CN112266965B - 一种提高黄羽肉鸡剩余采食量遗传进展的基因组选择方法 - Google Patents

一种提高黄羽肉鸡剩余采食量遗传进展的基因组选择方法 Download PDF

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CN112266965B CN202011080486.6A CN202011080486A CN112266965B CN 112266965 B CN112266965 B CN 112266965B CN 202011080486 A CN202011080486 A CN 202011080486A CN 112266965 B CN112266965 B CN 112266965B
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Abstract

本发明提供一种提高黄羽肉鸡剩余采食量遗传进展的基因组选择方法，并进一步提供与黄羽肉鸡剩余采食量性状显著相关的4个SNP标记及其应用。本发明以快大型黄羽鸡种为素材，通过RFI的表型和全基因组SNP测定，筛选并验证获得黄羽肉鸡RFI控制显著SNP标记。通过在SSGBLUP方法估计中增加显著SNP权重的方法，提高育种值估计的准确性。为实现RFI复杂性状的早期选择和性状相关等位基因的快速纯和，加快遗传选择进展提供技术支撑。培育品系的优势等位基因位点处于高频或纯和状态，在新品系应用于配套系创制过程中，还可较大程度上避免出现后代性状分离的问题。

Description

一种提高黄羽肉鸡剩余采食量遗传进展的基因组选择方法
技术领域
本发明涉及遗传育种和分子生物学领域，具体地说，涉及一种提高黄羽肉鸡剩余采食量遗传进展的基因组选择方法，并进一步涉及与黄羽肉鸡剩余采食量性状显著相关的SNP标记及其应用。
背景技术
我国鸡肉生产主要以黄羽肉鸡和白羽肉鸡为主，鸡肉产量位居世界第三，尽管在鸡肉产量上足够大，但是我国自主培育的优良品种仍然落后于国外，白羽肉鸡祖代鸡几乎全部依赖于进口，因此国产化肉鸡育种依然面临着巨大的压力。黄羽肉鸡约占鸡肉总产量的40％，由于肉鸡生产成本70％左右是饲料成本，且相对白羽肉鸡来说黄羽肉鸡料重比较高，生长速度较慢，因此如何节约饲料成本，进而提高生产效率是黄羽肉鸡育种中最为关注的问题之一。
2001年Meuwissen等研究发现，通过对全基因组内所有SNP标记效应值的估计可以实现对育种值的预测，计算得到的育种值称为基因组估计育种值(GEBV)，也可谓之改良版的标记辅助选择(MAS)。现在GS技术已经在牛、猪、羊及水产养殖中得到广泛应用。在鸡基因组中存在大量可用的SNP标记，使得GS技术应用于鸡育种中变得可行，利用SNP和QTL之间的连锁不平衡(LD)，得出每个QTL对于性状的影响，将所有的QTL效应加在一起，得到候选个体的基因组育种值。如今已在多个大型国际家禽育种公司中被广泛应用于肉鸡和蛋鸡的选择中。由于传统的育种值计算忽略了基因效应值对于个体遗传的影响，而GS技术结合了表型记录、系谱关系以及个体的基因组信息进行关联分析，使准确性得到很大程度的提高。通过使用全基因组SNP芯片对个体基因型进行大量的检测，能够分析多性状的SNP位点，对多性状进行同时选择，显著提高了选择效率，降低育种成本，而且更适用于一些遗传力低和难以测定的性状。基因组选择的计算模型主要分为两大类：包括以直接估计基因组育种值的GBLUP法和一步法(single-step GBLUP,SSGBLUP)为代表的直接法以及以通过标记效应计算基因组育种值的BayesA、BayesB、RRBLUP法为代表的间接法。由于家禽的群体相较于奶牛和猪来说群体较大，世代较多，因此在家禽中最常用的方法为SSGBLUP。
剩余采食量(Residual Feed Intake，RFI)定义为实际采食量与预期采食量之差，将能量分为维持能和代谢能，在个体中的表现主要是个体代谢效率上的差异，与体重等生产指标不存在相关性，可以作为一个更好的指标衡量饲料效率。
综上，在当前家禽饲养成本(饲料、人工、环境控制等)急剧飙升的大背景下，利用SNP整合的基因组选择法对复杂RFI性状进行选择提高，即可节省新品系选育的成本，又可以提高配套制种的成功率，助力提高育种效率，加快我国黄羽肉鸡自主品系培育，尽快缓解种源依赖国外品种的现状。
发明内容
本发明的目的是提供与黄羽肉鸡剩余采食量性状显著相关的SNP标记及其应用。
本发明的另一目的是提供一种提高黄羽肉鸡剩余采食量遗传进展的基因组选择方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供与黄羽肉鸡剩余采食量性状显著相关的SNP标记，包括标记rs317793149、rs315554811、rs16346910和rs15045976；
其中，标记rs317793149含有黄羽肉鸡14号染色体上第3,022,607bp处多态性为A/G的核苷酸序列；
标记rs315554811含有黄羽肉鸡18号染色体上第9,222,833bp处多态性为T/C的核苷酸序列；
标记rs16346910含有黄羽肉鸡18号染色体上第9,299,938bp处多态性为T/C的核苷酸序列；
标记rs15045976含有黄羽肉鸡19号染色体上第3,331,267bp处多态性为A/G的核苷酸序列。
以上SNP标记的物理位置参考基因组galGal6版本。
标记rs317793149所含多态性位点的基因型为AA，对应于高剩余采食量水平，若基因型为GG，对应于低剩余采食量水平；若基因型为AG，剩余采食量水平居中；
标记rs315554811所含多态性位点的基因型为CC，对应于低剩余采食量水平，若基因型为TT，对应于高剩余采食量水平，若基因型为CT，剩余采食量水平居中；
标记rs16346910所含多态性位点的基因型为TT，对应于低剩余采食量水平，若基因型为CC，对应于高剩余采食量水平，若基因型为CT，剩余采食量水平居中；
标记rs15045976所含多态性位点的基因型为AA，对应于低剩余采食量水平，若基因型为GG，对应于高剩余采食量水平，若基因型为AG，剩余采食量水平居中。
第二方面，本发明提供用于扩增所述SNP标记的引物，扩增标记rs317793149的上、下游如SEQ ID NO:1-2所示，扩增标记rs315554811的上、下游如SEQ ID NO:3-4 所示，扩增标记rs16346910的上、下游如SEQ ID NO:5-6所示，扩增标记rs15045976 的上、下游如SEQID NO:7-8所示。
第三方面，本发明提供含有所述引物的检测试剂或试剂盒。
第四方面，本发明提供具有低剩余采食量性状的黄羽肉鸡的鉴定及选育方法，包括：
1)提取待测黄羽肉鸡总DNA；
2)以DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增；
3)分析PCR扩增产物。
前述的方法，PCR反应体系为：模板DNA 1.5μl，10pmol/μl上、下游引物各1.5μl， 2×Master mix 15μl，ddH2O 10.5μl。
PCR反应程序为：95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，共35个循环； 72℃5min。
步骤3)包括：对扩增产物进行测序，根据测序结果判定如下：
若标记rs317793149对应的多态性位点的基因型为GG，判定待测黄羽肉鸡具有低剩余采食量水平；
若标记rs315554811对应的多态性位点的基因型为CC，判定待测黄羽肉鸡具有低剩余采食量水平；
若标记rs16346910对应的多态性位点的基因型为TT，判定待测黄羽肉鸡具有低剩余采食量水平；
若标记rs15045976对应的多态性位点的基因型为AA，判定待测黄羽肉鸡具有低剩余采食量水平。
第五方面，本发明提供所述SNP标记或其检测试剂的以下任一应用：
(1)用于黄羽肉鸡饲料报酬的辅助评价；
(2)用于具有低剩余采食量性状黄羽肉种鸡的早期预测；
(3)用于黄羽肉鸡分子标记辅助育种。
第六方面，本发明提供一种提高黄羽肉鸡剩余采食量遗传进展的基因组选择方法，即具有低剩余采食量性状的黄羽肉鸡品系的高效选育方法，包括以下步骤：
A、提取黄羽肉鸡样本基因组DNA，利用鸡全基因组SNP芯片对所有样本进行全基因组SNP分型，并对基因分型后的数据进行处理和质量控制；
B、获得所有样本的4个SNP标记rs317793149、rs315554811、rs16346910和rs15045976的基因分型数据；
C、结合步骤A和B的基因分型数据进行全基因组育种值分析，选留育种值较优个体，选留的公、母鸡组建家系纯繁。
前述的方法，步骤C进行全基因组育种值分析的方法包括：
S1、权重G矩阵构建
根据VanRaden算法，对于芯片基因组数据和4个SNPs，分别利用sommer软件包中A.mat函数进行构建亲缘关系矩阵，即G1和Gsnp。矫正Gsnp矩阵到G1矩阵水平：
Figure RE-GDA0002850709160000041
式中，
Figure RE-GDA0002850709160000042
代表调整Gsnp矩阵，Gsnp代表基于显著SNPs构建亲缘关系矩阵。其中，a和b的计算公式为：
Avg(diag(Gsnp))*b+a＝Avg(diag(G1))
Avg(offdiag(Gsnp)*b+a＝Avg(offdiag(G1)
设置G1和
Figure RE-GDA0002850709160000043
的相对权重公式为：
Figure RE-GDA0002850709160000044
式中，G2代表权重G矩阵，G1和
Figure RE-GDA0002850709160000045
同上，c和d分别为G1和
Figure RE-GDA0002850709160000046
的权重系数。
S2、H矩阵构建
H矩阵构建为常用方法。矫正G2矩阵到测序的个体系谱亲缘关系矩阵(A22)的水平：
G*＝e+f*G2
式中，G*代表调整G2矩阵。其中，e和f的计算公式为：
Avg(diag(G2))*f+e＝Avg(diag(A22)
Avg(offdiag(G2)*f+e＝Avg(offdiag(A22)
设置G*和A22在H矩阵中的相对权重为Gw＝0.95*G*+0.05*A22。H矩阵的公式为：
Figure RE-GDA0002850709160000047
式中，H-1代表合并系谱和基因组亲缘关系逆矩阵，A-1代表基于系谱亲缘关系逆矩阵，
Figure RE-GDA0002850709160000048
代表相对权重G*逆矩阵和
Figure RE-GDA0002850709160000049
代表是测序的个体系谱亲缘关系逆矩阵。
S3、育种值估计
采用ASReml v4.1软件，利用约束最大似然法(REML)算法的单性状动物模型对RFI进行遗传参数和育种值估计。遗传力估计的动物模型如下：
y＝Xb′+Za′+e
式中，y代表观测值向量，b′代表固定效应向量，包括世代和性别，a′代表随机加性遗传效应向量和e代表随机残差效应向量。X和Z分别代表固定效应和随机加性遗传效应的相关矩阵。
随机向量的(协)方差矩阵如下：
Figure RE-GDA00028507091600000410
式中，
Figure RE-GDA00028507091600000411
和
Figure RE-GDA00028507091600000412
分别代表加性遗传方差和剩余环境方差；H代表合并系谱和基因组亲缘关系矩阵；I代表单位矩阵。
本发明以快大型黄羽鸡种为素材，通过RFI的表型和全基因组SNP测定，筛选并验证获得黄羽肉鸡RFI控制显著SNP标记。通过在SSGBLUP方法估计中增加显著SNP 权重的方法，提高育种值估计的准确性。为实现RFI复杂性状的早期选择和性状相关等位基因的快速纯和，加快遗传选择进展提供技术支撑。培育品系的优势等位基因位点处于高频或纯和状态，在新品系应用于配套系创制过程中，还可较大程度上避免出现后代性状分离的问题。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中SNP位点rs317793149的基因分型图。
图2为本发明较佳实施例中SNP位点rs315554811的基因分型图。其中，rs315554811位点的TC为反向测序。
图3为本发明较佳实施例中SNP位点rs16346910的基因分型图。
图4为本发明较佳实施例中SNP位点rs15045976的基因分型图。
具体实施方式
本发明旨在提供一种与快大型黄羽肉鸡剩余采食量相关的位于鸡14、18和19号染色体(GGA14、GGA18和GGA19)的影响RFI的显著SNP标记。详细信息如下：
Ensembl公共数据库中rs编号 GGA 位置 等位基因
rs317793149 14 3,022,607 A/G
rs315554811 18 9,222,833 T/C
rs16346910 18 9,299,938 T/C
rs15045976 19 3,331,267 A/G
具体包括，鸡14号染色体(GGA14)3,022,607位置上的A/G突变，鸡18号染色体(GGA18)9,222,833位置上的T/C突变，鸡18号染色体(GGA18)9,299,938位置上的T/C 突变，鸡19号染色体(GGA19)3,331,267位置上的A/G突变(参考基因组：galGal6)。
本发明还提供一种整合RFI显著SNP位点的一步法GEBV估计，选择具有较低RFI 纯系的方法。该方法包括：获得来自鸡的基因组DNA和基于SNP芯片的全基因组SNP；检测以上4个位点的基因型；利用改良的一步法进行GEBV估计，选择育种值较优个体留种。优选地，使用“京芯一号”鸡55K SNP芯片(参见CN111225986A)，该芯片已经包含了上述位点。
本发明提供一种整合显著SNP标记的GEBV估计方法，采用的技术方案如下：
(1)构建参考群体并测定用于计算RFI的相关性状；RFI计算公式如下：
ADFI＝μ+β1MBW+β2ADG+e1
式中，ADFI代表平均日采食量，μ代表截距，MBW代表试验中期代谢体重，ADG 代表平均日增重，β1和β2代表偏回归系数，e1代表残差，即RFI，单位为g/d。
(2)对参考群体的每只鸡采血保存，提取DNA并且利用“京芯一号”SNP芯片进行包括以上4个SNPs位点的分型，对基因分型后的数据进行处理和质量控制。
(3)基因组育种值估计方法如下：
S1、权重G矩阵构建
根据VanRaden算法，对于芯片基因组数据和4个SNPs，分别利用sommer软件包中A.mat函数进行构建亲缘关系矩阵，即G1和Gsnp。矫正Gsnp矩阵到G1矩阵水平：
Figure RE-GDA0002850709160000061
式中，
Figure RE-GDA0002850709160000062
代表调整Gsnp矩阵，Gsnp代表基于显著SNPs构建亲缘关系矩阵。其中，a和b的计算公式为：
Avg(diag(Gsnp))*b+a＝Avg(diag(G1))
Avg(offdiag(Gsnp)*b+a＝Avg(offdiag(G1)
设置G1和
Figure RE-GDA0002850709160000063
的相对权重公式为：
Figure RE-GDA0002850709160000064
式中，G2代表权重G矩阵，G1和
Figure RE-GDA0002850709160000065
司上，c和d分别为G1和
Figure RE-GDA0002850709160000066
的权重系数。
S2、H矩阵构建
H矩阵构建为常用方法。矫正G2矩阵到测序的个体系谱亲缘关系矩阵(A22)的水平：
G*＝e+f*G2
式中，G*代表调整G2矩阵。其中，e和f的计算公式为：
Avg(diag(G2))*f+e＝Avg(diag(A22)
Avg(offdiag(G2)*f+e＝Avg(offdiag(A22)
设置G*和A22在H矩阵中的相对权重为Gw＝0.95*G*+0.05*A22。H矩阵的公式为：
Figure RE-GDA0002850709160000067
式中，H-1代表合并系谱和基因组亲缘关系逆矩阵，A-1代表基于系谱亲缘关系逆矩阵，
Figure RE-GDA0002850709160000068
代表相对权重G*逆矩阵和
Figure RE-GDA0002850709160000069
代表是测序的个体系谱亲缘关系逆矩阵。
S3、育种值估计
采用ASReml v4.1软件，利用约束最大似然法(REML)算法的单性状动物模型对RFI进行遗传参数和育种值估计。遗传力估计的动物模型如下：
y＝Xb′+Za′+e
式中，y代表观测值向量，b′代表固定效应向量，包括世代和性别，a′代表随机加性遗传效应向量和e代表随机残差效应向量。X和Z分别代表固定效应和随机加性遗传效应的相关矩阵。
随机向量的(协)方差矩阵如下：
Figure RE-GDA0002850709160000071
式中，
Figure RE-GDA0002850709160000072
和
Figure RE-GDA0002850709160000073
分别代表加性遗传方差和剩余环境方差；H代表合并系谱和基因组亲缘关系矩阵；I代表单位矩阵。
与常规不对4个显著SNP设置权重的SSGBLUP估计结果相比，新方法使用能使准确性提高至61％，显著SNP构建G矩阵后与常规G矩阵的最优权重比为0.4∶0.6。相较基于基因组矩阵进行育种值估计，本方法准确性均提升25％以上。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1与RFI相关的显著SNP标记的获得
1、全基因组关联分析(GWAS)获得18号染色体存在与剩余采食量RFI显著相关的RFI
(1)试验动物和目标性状的测定
以广西金陵农牧集团公司提供的快大型金陵花鸡一个世代的530只公鸡饲养，试验期为42～56d，测定性状包括了42日龄体重、56日龄体重，42～56日龄生长期内总采食量；计算出生于采食量(RFI)、饲料转化率(FCR)、平均日增重(ADFI)、平均日增重(ADG)。
RFI计算方法为：预期采食量估计是根据平均日采食量与中期代谢体重和平均日增重的线性回归方程得到，方程如下：
ADFI＝μ+β1MBW+β2ADG+e1
式中，ADFI代表平均日采食量，μ代表截距，MBW代表中期代谢体重(平均42、 56日龄体重的0.75次方)，ADG代表平均日增重，β1和β2代表偏回归系数，e1代表残差，即RFI。其他性状均按照本领域常用方法计算得出。
对530只鸡饲料报酬相关的描述性统计分析结果见表1。
表1肉鸡饲料相关性状的描述性统计量
性状 数量 均值 SD 最小值 最大值 变异系数CV，％
42日龄体重，g 530 1310.28 113.62 1046 1580.2 8.67
56日龄体重，g 530 2175.1 163.6 1771 2578 7.52
ADFI，g/d 530 150.15 17.21 109.43 193.64 11.46
RFI，g/d 530 0 10.871 -28.80 31.79 -
ADG，g/d 530 61.77 6.52 45.11 77.1 10.55
FCR，g：g 530 2.44 0.191 2 2.94 7.85
(2)全基因组SNP与目标性状相关性分析
利用“京芯一号”鸡55K芯片，对所有样本进行全基因组SNP分型。采用PLINK(V1.90b)软件对芯片基因型数据进行质量控制，最后得到530个个体和43470个SNPs。采用GEMMA(V0.98.1)软件(https://github.com/genetics-statistics/GEMMA/releases)中单性状混合线性模型(LMM)对RFI性状进行GWAS。该模型包括SNP作为固定因子和加性多基因效应作为随机效应。全基因组显著线和参考线分别为1.15e-6(0.05/43470) 和2.3e-5(1/43470)。GWAS获得与RFI相关达到5％基因组/染色体水平显著的SNP位点信息见表2。
表2 GWAS获得与RFI相关达到5％基因组/染色体水平显著的SNP位点信息
Figure RE-GDA0002850709160000081
a：SNP解释的表型方差。
SNP位点rs317793149、rs315554811、rs16346910和rs15045976的基因分型图分别见图1～图4。
实施例2检验4个标记对RFI等多性状的影响
1、位点对于饲料利用效率相关性状的影响效应分析
如表3所示，对RFI、平均日采食量(ADFI)两个主要指标，4个显著SNP位点均在两个等位基因纯合型间差异显著(P<0.05)，与理论相吻合。
表3 4个显著SNP位点对于饲料利用效率相关性状的影响(最小二乘均值±标准差)
Figure RE-GDA0002850709160000082
Figure RE-GDA0002850709160000091
注：不同肩标字母表不差异显著(P＜0.05)。
实施例3利用整合显著SNP标记进行黄羽肉鸡剩余采食量的基因组选择的效果评估
(1)使用黄羽肉鸡鸡检验群体，共530只，一个世代。表型记录了42日龄体重、 56日龄体重和42～56日龄生长期内总采食量，RFI计算公式如下：
ADFI＝μ+β1MBW+β2ADG+e1
式中，ADFI代表平均日采食量，μ代表截距，MBW代表试验中期代谢体重，ADG 代表平均日增重，β1和β2代表偏回归系数，e1代表残差，即RFI，单位为g/d。
本实施例中，基因组选择的目标性状为RFI。采用55K SNP芯片进行全基因组SNP分型和4个最显著的SNP的分型，分别构建亲缘关系矩阵，两个矩阵给予不同的权重，与基于系谱亲缘关系矩阵合并为H矩阵。接着采用10倍交叉验证法对两个世代群体进行随机划分，即将530只鸡随机分化为均匀的10个分组，每一组53只鸡。在10个均匀分组中，选取其中1个分组掩盖RFI表型值作为候选群体，其余鸡只作为参考群体。
(2)基因标记质控
采用常用标准进行全基因组SNP的质量控制：个体基因型检出率小于90％，单个SNP位点检出率小于90％和最小等位基因频率小于5％，使用Beagle 5.0软件对缺失 SNPs进行基因型填充，确保统计上准确率和有效性。
(3)权重G矩阵构建
根据VanRaden算法，对于芯片基因组数据和4个SNPs，分别利用sommer软件包中A.mat函数进行构建亲缘关系矩阵，即G1和Gsnp。矫正Gsnp矩阵到G1矩阵水平：
Figure RE-GDA0002850709160000092
式中，
Figure RE-GDA0002850709160000093
代表调整Gsnp矩阵，Gsnp代表基于显著SNPs构建亲缘关系矩阵。其中，a和b的计算公式为：
Avg(diag(Gsnp))*b+a＝Avg(diag(G1))
Avg(offdiag(Gsnp)*b+a＝Avg(offdiag(G1)
设置G1和
Figure RE-GDA0002850709160000094
的相对权重公式为：
Figure RE-GDA0002850709160000095
式中，G2代表权重G矩阵，G1和
Figure RE-GDA0002850709160000096
同上，c和d分别为G1和
Figure RE-GDA0002850709160000097
的权重系数。
(4)H矩阵构建
H矩阵构建为常用方法。矫正G2矩阵到测序的个体系谱亲缘关系矩阵(A22)的水平：
G*＝e+f*G2
式中，G*代表调整G2矩阵。其中，e和f的计算公式为：
Avg(diag(G2))*f+e＝Avg(diag(A22)
Avg(offdiag(G2)*f+e＝Avg(offdiag(A22)
设置G*和A22在H矩阵中的相对权重为Gw＝0.95*G*+0.05*A22。H矩阵的公式为：
Figure RE-GDA0002850709160000101
式中，H-1代表合并系谱和基因组亲缘关系逆矩阵，A-1代表基于系谱亲缘关系逆矩阵，
Figure RE-GDA0002850709160000102
代表相对权重G*逆矩阵和
Figure RE-GDA0002850709160000103
代表是测序的个体系谱亲缘关系逆矩阵。
(5)估计育种值
采用ASReml v4.1软件，利用约束最大似然法(REML)算法的单性状动物模型对RFI进行遗传参数和育种值估计。遗传力估计的动物模型如下：
y＝Xb′+Za′+e
式中，y代表观测值向量，b′代表固定效应向量，包括世代和性别，a′代表随机加性遗传效应向量和e代表随机残差效应向量。X和Z分别代表固定效应和随机加性遗传效应的相关矩阵。
随机向量的(协)方差矩阵如下：
Figure RE-GDA0002850709160000104
式中，
Figure RE-GDA0002850709160000105
和
Figure RE-GDA0002850709160000106
分别代表加性遗传方差和剩余环境方差；H代表合并系谱和基因组亲缘关系矩阵；I代表单位矩阵。
(7)遗传力和交叉验证结果
利用R(V3.6.0)软件中caret包产生随机数。结果见表4。
表4利用整合显著SNP标记的剩余采食量的基因组选择方法使用效果检验结果
Figure RE-GDA0002850709160000107
Figure RE-GDA0002850709160000111
根据以上交叉验证检验结果，与常规不对4个显著SNP设置权重的一步法估计结果相比，新方法使用能使准确性提高至61％，显著SNP构建G矩阵后与常规G矩阵的最优权重比为0.4:0.6。相较基于基因组矩阵进行育种值估计，一步法选择的准确性和本方法的准确性均能提升25％以上。
实施例4利用整合显著SNP标记进行黄羽肉鸡剩余采食量的基因组选择的育种方法
(1)参考群体的建立，表型性状测定和基因型测定
每个品系建立独立的参考群，参考群的来源要求覆盖到品系已有的全部家系。
当参考群鸡饲养接近其商品鸡56日龄上市日龄时，组建1500～2000只鸡的群体作为参考群体。参考群有明确的表型记录和系谱记录，采集血液样本，提取DNA，送测鸡全基因组SNP芯片。确定3-5万个全基因组平均分布的SNP位点的基因型。具体流程可参考CN111225986A。确定参考群每只鸡全基因组约5万个位点的结果，用于下一步GEBV的估计。
(2)待测群体的建立与全基因组基因型采集
待测群是指没有表型性状记录，且准备用于繁育下一代的候选种鸡群。待测群要求与参考群具有5个世代以内的亲缘关系。待测群在不影响鸡成活率和生长发育的前提下，尽早采集血液样本送测鸡全基因组SNP芯片。然后按照上述方法进行全基因组SNP位点基因型检测和质控。
(3)参考群体和候选群体的个体基因组估计育种值(GEBV)分析
利用①参考群体每个个体的表型值(RFI)；②参考群每个个体全基因组5万个位点的基因型；③待测群体每一个个体的全基因组基因型；④参考群和所有待留种个体的系谱记录(包括参考群在内)，共4类文件准备利用本方法进行基因组估计育种值(GEBV)估计。
(4)鸡低RFI品系的选择方法
根据全基因组选择计算得出的待测群体及其存栏同胞的GEBV的大小，在表型缺失的情况下，对候选留种群体的RFI GEBV进行评估和排序，选择RFI的GEBV低的个体作为亲本，一般公鸡选择100～500，母鸡选择1000～2000，留种组建家系；或者加权后与其他性状进行指数选择。
实施例5利用SNP标记等位基因状态辅助进行黄羽肉鸡剩余采食量的分子育种方法
上述与RFI显著相关的4个SNP标记，也可以利用常规方法进行选留，具体过程如下：
1、待选择群体
随机挑选待检测鸡。于35日龄后翅静脉采血，ACD抗凝，-20℃保存备用。
2、DNA提取
采用常规酚仿法提取基因组DNA，溶于TE中，用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法双重检测DNA的纯度和浓度，然后稀释至浓度50ng/μl。
3、PCR反应及序列测定
用于扩增SNP的引物见表5，利用PCR扩增在ABI Life ProFlex PCR仪热循环仪中进行。PCR反应程序为：95℃3min,95℃30s，60℃30s，72℃1min，共35个循环； 72℃5min。PCR反应体系以30μl计为：模板DNA 1.5μl，10pmol/μl上游引物1.5μl， 10pmol/μl下游引物1.5μl，2×Master mix 15μl，ddH2O 10.5μl。
采用直接测序法或其他有效方式对扩增产物进行等位基因检测。根据基因分型结果选留：标记rs317793149所含多态性位点的基因型为GG或AG，和/或标记 rs315554811所含多态性位点的基因型为CC或TC，和/或标记rs16346910所含多态性位点的基因型为TT或TC，和/或标记rs15045976所含多态性位点的基因型为AA或AG的健康公、母鸡。按照不低于80只公鸡，公母比例不低于1:10的数量留种，产蛋高峰期组建新的家系繁种。
表5 SNPs的引物序列
SNP 正向引物(5’-3’) 反向引物(5’-3’) 产物长度(bp)
rs317793149 GCTGCTCGTGGTCTGACTTAT AAACCACATCTTCCCCTGTGG 241
rs315554811 TGCCATAACCTGTGACTACGT AACAGCAGTGTCTGGGTG 227
rs16346910 GAGTTTAGCAGAGGCTCGGG GACCTCAGGACTGTCCCCAT 271
rs15045976 TGGTTGCTGGTGTCAGATCC ACCTGTTGGCCTGAAAAAGC 413
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种提高黄羽肉鸡剩余采食量遗传进展的基因组选择方法
<130> KHP201116329.5
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctgctcgtg gtctgactta t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaccacatc ttcccctgtg g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgccataacc tgtgactacg t 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacagcagtg tctgggtg 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagtttagca gaggctcggg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gacctcagga ctgtccccat 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggttgctgg tgtcagatcc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acctgttggc ctgaaaaagc 20

Claims (4)

1.具有低剩余采食量性状的黄羽肉鸡的鉴定及选育方法，其特征在于，包括：
1）提取待测黄羽肉鸡总DNA；
2）以DNA为模板，利用检测与黄羽肉鸡剩余采食量性状显著相关的SNP标记的引物进行PCR扩增；
3）分析PCR扩增产物；
其中，与黄羽肉鸡剩余采食量性状显著相关的SNP标记为标记rs317793149、rs315554811、rs16346910和rs15045976；
标记rs317793149含有黄羽肉鸡14号染色体上第3,022,607 bp处多态性为A/G的核苷酸序列；
标记rs315554811含有黄羽肉鸡18号染色体上第9,222,833 bp处多态性为T/C的核苷酸序列；
标记rs16346910含有黄羽肉鸡18号染色体上第9,299,938 bp处多态性为T/C的核苷酸序列；
标记rs15045976含有黄羽肉鸡19号染色体上第3,331,267 bp处多态性为A/G的核苷酸序列；
标记rs317793149所含多态性位点的基因型为AA，对应于高剩余采食量水平，若基因型为GG，对应于低剩余采食量水平；若基因型为AG，剩余采食量水平居中；
标记rs315554811所含多态性位点的基因型为CC，对应于低剩余采食量水平，若基因型为TT，对应于高剩余采食量水平，若基因型为CT，剩余采食量水平居中；
标记rs16346910所含多态性位点的基因型为TT，对应于低剩余采食量水平，若基因型为CC，对应于高剩余采食量水平，若基因型为CT，剩余采食量水平居中；
标记rs15045976所含多态性位点的基因型为AA，对应于低剩余采食量水平，若基因型为GG，对应于高剩余采食量水平，若基因型为AG，剩余采食量水平居中；
扩增标记rs317793149的上、下游如SEQ ID NO:1-2所示，扩增标记rs315554811的上、下游如SEQ ID NO:3-4所示，扩增标记rs16346910的上、下游如SEQ ID NO:5-6所示，扩增标记rs15045976的上、下游如SEQ ID NO:7-8所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR反应体系为：模板DNA 1.5 μl，10pmol/μl上、下游引物各1.5 μl，2×Master mix 15 μl，ddH2O 10.5 μl；和/或
PCR反应程序为：95℃ 3 min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 5min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3）包括：对扩增产物进行测序，根据测序结果判定如下：
若标记rs317793149对应的多态性位点的基因型为GG，判定待测黄羽肉鸡具有低剩余采食量水平；
若标记rs315554811对应的多态性位点的基因型为CC，判定待测黄羽肉鸡具有低剩余采食量水平；
若标记rs16346910对应的多态性位点的基因型为TT，判定待测黄羽肉鸡具有低剩余采食量水平；
若标记rs15045976对应的多态性位点的基因型为AA，判定待测黄羽肉鸡具有低剩余采食量水平。
4.与黄羽肉鸡剩余采食量性状显著相关的SNP标记或其检测试剂的以下任一应用：
（1）用于黄羽肉鸡饲料报酬的辅助评价；
（2）用于具有低剩余采食量性状黄羽肉种鸡的早期预测；
（3）用于黄羽肉鸡分子标记辅助育种；
其中，与黄羽肉鸡剩余采食量性状显著相关的SNP标记为标记rs317793149、rs315554811、rs16346910和rs15045976；
标记rs317793149含有黄羽肉鸡14号染色体上第3,022,607 bp处多态性为A/G的核苷酸序列；
标记rs315554811含有黄羽肉鸡18号染色体上第9,222,833 bp处多态性为T/C的核苷酸序列；
标记rs16346910含有黄羽肉鸡18号染色体上第9,299,938 bp处多态性为T/C的核苷酸序列；
标记rs15045976含有黄羽肉鸡19号染色体上第3,331,267 bp处多态性为A/G的核苷酸序列；
标记rs317793149所含多态性位点的基因型为AA，对应于高剩余采食量水平，若基因型为GG，对应于低剩余采食量水平；若基因型为AG，剩余采食量水平居中；
标记rs315554811所含多态性位点的基因型为CC，对应于低剩余采食量水平，若基因型为TT，对应于高剩余采食量水平，若基因型为CT，剩余采食量水平居中；
标记rs16346910所含多态性位点的基因型为TT，对应于低剩余采食量水平，若基因型为CC，对应于高剩余采食量水平，若基因型为CT，剩余采食量水平居中；
标记rs15045976所含多态性位点的基因型为AA，对应于低剩余采食量水平，若基因型为GG，对应于高剩余采食量水平，若基因型为AG，剩余采食量水平居中。
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