生体高的牛个体的应用，具体为，检测牛NC_037357.1号染色体上的分子标记，检测所述分子标记SEQ ID NO:1的5’端第209位单核苷酸是A还是G，淘汰SEQ ID NO:1第209位单核苷酸含有G的个体，选择第801328个核苷酸位点的AA型个体作为种牛；
本发明的另一目的在于提供一种用于鉴定上述影响牛初生体高的分子标记的引物对，所述引物对的核酸序列如下所示：
P001正向：5’-CCCTGCAATTGTGCCATACG-3’；
P002反向：5’-CTCCTAGCGGCAGATAACGC-3’。
上述的引物对在鉴定影响牛初生体高中的应用。
上述的引物对在牛基因组选择中的应用。
上述的引物对在提高牛初生体高中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种牛的遗传改良的方法，所述方法包括：确定种牛资源群体中的种牛的上述的影响牛初生体高的分子标记的位点，并根据所述分子标记做出相应的选择：在所述种牛资源群体中保留牛参考基因组ARS-UCD1.3版本X染色体(NC_037357.1)上第801328位点为AA基因型的种牛个体，淘汰在第801328该位点为AG、GG基因型的牛个体，以逐代提高该位点的AA基因型频率，从而提高后代牛的初生体高。所述牛群体包括安格斯牛及其合成系。具体包括以下步骤：
(1)提取待测牛的基因组DNA；
(2)采用引物对，将所述待测牛的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；
(3)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；
(4)基于所述测序结果，确定所述待测牛在牛参考基因组ARS-UCD1.3版本X染色体(NC_037357.1)上第801328位点的SNP标记的基因型。
(5)保留牛参考基因组ARS-UCD1.3版本X染色体(NC_037357.1)上第801328位点为AA基因型的种牛个体，淘汰在第801328该位点为AG、GG基因型的牛个体。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
确定了新的影响牛初生体高的分子标记，并开发了相应引物。
第二，本发明确定的SNP分子标记应用于种牛提高初生体高的遗传改良中，可提高后代牛的初生体高，进而增加养殖企业市场竞争力。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明的方法及其有益效果进行详细说明。
图1是安格斯牛在X染色体(NC_037357.1)上关于初生体高的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图；其中：横坐标表示牛的染色体编号(bp)；纵坐标表示-logP值。
图2是桑格测序的结果，其中图2A和2B是AA基因型和图2C和2D是GG基因型样品。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本申请所使用的所有技术和科技术语具有本申请所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。
实施例1GWAS分析
1、实验动物
本发明所使用的实验牛群群体均来自宁夏安格斯牛核心场的211头安格斯牛，为宁夏畜牧工作站选育的核心群群体，所选个体均为雌性个体。
从2016年开始实施安格斯牛核心群选育项目，每月组织工作人员进行安格斯牛生产性能测定，测定性状包括体重、体高、十字部高、体斜长、胸围、腹围和管围7个性状，测定阶段包括初生、断奶、6月龄、12月龄、18月龄和24月龄。截至2021年底，已积累了大量生长性状表型数据，同时用ddRAD测序技术获得基因型数据。
2、样本采集
用采血管收集上述牛群体所有个体静脉血50ml，置于-80℃冰箱保存备用。
3、ddRAD简化基因组测序
对上述资源群体中的211头牛的每个个体采集静脉血50ml，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。经NanoDrop2000/2000C核酸蛋白检测仪检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μl已提取好的待测DNA样品与2μlLoading Buffer混合，上样到1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。
DNA样品送南京集思慧远生物科技有限公司，根据公司标准流程进行牛全基因组ddRAD测序进行基因型判定。利用vcftools软件对所有样本分型数据进行质量控制，剔除测序平均深度低于5X，SNP的qvalue低于30，检出个体率低于70％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10-6的SNP，最终得到314718个SNP的有效基因型数据。
4、全基因组关联(GWAS)分析
本发明采用GLM模型并结合TASSEL软件包进行GWAS分析，确定SNP与初生体高性状关联程度的显著性阈值为1e-6。
GWAS分析结果如图1所示。从图1可知，在肉用牛NC_037357.1号染色体中存在显著影响初生体高的位点(P<0.05)。
5、不同基因型与初生体高表型的关联性分析
根据表1可知，分子标记的SNP位点NC_037357.1-801328A>G与初生体高极显著相关(P<0.001)，说明此分子标记显著影响牛的初生体高，可以通过对牛的此SNP位点的辅助选择，从而提高该群体的初生体高，进而加快该性状的育种进程。
另外根据表1可知，AA型比AG、GG型的初生体高，说明G型牛个体对筛选初生体高不利，故优先保留AA型的种牛。初生体尺是衡量犊牛胎儿期生长发育情况的重要指标，同时也与家畜对环境的适应能力、畜体经济价值、生产价值和繁殖性能等密切相关，提高牛的初生体高有利于提高牛肉产量，进而增加市场竞争力。因此，在育种过程中需要逐步淘汰AG、GG型的种牛，优先保留AA型的种牛，以逐代提高该位点的AA基因型的频率。
表1分子标记的SNP位点NC_037357.1-801328A>G与初生体高的相关性
| 基因型 | 个体数 | 初生体高 | 比较组 | Pvalue |
| AA | 29 | 90.28±9.74 | AA vs AG | 1.62E-08 |
| AG | 117 | 76.54±11.68 | AA vs GG | 3.15E-05 |
| GG | 58 | 79.12±12.48 | AG vs GG | 0.090107 |
实施例2多态性位点的验证
为了验证高通测序获得的SNP位点是的真实性，而非测序错误造成，分别选择2个AA基因型和2个GG基因型样品进行桑格测序。
1、目的DNA序列扩增及测序
(1)引物设计
通过NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝NC_037357.1)下载牛的NC_037357.1号染色体上SEQ ID NO:1的DNA序列。并利用引物设计软件primerpremier 5.0设计引物。
设计的引物的DNA序列如下所示：
P001正向：5’-CCCTGCAATTGTGCCATACG-3’；
P002反向：5’-CTCCTAGCGGCAGATAACGC-3’；
(2)PCR扩增
10uL的反应体系中加入DNA模板1uL，双蒸水3.4uL，2×Tag PCR StanMixwithLoading Dye 5uL，引物P001和P002各0.3ul。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、59℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min。
(3)DNA序列测定
DNA序列测序鉴定：在上海生工科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。
测序结果如图2所示，其中图2A和2B是AA基因型和图2C和2D是GG基因型样品。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一种影响牛初生体高的SNP分子标记在提高后代牛初生体高中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SNP位于SEQ ID NO.1自5’端起第209位，对应于牛基因组ARS-UCD1.3版本参考序列X染色体上第801328位A>G突变，AA基因型个体高于AG或GG基因型个体，所述牛为安格斯牛及安格斯牛的合成系。
2.一种用于检测SNP分子标记的试剂在提高后代牛初生体高中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SNP位于SEQ ID NO.1自5’端起第209位，对应于牛基因组ARS-UCD1.3版本参考序列X染色体上第801328位A>G突变， AA基因型个体高于AG或GG基因型个体，所述牛为安格斯牛及安格斯牛的合成系。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，检测SNP分子标记的试剂为引物对，所述引物对的核酸序列如下：
P001正向：5’-CCCTGCAATTGTGCCATACG-3’，
P002反向：5’-CTCCTAGCGGCAGATAACGC-3’。
4.一种提高后代牛初生体高的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：检测牛基因组ARS-UCD1.3版本参考序列X染色体上第801328位核苷酸位点的基因型，选择第801328位核苷酸位点为AA型个体作为种牛，所述牛为安格斯牛及安格斯牛的合成系。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述检测牛的牛基因组ARS-UCD1.3版本参考序列X染色体上第801328位的基因型的方法包括以下步骤：
(1)提取待测牛的基因组DNA；
(2)采用引物对将所述待测牛的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物，所述引物对为P001正向：5’-CCCTGCAATTGTGCCATACG-3’，P002反向：5’-CTCCTAGCGGCAGATAACGC-3’；
(3)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；
(4)基于所述测序结果，确定所述待测牛的X染色体上第801328位核苷酸位点的基因型。
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-
2022
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|---|---|---|---|---|
| WO2006029256A2 (en) * | 2004-09-08 | 2006-03-16 | Mmi Genomics, Inc. | Compositions, methods, and systems for determining bovine parentage and identity |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Genetic architecture of individual variation in recombination rate on the X chromosome in cattle;Junjie Zhang等;Heredity;20200710;第125卷(第5期);304-316 * |
| 拷贝数变异全基因组关联分析及数量性状基因座定位联合鉴定猪体高性状候选基因;欧阳峰正;王立刚;岳静伟;颜华;张龙超;侯欣华;刘欣;王立贤;;畜牧兽医学报;20200728;51(第07期);1515-1524 * |
Also Published As
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