CN113549699B - 一种白羽肉鸡产蛋数的基因组选择方法 - Google Patents

一种白羽肉鸡产蛋数的基因组选择方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种白羽肉鸡产蛋数的基因组选择方法，利用整合显著SNP标记效应的一步法全基因组育种值(GEBV)估计方法，对白羽肉鸡产蛋数进行GEBV估计。本发明还提供与白羽肉鸡产蛋数显著相关的SNP标记及其应用。包括标记rs317316870、rs313925951、rs14786427、rs14756086和rs316455929。本发明提供的具有低产蛋数白羽肉鸡品系的选育方法，与常规一步法GEBV估计结果相比，选择准确性可提高8.1％，即可缩短新品系育成的时间，节约选育的成本，提高育种效率，加快我国白羽肉鸡自主品系培育进程。

Description

一种白羽肉鸡产蛋数的基因组选择方法
技术领域
本发明涉及遗传育种和分子生物学领域，具体地说，涉及一种白羽肉鸡产蛋数的基因组选择方法。
背景技术
我国肉鸡出栏量世界第一，年出栏超过100亿只，近年来随着我国肉类消费结构的改变，鸡肉的消费量呈逐年增长的趋势，现已成为了我国第二大消费肉类。尽管在鸡肉产量上足够大，但是我国自主培育的优良品种仍然落后于国外，其中白羽肉鸡祖代鸡几乎全部依赖于进口，因此国产化肉鸡育种依然面临着巨大的压力。我国鸡肉主要来自引进的具有快速生长特性的白羽肉鸡和本地的黄羽肉鸡，其中黄羽肉鸡只约占鸡肉总产量的40％，白羽肉鸡占比60％左右，并且占比在逐年向白羽肉鸡倾斜。因此寻找适合我国白羽肉鸡选育技术是加快自主培育白羽肉鸡品种是关键。在长期的选择过程中，由于育种者更关注的是生长速度，对于白羽肉鸡的产蛋数性状选择较少，海兰蛋鸡75周可以产320枚蛋，而COBB母鸡60周龄只能产180枚蛋。白羽肉鸡产蛋性状还有很大的选择空间，寻找有效的选择方法至关重要。
基因组选择(GS)是当前畜禽育种中应用的先进选育技术，由Meuwissen等(2001)提出，通过对全基因组内所有SNP标记效应值的估计可以实现对育种值的预测，计算得到的育种值称为基因组估计育种值(GEBV)，指导优秀个体的选择和留种，也可将全基因组选择认为是改良版的标记辅助选择(MAS)。现在GS技术已经在牛、猪、羊以及水产养殖中得到广泛的应用。如今已在两大国际家禽育种公司中被广泛应用于肉鸡、蛋鸡和火鸡遗传选择中，并在多项报告中显示，GS技术的应用可在各类复杂经济性状的选择中提高20％-40％的准确性。整体而言，GS技术具有提高遗传评定准确性、缩短选育周期等多方面优势。直接法和间接法是GEBV估计的两种方法，总体分为两大类，包括了直接估计基因组育种值的GBLUP法和一步法(single-step GBLUP,SSGBLUP)以及通过标记效应计算基因组育种值的BayesA、BayesB、RRBLUP法等间接法。Bayes方法能够对不同效应SNP进行加权，但是因为耗时耗资源，所以对于家禽GS育种实践来说不实用。家禽GS育种由于群体较大、世代较多，最可行也是最常用的方法是SSGBLUP。
产蛋量可以使用不同的测量指标进行评估，如产蛋数、鸡舍产蛋量和产蛋率等。在个体中的表现的主要是个体产蛋数上的差异，可以作为一个更好的指标衡量繁殖性能用于指导留种。
发明内容
针对上述育种和生产实践需求，本发明以快大型白羽鸡种为素材，通过产蛋数的表型和全基因组SNP测定，筛选并验证获得白羽肉鸡产蛋数控制显著SNP标记。通过在SSGBLUP方法估计中增加显著SNP权重的方法，提高育种值估计的准确性。为实现产蛋数周期较长的性状的早期选择和性状相关等位基因的快速纯和，加快遗传选择进展提供技术支撑。培育品系的优势等位基因位点处于高频或纯和状态，在新品系应用于配套系创制过程中，还可较大程度上避免出现后代性状分离的问题。
本发明的目的是提供一种白羽肉鸡产蛋数的基因组选择方法(高产蛋数白羽肉鸡品系的高效选育方法)。
本发明的另一目的是提供与白羽肉鸡产蛋数显著相关的SNP标记及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供与白羽肉鸡产蛋数显著相关的SNP标记，包括标记rs317316870、rs313925951、rs14786427、rs14756086和rs316455929；
其中，标记rs317316870含有鸡Z染色体上第11050031bp处多态性为C/G的核苷酸序列；
标记rs313925951含有鸡Z染色体上第11181269bp处多态性为A/G的核苷酸序列；
标记rs14786427含有鸡Z染色体上第11995260bp处多态性为G/A的核苷酸序列；
标记rs14756086含有鸡Z染色体上第12901091bp处多态性为T/C的核苷酸序列；
标记rs316455929含有鸡Z染色体上第13662443bp处多态性为T/C的核苷酸序列。
以上SNP标记的物理位置参考基因组galGal5。
标记rs317316870所含多态性位点的基因型为CC，对应于低产蛋数水平，若基因型为GG，对应于高产蛋数水平；
标记rs313925951所含多态性位点的基因型为AA，对应于低产蛋数水平，若基因型为GG，对应于高产蛋数水平；
标记rs14786427所含多态性位点的基因型为AA，对应于低产蛋数水平，若基因型为GG，对应于高产蛋数水平；
标记rs14756086所含多态性位点的基因型为CC，对应于低产蛋数水平，若基因型为TT，对应于高产蛋数水平；
标记rs316455929所含多态性位点的基因型为TT，对应于低产蛋数水平，若基因型为CC，对应于高产蛋数水平。
第二方面，本发明提供用于扩增所述SNP标记的引物，扩增标记rs317316870的上、下游如SEQ ID NO:1-2所示，扩增标记rs313925951的上、下游如SEQ ID NO:3-4所示，扩增标记rs14786427的上、下游如SEQ ID NO:5-6所示，扩增标记rs14756086的上、下游如SEQID NO:7-8所示，扩增标记rs316455929的上、下游如SEQ ID NO:9-10所示。
第三方面，本发明提供含有所述引物的检测试剂或试剂盒。
第四方面，本发明提供具有低产蛋数的白羽肉鸡的鉴定及选育方法，包括：
1)提取待测白羽肉鸡总DNA；
2)以DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增；
3)分析PCR扩增产物。
前述的方法，PCR反应体系为：模板DNA 3μl，10pmol/μl上、下游引物各1μl，2×Master mix 12.5μl，ddH2O 7.5μl。
PCR反应程序为：95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃5min。
步骤3)包括：对扩增产物进行测序，根据测序结果判定如下：
若标记rs317316870对应的多态性位点的基因型为GG，判定为高产蛋数白羽肉鸡；
若标记rs313925951对应的多态性位点的基因型为GG，判定为高产蛋数白羽肉鸡；
若标记rs14786427对应的多态性位点的基因型为GG，判定为高产蛋数白羽肉鸡；
若标记rs147560867对应的多态性位点的基因型为TT，判定为高产蛋数白羽肉鸡；
若标记rs316455929对应的多态性位点的基因型为CC，判定为高产蛋数白羽肉鸡。
第五方面，本发明提供所述SNP标记或其检测试剂的以下任一应用：
(1)用于高产蛋数白羽肉鸡的早期预测；
(2)用于白羽肉鸡分子标记辅助育种。
第六方面，本发明提供高产蛋数白羽肉鸡品系的高效选育方法，包括以下步骤：
A、提取白羽肉鸡样本基因组DNA，利用鸡全基因组SNP芯片对所有样本进行全基因组SNP分型，并对基因分型后的数据进行处理和质量控制；
B、获得所有样本的5个SNP标记rs317316870、rs313925951、rs14786427、rs14756086和rs316455929的基因分型数据；
C、结合步骤A和B的基因分型数据进行全基因组育种值分析，选留育种值较优个体，选留的公、母鸡组建家系纯繁。
前述的方法，步骤C进行全基因组育种值分析的方法包括：
S1、权重G矩阵构建
根据VanRaden算法，对于步骤A和B中获得的基因分型数据，分别利用sommer软件包中A.mat函数构建亲缘关系矩阵，即G1和Gsnp；矫正Gsnp矩阵到G1矩阵水平：
其中，代表调整Gsnp矩阵，Gsnp代表基于5个SNP标记构建的亲缘关系矩阵，G1代表基于鸡全基因组SNP芯片(鸡55K SNP芯片)构建的基因组亲缘关系矩阵；其中，a和b的计算公式为：
A(diag(Gsnp))*b+a＝Avg(diag(G1))
A(offdiag(Gsnp)*b+a＝Avg(offdiag(G1)
设置G1和的相对权重公式为：
其中，G2代表权重G矩阵，c和d分别为G1和的权重系数；
S2、H矩阵构建
矫正G2矩阵到测序的个体系谱亲缘关系矩阵A22的水平：
G*＝e+f*G2
其中，G*代表调整G2矩阵；其中，e和f的计算公式为：
A(diag(G2))*f+e＝Avg(diag(A22))
A(offdiag(G2)*f+e＝Avg(offdiag(A22)
设置G*和A22在H矩阵中的相对权重为Gw＝0.95*G*+0.05*A22；H矩阵的公式为：
其中，H-1代表合并系谱和基因组亲缘关系逆矩阵，A-1代表基于系谱亲缘关系逆矩阵，代表相对权重G*逆矩阵，/>代表测序的个体系谱亲缘关系逆矩阵；
S3、育种值估计
采用ASReml v4.1软件，利用约束最大似然法(REML)算法的单性状动物模型对产蛋数性状进行遗传参数和育种值估计；动物模型如下：
y＝Xb′+Za′+e
其中，y代表观测值向量，b′代表固定效应向量，包括世代和性别，a′代表随机加性遗传效应向量和e代表随机残差效应向量；X和Z分别代表固定效应和随机加性遗传效应的相关矩阵；
随机向量的(协)方差矩阵如下：
其中，和/>分别代表加性遗传方差和剩余环境方差；H代表合并系谱和基因组亲缘关系矩阵；I代表单位矩阵。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明以快速白羽鸡种为素材，通过筛选与产蛋数相关的SNP位点，对这些位点进行早期分型，或者加权到基因组选择模型中。改善了肉鸡产蛋数选育进展缓慢，选择准确性差的问题。达到了快速培育白羽肉鸡高产品系，加速改良白羽肉鸡母系的效果；对于没有产蛋表型的公鸡也可以达到很好的选择效果；由于这些SNP位点位于Z染色体，公鸡的性染色体是ZZ，母鸡只有一个Z，因此可以直接通过纯合公鸡基因型筛选母鸡，节省分型成本。
在当前家禽饲养成本(饲料、人工、环境控制等)急剧飙升的大背景下，利用SNP整合的基因组选择法对周期产蛋数性状进行选择提高，即可节省新品系选育的成本，又可以提高配套制种的成功率，助力提高育种效率、加快我国白羽肉鸡自主品系培育，以缓解种源依赖国外品种的现状。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中SNP位点rs317316870的基因分型图。
图2为本发明较佳实施例中SNP位点rs313925951的基因分型图。
图3为本发明较佳实施例中SNP位点rs14786427的基因分型图。
图4为本发明较佳实施例中SNP位点rs14756086的基因分型图。
图5为本发明较佳实施例中SNP位点rs316455929的基因分型图。
图2～图4中，单峰表示纯合个体，A和B分别表示两种基因型的纯合个体。
具体实施方式
本发明提供与快大型白羽肉鸡产蛋数相关的位于鸡Z染色体(GGAZ)的影响产蛋数的显著SNP标记，标记信息见表1：
表1
Ensembl公共数据库中rs编号 GGA 位置 等位基因
rs317316870 Z 11050031 C/G
rs313925951 Z 11181269 A/G
rs14786427 Z 11995260 G/A
rs14756086 Z 12901091 T/C
rs316455929 Z 13662443 T/C
具体包括，鸡Z染色体(GGAZ)第11,050,031bp位置上的C/G突变、第11,181,269bp位置上的A/G突变、第11,995,260bp位置上的G/A突变、第12,901,091bp位置上的T/C突变、第13,662,443bp位置上的T/C突变。以上SNP标记的物理位置参考基因组galGal5。
本发明还提供一种整合产蛋数显著SNP位点的一步法GEBV估计、选择具有较高产蛋数纯系的方法。该方法包括：获得来自鸡的基因组DNA和基于SNP芯片的全基因组SNP；检测以上5个位点的基因型；利用改良的一步法进行GEBV估计，选择育种值较优个体留种。其中使用“京芯一号”SNP芯片包含了上述位点。
1、一种整合显著SNP标记的GEBV估计技术方案为：
(1)构建参考群体并且测定每只鸡的产蛋数性状，每只鸡各记录到60周龄的产蛋数。
(2)每只鸡采血保存，提取DNA并且利用“京芯一号”SNP芯片进行包括以上5个SNPs位点的分型，对基因分型后的数据进行处理和质量控制。
(3)基因组育种值估计方法如下：
步骤一、权重G矩阵构建
根据VanRaden算法，对于芯片基因组数据和5个SNPs，分别利用sommer软件包中A.mat函数进行构建亲缘关系矩阵，既G1和Gsnp。矫正Gsnp矩阵到G1矩阵水平：
其中，代表调整Gsnp矩阵，Gsnp代表基于5个SNP标记构建的亲缘关系矩阵，G1代表基于鸡全基因组SNP芯片(鸡55K SNP芯片)构建的基因组亲缘关系矩阵；其中，a和b的计算公式为：
A(diag(Gsnp))*b+a＝Avg(diag(G1))
A(offdiag(Gsnp)*b+a＝Avg(offdiag(G1)
设置G1和的相对权重公式为：
其中，G2代表权重G矩阵，c和d分别为G1和的权重系数。
步骤二、H矩阵构建
H矩阵构建为常用方法。矫正G2矩阵到测序的个体系谱亲缘关系矩阵(A22)的水平：
G*＝e+f*G2
其中，G*代表调整G2矩阵；其中，e和f的计算公式为：
A(diag(G2))*f+e＝Avg(diag(A22))
A(offdiag(G2)*f+e＝Avg(offdiag(A22)
设置G*和A22在H矩阵中的相对权重为Gw＝0.95*G*+0.05*A22；H矩阵的公式为：
其中，H-1代表合并系谱和基因组亲缘关系逆矩阵，A-1代表基于系谱亲缘关系逆矩阵，代表相对权重G*逆矩阵，/>代表测序的个体系谱亲缘关系逆矩阵。
步骤三、育种值估计
采用ASReml v4.1软件，利用约束最大似然法(REML)算法的单性状动物模型对RFI进行遗传参数和育种值估计。遗传力估计的动物模型如下：
y＝Xb′+Za′+e
其中，y代表观测值向量，b′代表固定效应向量，包括世代和性别，a′代表随机加性遗传效应向量和e代表随机残差效应向量；X和Z分别代表固定效应和随机加性遗传效应的相关矩阵；产蛋数性状：产蛋数；
随机向量的(协)方差矩阵如下：
其中，和/>分别代表加性遗传方差和剩余环境方差；H代表合并系谱和基因组亲缘关系矩阵；I代表单位矩阵。
与常规不对5个显著SNP设置权重的SSGBLUP估计结果相比，采用新方法可使准确性提高达到8.1％，显著SNP构建G矩阵后与常规G矩阵的最优权重比为0.03∶0.97。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning：a LaboratoryManual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1与产蛋数相关的显著SNP标记的获得
1、全基因组关联分析(GWAS)获得与产蛋数显著相关的SNPs
(1)试验动物和目标性状的测定
以弥勒新广农牧科技有限公司提供的快大型白羽肉鸡两个世代的2838只母鸡饲养，试验期为140～354d，测定性状为174～354日龄个体产蛋数。2838只母鸡中共有1777只母鸡进行基因分型，626只用于全基因组关联分析。
对2838只鸡产蛋数的描述性统计分析结果见表2和表3。
表2 627只母鸡产蛋数性状的描述性统计量
表3 2838只母鸡产蛋数性状的描述性统计量
(2)全基因组SNP与目标性状相关性分析
利用“京芯一号”鸡55K定制芯片，对626个样本进行全基因组关联分析。采用PLINK(V1.90)软件对芯片基因型数据进行质量控制，最后得到626个个体和37,595个SNPs。采用GEMMA(V0.98.1)软件(https://github.com/genetics-statistics/GEMMA/releases)中单性状混合线性模型(LMM)对产蛋数性状进行GWAS。
该模型包括SNP作为固定因子和加性多基因效应作为随机效应。使用PLINK(V1.90)软件中的参数--indep-pairwise 25 5 0.2来推断有效的独立检验。总共得到了7771个对整个染色体SNPs的独立检测。全基因组显著线和参考线分别为1.29E-04(1.00/7,771)和6.43E-06(0.05/7,771)。GWAS获得与产蛋数相关达到显著水平的SNP位点信息见表4。
表4 GWAS获得与产蛋数相关达到显著水平的SNP位点信息
rs号 染色体 位置 等位基因 最小等位基因频率 P值
rs317316870 Z 11050031 C/G 0.106 3.6536E-06
rs313925951 Z 11181269 A/G 0.114 9.8462E-06
rs14786427 Z 11995260 G/A 0.094 8.6291E-06
rs14756086 Z 12901091 T/C 0.155 3.3602E-05
rs316455929 Z 13662443 T/C 0.132 9.8001E-06
实施例2 5个SNP标记对产蛋数性状的影响
5个显著SNP位点对产蛋数性状的影响见表5。
表5 5个显著SNP位点对产蛋数性状的影响(最小二乘均值±标准差)
注：不同肩标字母表示差异显著(P<0.05)。
实施例3利用整合显著SNP标记进行白羽肉鸡产蛋数的基因组选择的效果评估
1、使用白羽肉鸡鸡检验群体，2838只，两个世代。表型记录了174～354d的个体每日产蛋数。统计每个个体的174-354日龄总产蛋数。
本实施例中，基因组选择的目标性状为产蛋数。采用55K SNP芯片进行全基因组SNP分型和5个最显著的SNP的分型，分别构建亲缘关系矩阵，两个矩阵给予不同的权重，与基于系谱亲缘关系矩阵合并为H矩阵。接着采用5倍交叉验证法对两个世代群体进行随机划分，既将2838只鸡随机划分为均匀的5个分组，每一组567只鸡。在5个均匀分组中，选取其中1个分组掩盖产蛋数表型值作为候选群体，其余鸡只作为参考群体。
2、基因标记质控
采用常用标准进行全基因组SNP的质量控制：个体基因型检出率小于90％，单个SNP位点检出率小于90％和最小等位基因频率小于5％，使用Beagle 5.0软件[14]对缺失SNPs进行基因型填充，确保统计上准确率和有效性。
3、权重G矩阵构建
根据VanRaden算法，对于芯片基因组数据和5个SNPs，分别利用sommer软件包中A.mat函数进行构建亲缘关系矩阵，既G1和Gsnp。矫正Gsnp矩阵到G1矩阵水平：
其中，代表调整Gsnp矩阵，Gsnp代表基于5个SNP标记构建的亲缘关系矩阵，G1代表基于鸡全基因组SNP芯片(鸡55K SNP芯片)构建的基因组亲缘关系矩阵；其中，a和b的计算公式为：
A(diag(Gsnp))*b+a＝Avg(diag(G1))
A(offdiag(Gsnp)*b+a＝Avg(offdiag(G1)
设置G1和的相对权重公式为：
其中，G2代表权重G矩阵，c和d分别为G1和的权重系数。
4、H矩阵构建
H矩阵构建为常用方法。矫正G2矩阵到测序的个体系谱亲缘关系矩阵(A22)的水平：
G*＝e+f*G2
其中，G*代表调整G2矩阵；其中，e和f的计算公式为：
A(diag(G2))*f+e＝Avg(diag(A22))
A(offdiag(G2)*f+e＝Avg(offdiag(A22)
设置G*和A22在H矩阵中的相对权重为Gw＝0.95*G*+0.05*A22；H矩阵的公式为：
其中，H-1代表合并系谱和基因组亲缘关系逆矩阵，A-1代表基于系谱亲缘关系逆矩阵，代表相对权重G*逆矩阵，/>代表测序的个体系谱亲缘关系逆矩阵。
5、育种值估计
采用ASReml v4.1软件，利用约束最大似然法(REML)算法的单性状动物模型对产蛋数性状进行遗传参数和育种值估计。遗传力估计的动物模型如下：
y＝Xb′+Za′+e
其中，y代表观测值向量，b′代表固定效应向量，包括世代和性别，a′代表随机加性遗传效应向量和e代表随机残差效应向量；X和Z分别代表固定效应和随机加性遗传效应的相关矩阵；
随机向量的(协)方差矩阵如下：
其中，和/>分别代表加性遗传方差和剩余环境方差；H代表合并系谱和基因组亲缘关系矩阵；I代表单位矩阵。
6、遗传力和交叉验证结果
利用R(V3.6.0)软件中caret包产生随机数。结果见表6。
表6 利用整合显著SNP标记的剩余采食量的基因组选择方法使用效果检验结果
根据以上交叉验证检验结果，与常规不对5个显著SNP设置权重的一步法估计结果相比，使用新方法能够使准确性提高达到8.1％，显著SNP构建G矩阵后与常规G矩阵的最优权重比为0.97∶0.03。相比较基于基因组矩阵进行育种值估计，一步法选择的准确性和本方法的准确性均能够提升8.0％以上。
实施例4利用整合显著SNP标记进行白羽肉鸡产蛋数的基因组选择的育种方法
1、参考群体的建立，表型性状测定和基因型测定
每个品系建立独立的参考群，参考群的来源要求覆盖到品系已有的全部家系。当参考群鸡饲养接近52周龄时，组建1000-1500只鸡的群体作为参考群体。参考群有明确的表型记录(方法参见实施例3)、系谱记录，采集血液样本，提取DNA，送测鸡全基因组SNP芯片。确定3-5万个全基因组平均分布的SNP位点的基因型。具体流程可参考ZL201780023241.X(一种鸡全基因组SNP芯片及其应用)。确定参考群每只鸡全基因组约5万个位点的结果，用于下一步GEBV的估计。
2、待测群体的建立与全基因组基因型采集
待测群是指没有表型性状记录，且准备用于繁育下一代的候选种鸡群。待测群要求与参考群具有5个世代以内的亲缘关系。待测群在不影响鸡成活率和生长发育的前提下，尽早采集血液样本送测鸡全基因组SNP芯片。之后以上述步骤3中方法进行全基因组SNP位点基因型检测和质控。
3、参考群体和候选群体的个体基因组估计育种值(GEBV)分析
利用①参考群体每个个体的表型值②参考群每个个体全基因组5万个位点的基因型③待测群体每一个个体的全基因组基因型④参考群和所有待留种个体的系谱记录(包括参考群在内)，共4类文件准备利用本方法进行基因组估计育种值(GEBV)估计。
4、鸡高产蛋数品系的选择方法
根据全基因组选择计算得出的待测群体及其存栏同胞的GEBV的大小，在表型缺失的情况下，对候选留种群体的产蛋数GEBV进行评估和排序，选择GEBV高的候选群体个体作为亲本，一般公鸡选择100～500，母鸡选择1000～2000，留种组建家系；或是加权后与其他性状进行指数选择。
实施例5利用SNP标记等位基因状态辅助进行白羽肉鸡产蛋数的分子育种方法
上述与产蛋数显著相关的5个SNP标记，也可以利用常用方法进行选留，具体过程如下：
1、待选择群体
随机挑选待检测鸡。于140日龄后翅静脉采血，ACD抗凝，-20℃保存备用。
2、DNA提取
采用常规酚仿法提取基因组DNA，溶于TE中，用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法双重检测DNA的纯度和浓度，然后稀释至浓度50ng/μl。
3、PCR反应及序列测定
用于扩增SNP的引物序列见表7，利用PCR扩增在ABI Life ProFlex PCR仪热循环仪中进行。PCR反应程序为：95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃5min。PCR反应体系以25μl计为：模板DNA 3μl，10pmol/μl上游引物1μl，10pmol/μl下游引物1μl，2×Master mix 12.5μl，ddH2O 7.5μl。
表7 用于扩增SNP的引物序列(SEQ ID NO：1-10)
rs317316870、rs313925951、rs14786427、rs14756086、rs316455929的基因分型图分别见图1～图5。
采用直接测序法或其他有效方式对扩增产物进行等位基因检测。根据基因分型结果选留：由于所筛选出来的位点位于Z染色体上，公鸡是ZZ，母鸡是ZW，因此可以通过纯合体公鸡选择后代母鸡，母鸡只有一种基因型。标记rs317316870所含多态性位点的基因型为GG，和/或标记rs313925951所含多态性位点的基因型为GG，和/或标记rs14786427所含多态性位点的基因型为GG，和/或标记rs14756086所含多态性位点的基因型为TT，和/或标记rs316455929所含多态性位点的基因型为CC的健康公鸡。按照不低于80只公鸡，公母比例不低于1∶10的数量留种，产蛋高峰期组建新的家系繁种。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献：
1.Meuwissen，T.H.，B.J.Hayes，and M.E.Goddard，Prediction of totalgenetic value using genome-wide dense marker maps.Genetics，2001.157(4)：p.1819-29.
2.Meuwissen，T.，Genomic selection：marker assisted selection on agenome wide scale.J Anim Breed Genet，2007.124(6)：p.321-2.
3.Neves，H.H.，et al.，Accuracy of genomic predictions in Bos indicus(Nellore)cattle.Genet Sel Evol，2014.46(1)：p.17.
4.Fernandes Júnior，G.A.，et al.，Genomic prediction of breeding valuesfor carcass traits in Nellore cattle.Genet Sel Evol，2016.48：p.7.
5.Fangmann，A.，et al.，Empirical comparison between different methodsfor genomic prediction of number of piglets born alive in moderate sizedbreeding populations.J Anim Sci，2017.95(4)：p.1434-1443.
6.Santos，V.S.，et al.，Genomic prediction for additive and dominanceeffects of censored traits in pigs.Genet Mol Res，2016.15(4).
7.Guo，X.，et al.，Genomic prediction using models with dominance andimprinting effects for backfat thickness and average daily gain in DanishDuroc pigs.Genet Sel Evol，2016.48(1)：p.67.
8.Mucha，S.，et al.，Estimation of genomic breeding values for milkyield in UK dairy goats.J Dairy Sci，2015.98(11)：p.8201-8.
9.McLaren，A.，et al.，New mastitis phenetypes suitable for genomicselection in meat sheep and their genetic relationships with udderconformation and lamb live weights.Animal，2018.12(12)：p.2470-2479.
10.Auvray，B.，et al.，Genomic prediction of breeding values in the NewZealand sheep industry using a 50K SNP chip.J Anim Sci，2014.92(10)：p.4375-89.
11.Garcia，A.L.S.，et al.，Development of genomic predictions forharvest and carcass weight in channel catfish.Genet Sel Evol，2018.50(1)：p.66.
12.Bangera，R.，et al.，Genomic predictions can accelerate selection forresistance against Piscirickettsia salmonis in Atlantic salmon(Salmo salar).BMC Genomics，2017.18(1)：p.121.
13.VanRaden，P.M.，Efficient methods to compute genomic predictions.JDairy Sci，2008.91(11)：p.4414-23.
14.Browning，B.L.，Y.Zhou，and S.R.Browning，A One-Penny Imputed Genomefrom Next-Generation Reference Panels.Am J Hum Genet，2018.103(3)：p.338-348.
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种白羽肉鸡产蛋数的基因组选择方法
<130> KHP211117933.8
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctggcttgg gagttgctaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taagggtgct ggctgagtat 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacctgacaa gcagcagtct tc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggagagcct gaagttagac ct 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggaaaacct gtggagactg c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccctcctca cgtttcaaag a 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcttcttcca gcagtttacg a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tttggtggtt ctcatctccc t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcatccaca ccgtcatact t 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gactggcgtt tctcaaatgc tt 22

Claims (8)

1.用于扩增与白羽肉鸡产蛋数显著相关的SNP标记的引物组，其特征在于，所述引物组为扩增标记rs317316870的如SEQ ID NO:1-2所示的上、下游引物，扩增标记rs313925951的如SEQ ID NO:3-4所示的上、下游引物，扩增标记rs14786427的如SEQ ID NO:5-6所示的上、下游引物，扩增标记rs14756086的如SEQ ID NO:7-8所示的上、下游引物和扩增标记rs316455929的如SEQ ID NO:9-10所示的上、下游引物；
其中，与白羽肉鸡产蛋数显著相关的SNP标记包括标记rs317316870、rs313925951、rs14786427、rs14756086和rs316455929；
标记rs317316870含有鸡Z染色体上第11050031 bp处多态性为C/G的核苷酸序列；
标记rs313925951含有鸡Z染色体上第11181269 bp处多态性为A/G的核苷酸序列；
标记rs14786427含有鸡Z染色体上第11995260 bp处多态性为G/A的核苷酸序列；
标记rs14756086含有鸡Z染色体上第12901091 bp处多态性为T/C的核苷酸序列；
标记rs316455929含有鸡Z染色体上第13662443 bp处多态性为T/C的核苷酸序列；
以上SNP标记的物理位置参考基因组galGal5；
标记rs317316870所含多态性位点的基因型为CC，对应于低产蛋数水平，若基因型为GG，对应于高产蛋数水平；
标记rs313925951所含多态性位点的基因型为AA，对应于低产蛋数水平，若基因型为GG，对应于高产蛋数水平；
标记rs14786427所含多态性位点的基因型为AA，对应于低产蛋数水平，若基因型为GG，对应于高产蛋数水平；
标记rs14756086所含多态性位点的基因型为CC，对应于低产蛋数水平，若基因型为TT，对应于高产蛋数水平；
标记rs316455929所含多态性位点的基因型为TT，对应于低产蛋数水平，若基因型为CC，对应于高产蛋数水平。
2.含有权利要求1所述引物组的检测试剂或试剂盒。
3.高产蛋数白羽肉鸡的鉴定及选育方法，其特征在于，包括：
1)提取待测白羽肉鸡总DNA；
2)以DNA为模板，利用权利要求1所述引物组进行PCR扩增；
3)分析PCR扩增产物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR反应体系为：模板DNA 3μl，10pmol/μl上、下游引物各1μl，2×Master mix 12.5μl，ddH2O 7.5μl；和/或
PCR反应程序为：95℃ 3min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，共30个循环；72℃ 5min。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤3)包括：对扩增产物进行测序，根据测序结果判定如下：
若标记rs317316870对应的多态性位点的基因型为GG，判定为高产蛋数白羽肉鸡；
若标记rs313925951对应的多态性位点的基因型为GG，判定为高产蛋数白羽肉鸡；
若标记rs14786427对应的多态性位点的基因型为GG，判定为高产蛋数白羽肉鸡；
若标记rs147560867对应的多态性位点的基因型为TT，判定为高产蛋数白羽肉鸡；
若标记rs316455929对应的多态性位点的基因型为CC，判定为高产蛋数白羽肉鸡。
6.与白羽肉鸡产蛋数显著相关的SNP标记或其检测试剂的以下任一应用：
(1)用于高产蛋数白羽肉鸡的早期预测；
(2)用于白羽肉鸡分子标记辅助育种；
其中，与白羽肉鸡产蛋数显著相关的SNP标记同权利要求1中所述。
7.一种白羽肉鸡产蛋数的基因组选择方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、提取白羽肉鸡样本基因组DNA，利用鸡全基因组SNP芯片对所有样本进行全基因组SNP分型，并对基因分型后的数据进行处理和质量控制；
B、获得所有样本的5个SNP标记rs317316870、rs313925951、rs14786427、rs14756086和rs316455929的基因分型数据；其中，标记rs317316870、rs313925951、rs14786427、rs14756086和rs316455929同权利要求1中所述；
C、结合步骤A和B的基因分型数据进行全基因组育种值估计，选留育种值较优个体，选留的公、母鸡组建家系纯繁。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤C进行全基因组育种值估计的方法包括：
S1、权重G矩阵构建
根据VanRaden算法，对于步骤A和B中获得的基因分型数据，分别利用sommer软件包中A.mat函数构建亲缘关系矩阵，即G1和Gsnp；矫正Gsnp矩阵到G1矩阵水平：
其中，代表调整Gsnp矩阵，Gsnp代表基于5个SNP标记构建的亲缘关系矩阵，G1代表基于鸡全基因组SNP芯片构建的基因组亲缘关系矩阵；其中，a和b的计算公式为：
A(diag(Gsnp))*b+a＝Avg(diag(G1))
A(offdiag(Gsnp)*b+a＝Avg(offdiag(G1)
设置G1和的相对权重公式为：
其中，G2代表权重G矩阵，c和d分别为G1和的权重系数；
S2、H矩阵构建
矫正G2矩阵到测序的个体系谱亲缘关系矩阵A22的水平：
G*＝e+f*G2
其中，G*代表调整G2矩阵；其中，e和f的计算公式为：
A(diag(G2))*f+e＝Avg(diag(A22))
A(offdiag(G2)*f+e＝Avg(offdiag(A22)
设置G*和A22在H矩阵中的相对权重为Gw＝0.95*G*+0.05*A22；H矩阵的公式为：
其中，H-1代表合并系谱和基因组亲缘关系逆矩阵，A-1代表基于系谱亲缘关系逆矩阵，代表相对权重G*逆矩阵，/>代表测序的个体系谱亲缘关系逆矩阵；
S3、育种值估计
采用ASReml v4.1软件，利用约束最大似然法算法的单性状动物模型对产蛋数性状进行遗传参数和育种值估计；动物模型如下：
y＝Xb′+Za′+e
其中，y代表观测值向量，b′代表固定效应向量，包括世代和性别，a′代表随机加性遗传效应向量和e代表随机残差效应向量；X和Z分别代表固定效应和随机加性遗传效应的相关矩阵；
随机向量的方差矩阵如下：
其中，和/>分别代表加性遗传方差和剩余环境方差；H代表合并系谱和基因组亲缘关系矩阵；I代表单位矩阵。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116606938A (zh) * 2023-05-26 2023-08-18 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 提高黄羽肉鸡先天免疫能力相关的snp位点及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110684851A (zh) * 2019-09-19 2020-01-14 江苏省家禽科学研究所 一种与鸡粉壳蛋暗斑相关的snp分子标记及其应用
WO2020062160A1 (zh) * 2018-09-29 2020-04-02 中国农业大学 一种蛋鸡全基因组snp芯片及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020062160A1 (zh) * 2018-09-29 2020-04-02 中国农业大学 一种蛋鸡全基因组snp芯片及其应用
CN110684851A (zh) * 2019-09-19 2020-01-14 江苏省家禽科学研究所 一种与鸡粉壳蛋暗斑相关的snp分子标记及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Genome-Wide Association Study of H/L Traits in Chicken;Bo Zhu等;《Animals》;第9卷(第260期);第1-12页 *
鸡基因组育种和保种用SNP芯片研发及应用;刘冉冉等;《中国家禽》;第40卷(第15期);第1-6页 *

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