CN112094923B - 一种与猪生长速度关联的sine转座子多态分子标记及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物遗传育种领域和分子标记选育领域，公开了一个与猪生长速度关联的LEPROT基因内的SINE转座子多态分子标记检测方法及应用。本发明的方法是检测待测猪的LEPROT基因的第一内含子区是否存在一个276bp的SINE转座子反向插入多态标记，该分子标记显著影响猪的100kg体重日龄的性状。本发明还提供了一种用于鉴定该分子标记位点的引物对，利用该分子标记和引物对可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪生长速度性状遗传改良中，可以提高生产效益。

Description

一种与猪生长速度关联的SINE转座子多态分子标记及其检测 方法和应用

技术领域

本发明属于动物遗传育种领域和分子标记选育领域，具体涉及一个与猪生长速度关联的LEPROT基因内的SINE转座子多态分子标记及其检测方法和应用。

背景技术

逆转录转座子广泛分布于哺乳动物的基因组中，在猪基因组中，转座子占猪基因组的40.72％，其中逆转录转座子占转座子的91.49％，因转座子可移动的特性使其在基因中普遍存在插入或缺失状态，是基因组结构变异的重要贡献者，为开发逆转录转座子分子标记提供了生物学基础。

很多研究表明基因中逆转录转座子的插入或缺失会影响该基因的生物学活性，已有超过100种反转录转座子插入导致了人类遗传疾病的报道。在动物身上也已经观察到许多由转座子插入引起的表型变化，例如狗的Silver基因SINE插入影响毛色表型。赛马MSTN基因转座子的插入，影响马的赛跑距离。猪VRTN基因转座子的插入影响猪脊椎发。

逆转录转座子插入多态(Retrotransposons insertion polymorphism，RIP)是指在同源染色体的同一位置上逆转录转座子存在不同的插入或缺失状态，使该位点存在不同的基因型，产生共显性标记。操作上仅需在逆转录转座子插入位置的上下游设计正反向引物，然后以个体基因组DNA为模板进行PCR检测。RIP相比较于其他分子标记具有成本低廉、操作简单且适合大群体的批量分析及多态性高等优点，具有良好的商业应用价值。

猪的大多数重要经济性状受微效多基因控制并呈现连续性变异分布，遗传基础复杂，且易受到环境影响，表现型难以准确鉴定。长期以来，只能借助数理统计的方法进行分析。随分子标记技术的出现和发展，动物遗传连锁图谱和物理图谱的日臻完善，各国科学家利用精心设计的用于基因分离的资源家系群体，通过基因组扫描技术，已定位了众多影响生长性状、胴体性状、繁殖性状、肉质性状QTLs，但是已经成功应用于我国猪育种实践的位点还相对较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一个与猪100kg体重日龄关联的LEPROT基因的SINE转座子多态分子标记检测方法及应用。通过PCR扩增建立相应的SINE插入/缺失分型方法，通过寻找与猪100kg体重日龄相关联的转座子插入多态位点作为分子标记，并将其应用于猪的生长性状的选育中，加快育种进程。

本发明的技术方案如下：

一个与猪生长关联的LEPROT基因内的SINE转座子多态分子标记，命名为RIP-LEPROT-SINE，含有该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其来自LEPROT基因(CM017488.1)，SEQ ID NO:1序列的174-450位点之间存在一个反向SINE转座子的插入。

进一步的，所述的SINE转座子多态分子标记位点在LEPROT基因的4214-4490位点。

获取上述的与猪生长性状关联的LEPROT基因内SINE转座子多态分子标记的方法包括以下步骤：

(1)根据SEQ ID NO:1序列中SINE位置的两侧序列中设计上下游检测引物；

(2)以猪的耳样提取的DNA为模板进行PCR扩增并获得产物；

(3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并根据电泳结果图确定该位点多态性和基因型。

进一步的，PCR扩增所用正向引物序列为

5’-CGCACCTTGGATCCCACA-3’；反向引物序列为

5’-TTCCCTGCATCTACCGGACA-3’。且不限于这对引物，在SEQ ID NO:1的第175到450位点(SINE多态位点)的两侧区域设计PCR引物均可。

进一步的，所述基因型预计为SINE^+/+，SINE^-/-和SINE^+/-。

进一步的，SINE^+/+基因型在736bp处出现特异性条带；SINE^+/-基因型同时在736bp和460bp出现特异性条带；SINE^-/-基因型在460bp处出现特异性条带。

进一步的，PCR反应条件下为：95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸50秒，变性至延伸35个循环，72℃延伸5分钟。本发明也提供了所述的与生长性状关联的LEPROT基因内SINE转座子多态分子标记在猪生长性状筛选中的应用。

本发明还提供一种选育生长速度快或达100kg体重日龄短的猪的方法，检测上述与猪生长速度关联的SINE转座子多态分子标记，包括选择SINE+/-基因型和SINE-/-基因型个体优先作为种猪应用于猪的早期选种；

所述SINE+/-基因型个体是SINE杂合插入个体；所述SINE-/-基因型个体是SINE纯合无插入个体。

本发明还提供一种鉴定猪品种生长速度的检测试剂盒，所述的检测试剂盒中含有上述引物。

有益效果

在猪育种过程中，生长速度是一个重要性状，LEPROT调控LEPR基因的组织特异性表达，与瘦素结合作用于中枢及外周,影响机体的许多生理和代谢过程,参与糖、脂肪及能量代谢的调节。本发明结合课题组已有的转座子插入多态分子标记挖掘技术，发现LEPROT基因的SINE转座子插入多态位点，通过关联分析证实其与猪生长性状存在显著关联，是一个有育种价值的分子标记。

通过PCR扩增建立相应的SINE插入/缺失分型方法，通过寻找与猪100kg体重日龄相关联的转座子插入多态位点作为分子标记，并将其应用于猪的生长性状的选育中，加快育种进程。进一步说明了基于转座子插入多态研发分子标记具有一定的可行性，在分子辅助育种工作中具有很好的应用前景。

附图说明

图1为引物扩增模式图；

图2为电泳多态示意图，表现为SINE^+/+、SINE^+/-和SINE^-/-三种基因型；

图3为转座子在基因中的插入位置；

图4表示RIP-LEPROT-SINE插入多态引物设计示意图；

图5表示RIP-LEPROT-SINE在12个品种猪中的扩增结果，Marker为DL2000；

图6表示RIP-LEPROT-SINE在部分大白猪中的扩增结果，Marker为DL2000。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

实施例1:LEPROT基因SINE插入位点的确定及插入多态检测方法的建立

1、在Ensembl数据库(http://www.ensembl.org/)中下载参考基因组，利用参考基因组作为查询序列，在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中比对查询获取不同品种的该基因序列。通过多序列比对获取该基因在不同品种猪之间的结构变异位点。在RepeatMasker数据库中对获取的不同品种猪的该基因序列注释，筛选出因转座子插入引起的结构变异位点。

2、RepeatMasker数据库中的注释结果显示，在LEPROT基因的第一内含子一个结构变异与SINE转座子序列高度相符。在该转座子两侧延伸100-300个碱基，获取所需验证的片段。

3、利用获得的序列，使用BatchPrimer3

(http://batchprimer3.bioinformatics.ucdavis.edu/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgi)在线软件进行引物设计，使两侧引物均位于转座子插入片段的两侧，引物设计模式如图4所示。

4、分别以杜洛克、长白猪、大白猪、苏姜猪、姜曲海猪、二花脸猪、金华猪、荣昌猪等品种猪DNA为模板(实施本发明不限于上述品种)，用上述引物对其进行PCR扩增。

基因组的准备：

(1)选取各个品种的耳组织样，杜洛克、长白猪、大白猪，均由安徽省农业科学院提供；苏姜猪来自江苏苏姜种猪有限公司；姜曲海猪来自江苏泰州姜曲海种猪场；二花脸猪来自江苏苏州苏太猪原种场；金华猪由浙江大学提供；荣昌猪由重庆畜科院提供，每个品种24个个体，采集耳组织，用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0试剂盒提取基因组。每个品种的DNA浓度分别定量为40ng/ul进行检测。

(2)本发明的生产关联大白猪群体耳样采集自安徽省的某种猪育种公司。使用TAKARA的MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0(TaKaRa，大连，中国)试剂盒提取猪的基因组DNA。主要步骤如下：①取10～25mg动物组织，用剪刀剪碎。②加180μl Buffer GB、20μl蛋白酶K和10μl RNase A(10mg/ml)，吸打混匀，于56℃水浴至组织裂解。③向裂解液中加入200μl无水乙醇，充分吸打混匀。④将Spin Column安置于Collection Tube上，将③中溶液移至Spin Column中，12000rpm离心2分钟，弃滤液。⑤向Spin Column中加500μl的Buffer WA，12000rpm离心1分钟，弃滤液。⑥向Spin Column中加700μl的Buffer WB，12000rpm离心1分钟，弃滤液，重复操作步骤。⑦将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm离心2分钟。⑧将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入100μl的Elution Buffer，室温静置5分钟。⑨12000rpm离心2分钟洗脱DNA。获取的猪基因组DNA通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳进行DNA浓度和质量的检测并于-20℃保存。

(3)根据LEPROT基因序列，在逆转录转座子多态标记位点的上下游设计引物，正向引物和反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，根据PCR反应体系配置混合液，在PCR反应条件下(95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸50秒，变性至延伸35个循环，72℃延伸5分钟)进行扩增，所述正反向引物的序列如下：

正向引物序列为：5’-CGCACCTTGGATCCCACA-3’；(SEQ ID NO:2)

反向引物序列为：5’-TTCCCTGCATCTACCGGACA-3’(SEQ ID NO:3)

表1.PCR反应体系

(4)制作1.0％的琼脂糖凝胶，用移液器吸取7μl PCR扩增产物依次加入到凝胶孔中，同时加4μl DNA Maker作为参照，120V恒压电泳30分钟后，将凝胶放到溴化乙锭溶液中染色10分钟，紫外灯下观察并拍照记录。验证后发现存在三种基因型：如果个体的基因型是SINE^+/+(纯合插入)，则只能扩出一条含有SINE的较大条带(736bp)；如果个体的基因型是SINE^+/-(杂合插入)，则能扩出一条含有SINE的较大条带(736bp)和一条不含有SINE的较小条带(460bp)；而如果该样本的基因型是SINE^-/-(两条染色体均无SINE插入)，则只扩增出一条较小条带(460bp)，部分结果如图6所示。

实施例2：本发明SINE转座子在不同猪品种中基因型频率和等位基因频率的统计

1、基因型频率：是指一个群体中特定基因型占群体内全部基因型的比例。基因型频率的统计方法为：基因型频率＝该基因型个体数/测定群体总数；

2、等位基因频率：是指一个群体中某一基因占该位点上总基因的相对比例。等位基因频率的统计方法：该基因纯合子基因型频率+含有该基因的杂合子基因型频率/2；

3、为了确定猪LEPROT基因SINE转座子插入在不同猪品种中基因型频率和等位基因频率，分别选择了来自安徽农业科学院提供的杜洛克和长白猪样品各24个、江苏苏姜种猪有限公司的苏姜猪样品24个、江苏泰州姜曲海猪种猪场的姜曲海猪样品24个、江苏苏州苏太猪场的二花脸猪样品24个、浙江大学提供的金华猪样品24个、重庆畜科院提供的荣昌猪样品24个，进行多态性检测，统计分析SINE插入的基因型频率和等位基因频率。由统计结果可知，该SINE转座子插入在生长速度较快的杜洛克，大白和长白及杜洛克血统占67.5％的苏姜猪群体中SINE^-为优势等位基因型，生长速度较慢的地方品种猪姜曲海、二花脸、金华和荣昌猪中SINE⁺为优势等位基因型。

表2 SINE插入多态在不同品种猪中基因型频率和等位基因频率

实施例3：与大白猪群体的生产繁殖性能进行关联分析

在大白猪群体中进行RIP-LEPROT-SINE多态性检测，并与生长性能进行关联分析，通过单因素方差分析进行不同基因型的生产性能显著性检测。

表3.RIP-LEPROT-SINE位点的基因型与生长繁殖性状关联分析

注：同列相同字母表示组间差异不显著；不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)；带*表示差异极显著(P＜0.01)；

Note:The same letter in the same column means that the differencebetween groups is not significant；Different letters indicated significantdifference between groups(P<0.05).The band*indicated a significant difference(P<0.01)；

100kg体重日龄校正公式如下：100kg校正体质量日龄＝测定日龄－[(实测体质量－100)/CF]，式中，CF为校正因子，CF公猪＝(实测体质量/测定日龄)*1.826 040，CF母猪＝(实测体质量/测定日龄)*1.714 615。

在大白猪群体中，纯合转座子有插入基因型(SINE^+/+)的个体100kg体重日龄极显著高于杂合转座子插入基因型(SINE^+/-)的个体和显著高于纯合无插入基因型(SINE^-/-)个体。因此，选择SINE^+/-和SINE^-/-个体可以达到提高猪生长速度的目的。上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种与猪生长速度关联的SINE转座子多态分子标记及其检测方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 740

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcaccttgg atcccacggt attgctgggg ctgtggtgta ggccgccagc tgcagcttcg 60

cttggccccc tagcctggga acttccgtat gctgcagatg tggccctaac agttaaaaaa 120

aaacaaaaca aaacaaaaaa aaagcagata cctacatcaa tcagctttgc tttccttttt 180

ttttttttgt ctttttgcta tttctttggg ccgctcccgc ggcatatgga ggttcccagg 240

ctagggattg aatcggagct gtagccacca gcctacgcca gagccacagc aacgcgggat 300

ccgaaccgcg tctgcaacct acaccacagt tcatggcaac gccggatcat tgacccactg 360

agcaagggca gggaccgaac ccacaacctc atggttccta gtcggatgca tgaaccactg 420

cgccacgacg ggaactccca gctttgcttt ctgagcattt ccttttgtca agcactttac 480

atagattatc tcatttaatt cctataaccc cctaatacag tgacaccatc ctcattttac 540

aggtggaaaa ttagattgaa agcgctttgg cctctaccta aggtcacaca gccggtcagt 600

ggcagagtta agatgtgaac ccatgttggt ggctcagagc ccaagattat gtaacagttc 660

tgatatgcca tctcccactc agccccatga caaaacaaac acgtccctac ctcctcaaag 720

tgtccggtag atgcagggaa 740

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcaccttgg atcccaca 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttccctgcat ctaccggaca 20

Claims (2)

1.用于检测与猪达100kg体重日龄关联的SINE转座子多态分子标记的试剂在筛选猪达100kg体重日龄生长性状中的应用，其特征在于，含有该分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述分子标记位于在SEQ ID NO:1的174-450位点；

所述应用包括以下步骤：

（1）根据SEQ ID NO: 1序列中SINE位置的两侧序列中设计上下游检测引物；

（2）以待测个体的DNA为模板进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

（3）将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并根据电泳结果确定该位点基因型；

PCR扩增所用引物序列为：

正向引物F为5’-CGCACCTTGGATCCCACA-3’；

反向引物R为5’-TTCCCTGCATCTACCGGACA-3’；

所述基因型预计为SINE^+/+、SINE^-/-和SINE^+/-；所述SINE^+/-基因型个体是SINE杂合插入个体；所述SINE^-/-基因型个体是SINE纯合无插入个体；SINE^+/+基因型在736bp处出现特异性条带；SINE^+/-基因型同时在736bp和460bp出现特异性条带；SINE^-/-基因型在460bp处出现特异性条带；SINE^+/+基因型个体100kg体重日龄高于SINE^+/-基因型个体和SINE^-/-基因型个体。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，PCR反应条件为：95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸50秒，变性至延伸35个循环，72℃延伸5分钟。

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