CN111808974B - 一种位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的snp分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记及应用。所述的位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记的SNP位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列9号染色体上第128013229位G>A突变。本发明通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，降低种猪阴囊疝发生率，减少育种损失的同时提高动物福利，加快猪遗传缺陷的抗病育种进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

Description

一种位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记及 应用

技术领域

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记及应用。

背景技术

猪的遗传缺陷是一类由遗传因素引起的机体结构或功能上的缺陷，一般情况下，其受基因组上多基因控制，遗传机制复杂。在养猪生产中，较为常见的遗传缺陷包括阴囊疝/腹股沟疝、脐疝、锁肛和八字脚等。因其发生率较低，往往导致育种工作者重视程度不高，研究进展缓慢。作为较为突出的一种遗传缺陷，阴囊疝是由于腹股沟管周围的肌肉组织缺陷造成的，腹部内容物会掉入阴囊内，从而导致患病个体生长速度慢，饲料报酬低，增加养殖成本，且其只在公猪中表现。据统计，阴囊疝的发生率一般在0.3％～8.3％之间。在大规模种猪群体中，猪的遗传缺陷往往会导致部分具有其他优秀生产性能的种猪被淘汰从而给养猪生产带来巨大的经济损失，甚至扰乱既定的育种计划。因此，为了解析导致猪阴囊疝发生的遗传机制，在基因组上鉴别影响阴囊疝发生的数量性状基因座(Quantitativetrait loci，QTL)和致病基因显得极为重要。

在实际育种生产中，发生阴囊疝的公猪不会再留作种用，甚至会导致其家系的个体都被淘汰，这就会限制优秀基因在群体中的快速扩散。传统的育种选育是根据表现型来做出初步判断，但这种基于表型的选择并不能从根本上解决阴囊疝的发生，因此采用常规育种方法难以快速实现预期的育种目标。而利用分子生物学的方法，在基因组上找到影响猪阴囊疝发生的遗传因素则有望迅速降低阴囊疝的发生从而减少育种损失。以往的研究采用微卫星标记等方法在猪基因组上鉴别到了一些影响猪阴囊疝的QTL，但因其置信区间较大(大于20Mb)且其内包含几十个基因，导致无法精确锚定到致病基因。随着高通量测序技术的发展，通过检测猪全基因组上的单核苷酸多态(Single nucleotide polymorphisms,SNP)，结合全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)技术,可鉴别到影响猪阴囊疝的QTL和致病基因，进而进一步挖掘突变位点。因此，在猪的抗病育种进程中可以利用GWAS鉴别到的SNP进行分子标记辅助选择和基因组选择，这将对患猪阴囊疝病的个体筛选奠定分子基础，为进一步解析该病发生的遗传机制提供依据。本申请在长白猪种猪群体中采用GWAS的策略鉴定到一个SNP位点，结果表明该SNP位点与猪阴囊疝具有一定的关联性。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记。

本发明的另一目的在于提供上述位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记的应用。

本发明的再一目的在于提供一种鉴定上述SNP分子标记的引物对。

本发明的第四个目的在于提供上述引物对的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种猪的遗传改良方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记，其SNP位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列9号染色体上第128013229位G>A突变；

所述的位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，其中序列中的M是G或A，导致猪阴囊疝发生比例的差异；

所述的位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记，其SNP位点为SEQIDNO:1序列标注位置为208位的G208-A208的核苷酸突变；

所述的位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记在制备鉴定猪阴囊疝相性状的产品和猪遗传育种中的应用；

利用上述位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记筛选低阴囊疝发生率的猪品种的方法，包含如下步骤：

检测上述位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记，所述分子标记的5’端第208位单核苷酸是G还是A，淘汰G保留A；

所述的猪优选为长白猪及其合成系；

一种用于鉴定上述位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记的引物对，包含引物P001-F和引物P002-R，其核苷酸序列如下所示：

P001-F：5’-CTGGCTCCAGAGTGAGGAGA-3’，

P002-R：5’-GACACAACCCAAGAGGTCCA-3’；

一种用于鉴定上述位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记的试剂盒，包含上述引物对；

所述的引物对或试剂盒在制备鉴定猪阴囊疝的产品中的应用；

所述的引物对或试剂盒在猪分子标记辅助育种中的应用；

所述的引物对或试剂盒在制备降低猪阴囊疝发生率的产品中的应用；

一种鉴定位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记基因型的方法，包含如下步骤：

(1)提取待测猪的基因组DNA；

(2)采用上述引物对或上述试剂盒中的引物对对步骤(1)获得的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(3)对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

(4)基于所述测序结果，确定待测猪的位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记的基因型；

所述的猪优选为长白猪及其合成系；

一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：

确定种猪核心群中的种猪的上述位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记的位点，并根据所述分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本9号染色体上第128013229位点为AA、GA基因型的种猪个体，淘汰在第128013229位点为GG基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因A的频率，从而降低后代猪的阴囊疝发生率；

所述的方法不包含疾病的治疗与诊断目的；

所述的猪优选为长白猪及其合成系；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明研究并确定影响猪阴囊疝发生相关的分子标记位于猪的9号染色体上的核苷酸序列上，验证其对阴囊疝性状的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪降低阴囊疝发生率的遗传改良中，从而改善后代猪的遗传缺陷，减少育种损失的同时提高动物福利，提高企业经济利润，增加核心竞争力。通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，降低种猪阴囊疝发生率，加快猪遗传缺陷的改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

(2)本发明提供一种鉴定上述猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记的引物对，通过该引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确地对种猪阴囊疝进行降低性选育改良，加快育种进程。

附图说明

图1是长白猪在9号染色体上关于阴囊疝性状的全基因组关联分析曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)实验动物

本发明所使用的实验猪群群体为温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种长白猪1099头，为种猪分公司核心群。

本实验共选取该资源群体中长白猪，猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。

(2)样本采集

收集上述仔猪断尾及耳组织浸泡于体积分数为75％的乙醇溶液中，置于-20℃冰箱保存备用。

(3)猪全基因组50K SNP判型

从上述资源群体中选取的1047头长白种猪中的每个个体采集的耳组织或者断尾组织，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。经NanoDrop2000/2000C核酸蛋白检测仪检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μL已提取好的待测DNA样品与2μL Loading Buffer混合，上样到质量体积比为1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。

DNA样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50K SNP芯片(Illumina，美国)基因型判定。利用R语言GenABEL包中checkmarker对所有样本50K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10^-6的SNP，最终得到46462个SNP的有效基因型数据。

(4)全基因组关联(GWAS)分析

为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合R语言GenABEL软件包进行GWAS分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用Bonferrini法确定SNP与有效总乳头数性状关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量，即基因组显著水平阈值为1.07E-06，即0.05/46462(有效SNP数量)；染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量，即染色体显著水平阈值为2.15E-05，即1/46462(有效SNP数量)。

GWAS分析结果如图1所示。从图1可知，在长白猪中，在9号染色体中存在显著影响阴囊疝发生的位点，最强关联的SNP为SEQ NO.1中第208位核苷酸g.208G>A(P值为5.05E-08)。

(5)该位点(rs81417579)基因型频率和等位基因频率在阴囊疝患病个体和正常个体中的分布比较

从表1可看出SNP rs81417579位点存在多态性。在长白猪实验群体患病阴囊疝猪个体和正常猪个体的比较分析中可知，GG基因型在患病群体中发病率最高，为0.118，而AA基因型发病率仅为0.003。由此可推测GG基因型可能是对阴囊疝患病个体的不利基因型。从表2可知，当在患病群体中对该位点的不同基因型进行分析时，结果表明GG基因型仍占患病个体最高的等位基因频率，为0.5。等位基因G的频率显著高于等位基因A的频率(G>A:0.67>0.33)。在正常猪个体中GG基因型频率仅为0.043，并且G等位基因频率为0.21，远小于其在患病阴囊疝个体中的等位基因频率。这些结果说明与阴囊疝病因相关的基因在长白猪群体患病和正常个体中具有不同的频率，GG基因型对于阴囊疝的发生具有明显优势，为潜在的易患病基因型，G等位基因为易感等位基因。

表1分子标记位点g.208G>A各基因型在阴囊疝和正常猪间的基因型频率分布

注：括号内为对应个体数

表2分子标记位点g.208G>A各基因型在阴囊疝个体内和正常猪个体内基因型和等位基因频率分布

实施例2目的DNA序列扩增及测序

(1)引物设计

通过Ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的9号染色体上SEQ ID NO:1的DNA序列，并利用引物设计软件primer premier 6.0设计引物。设计的引物的DNA序列如下所示：

P001-F：5’-CTGGCTCCAGAGTGAGGAGA-3’，

P002-R：5’-GACACAACCCAAGAGGTCCA-3’；

(2)PCR扩增

10μL的反应体系中加入DNA模板1μL，双蒸水3.4μL，2×Tag PCR StanMix withLoading Dye 5μL，引物P001-F和P002-R各0.3μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min。

(3)DNA序列测定

DNA序列测序鉴定：在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。测序结果如下所示：

CTGGCTCCAGAGTGAGGAGACATTCTTGTTTTGTAATGCAGCGTGTGAAACTGGACCAGCCAGTTTTCAGGCCCTTAAAATAGACAGGTTCATCTGGATTCATACTTCCCAATTGTGAAGTGGTTAAGAGGAACTACATTATGCATTGCGTTTCATTTATGTAGTGCATGTGTGTGCACACGCACATGCTCATGCACTTTTAAAATGM(G>A)TCAGATGAGGGCGACTGGCCCATGTAAATGATGCTGTCCTCTCTGCTCTATATCCCCTCACAGTCGTAGTTTAGGAGCCAGTCTTATCATGTTTGGACCTCTTGGGTTGTGTC

注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线+加粗显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾下划线+斜体显示为设计引物序列位置。

实施例3分子标记的SNP位点g.208G>A效应分析

根据表1可知，对于猪的阴囊疝，SNP位点g.208G>A优势等位基因型的频率(AA)在患病个体中为0.167，而在正常猪个体中为0.627；有利等位基因A的频率在阴囊疝患病个体中为0.33，而在正常猪个体中为0.79。因此，通过分子标记辅助选择，逐步对群体内基因型为GG的猪进行淘汰，则能显著提高等位基因A的等位基因频率，降低种猪阴囊疝发生率，减少育种损失的同时提高动物福利，加快猪遗传缺陷的改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

本发明通过对SEQ ID NO:1序列中的第208个位碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与猪的阴囊疝发生之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学；温氏食品集团股份有限公司

<120> 一种位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记及应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SEQ IDNO:1

<400> 1

ctggctccag agtgaggaga cattcttgtt ttgtaatgca gcgtgtgaaa ctggaccagc 60

cagttttcag gcccttaaaa tagacaggtt catctggatt catacttccc aattgtgaag 120

tggttaagag gaactacatt atgcattgcg tttcatttat gtagtgcatg tgtgtgcaca 180

cgcacatgct catgcacttt taaaatgmtc agatgagggc gactggccca tgtaaatgat 240

gctgtcctct ctgctctata tcccctcaca gtcgtagttt aggagccagt cttatcatgt 300

ttggacctct tgggttgtgt c 321

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P001-F

<400> 2

ctggctccag agtgaggaga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P002-R

<400> 3

gacacaaccc aagaggtcca 20

Claims (8)

1.一种位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记在制备鉴定猪阴囊疝相性状的产品和猪遗传育种中的应用，其特征在于：

所述的位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记的SNP位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列9号染色体上第128013229位G>A突变；所述的位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中序列中的M是G或A，导致猪阴囊疝发生比例的差异；所述的猪为长白猪及其合成系；

所述的应用不含疾病的治疗与诊断目的。

2.一种用于鉴定权利要求1中所述的位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记的引物对在制备鉴定猪阴囊疝的产品中的应用，其特征在于所述的引物对包含引物P001-F和引物P002-R，其核苷酸序列如下所示：

P001-F：5’-CTGGCTCCAGAGTGAGGAGA-3’，

P002-R：5’-GACACAACCCAAGAGGTCCA-3’；

所述的猪为长白猪及其合成系。

3.一种用于鉴定权利要求1中所述的位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用，其特征在于所述的引物对包含引物P001-F和引物P002-R，其核苷酸序列如下所示：

P001-F：5’-CTGGCTCCAGAGTGAGGAGA-3’，

P002-R：5’-GACACAACCCAAGAGGTCCA-3’；

所述的猪为长白猪及其合成系；

所述的应用不含疾病的治疗与诊断目的。

4.一种用于鉴定权利要求1中所述的位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记的引物对在制备降低猪阴囊疝发生率的产品中的应用，其特征在于所述的引物对包含引物P001-F和引物P002-R，其核苷酸序列如下所示：

P001-F：5’-CTGGCTCCAGAGTGAGGAGA-3’，

P002-R：5’-GACACAACCCAAGAGGTCCA-3’；

所述的猪为长白猪及其合成系；

所述的应用不含疾病的治疗与诊断目的。

5.一种用于鉴定权利要求1中所述的位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记的试剂盒在制备鉴定猪阴囊疝的产品中的应用，其特征在于所述的试剂盒包含权利要求2中所述的引物。

6.一种用于鉴定权利要求1中所述的位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记的试剂盒在猪分子标记辅助育种中的应用，其特征在于所述的试剂盒包含权利要求2中所述的引物；

所述的应用不含疾病的治疗与诊断目的。

7.一种用于鉴定权利要求1中所述的位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记的试剂盒在制备降低猪阴囊疝发生率的产品中的应用，其特征在于所述的试剂盒包含权利要求2中所述的引物；

所述的应用不含疾病的治疗与诊断目的。

8.一种鉴定位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记基因型的方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）提取待测猪的基因组DNA ；

（2）采用权利要求2中所述的引物对对步骤（1）获得的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

（3）对步骤（2）获得的PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

（4）基于所述测序结果，确定待测猪的位于猪9号染色体上与阴囊疝发生相关的SNP分子标记的基因型；

所述的猪为长白猪及其合成系；

所述的方法不含疾病的治疗与诊断目的。

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