CN104004825A

CN104004825A - 一种检测鸡残差采食量性状的分子生物学方法

Info

Publication number: CN104004825A
Application number: CN201310723506.0A
Authority: CN
Inventors: 陈继兰; 孙研研; 刘国芳; 白皓
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2013-12-25
Filing date: 2013-12-25
Publication date: 2014-08-27

Abstract

本发明涉及一种检测鸡残差采食量性状的分子生物学方法。该方法是检测鸡GHSR基因completecds序列自5’端起第671位碱基为A还是G。本发明为鸡生产效率改良提供了一个高效准确，方便易行的分子遗传标记（单核苷酸多态性标记），可用于以提高肉鸡尤其是黄羽肉鸡生产效率为目标的分子育种工作。本发明的检测方法具有早期筛选、节省时间、节约成本、准确性高等优点，可以加快育种进程，为提高肉鸡生产效率和肉鸡养殖业的生产效益奠定技术基础。

Description

一种检测鸡残差采食量性状的分子生物学方法

技术领域

本发明属于农业养殖动物分子标记辅助育种技术领域。具体涉及检测鸡残差采食量性状的方法，特别是涉及一种利用鸡GHSR基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）检测鸡残差采食量性状的方法。

背景技术

肉质细嫩鲜美的中国地方鸡种在国内外拥有广阔的市场。近年来，随着人们生活水平的提高，消费观念的转变，地方鸡销售表现出良好的趋势，成为我国养鸡业中独具特色的一个产业。在养殖业生产的竞争激烈中，想获得经济效益，就必须提高生产效率，以降低成本。然而我国地方鸡品种与白羽肉鸡相比仍存在生产效率低的缺点。通过现代育种技术提高地方鸡的生产效率是增强地方鸡市场竞争力和增加企业生产效益的重要基础。残差采食量为动物实际进食的量与维持需要和生产产品需要的差值。饲料成本占到养殖业成本的60-70%，因此残差采食量常作为衡量农业动物生产效率和养殖业经济收益的重要指标。但是在生产和育种研究过程中测定残差采食量性状难度大、成本高。残差采食量为中等遗传力性状，说明该性状的变异均具有一定的遗传基础。从分子生物学的角度去研究残差采食量的候选基因和相关分子标记，通过基因型进行选择，可以提高选择准确度并加快育种进程。

生长激素促分泌素（Ghrelin）是一种内源性多肽，最初在1999年由Kojima等在大鼠胃组织中发现。Ghrelin可刺激生长激素的分泌，并促进肾上腺分泌激素、催乳素、皮质醇及肾上腺素的释放，对能量平衡起调节作用，并促进进食。Ghrelin基因的生理作用的调节主要是由其受体基因（Ghrelin receptor，GHSR）介导。在畜禽研究中，Jin等研究指出GHSR基因一个突变位点与山羊体长指数显著相关（Jin et al., 2010）；Zhang等研究发现GHSR基因完全连锁的2个SNP与南阳牛的体重和平均日增重显著相关（Zhang et al., 2009）；GHSR1a基因的SNP与欧洲肉牛的生长和胴体性状相关（Masanori et al., 2010）。Fang等发现隐性白来航和杏花鸡的GHSR基因内含子1上的一个突变位点与生长和胴体性状相关（Fang et al., 2009）。同时，GHSR基因SNP与脂肪沉积性状也具有一定的相关性：Nie等对8个鸡群和9个鸭群研究指出GHSR基因突变与鸡和鸭的脂肪沉积相关（Nie et al., 2009）；GHSR基因的缺失突变与白洛克鸡和杏花鸡的杂交二代脂肪性状有显著相关（Lei et al., 2007）。上述结果表明：GHSR基因可作为候选基因，研究其变异与肉鸡群体残差采食量性状变异的相关性，为标记辅助育种提供参考依据。

单核苷酸多态性是指基因组水平上单个核苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性。SNP在基因组中广泛存在。通过对目标基因靶序列进行PCR扩增，之后对扩增产物进行DNA测序是检测SNP的一个常用技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用鸡生长激素促分泌素受体基因（Ghrelin receptor，GHSR）的SNP检测鸡残差采食量的方法。

本发明所提供的检测鸡残差采食量的方法，是检测待测鸡的GHSR基因complete cds序列自5’端起第671位碱基为A还是G。

如果待测鸡的GHSR基因complete cds序列自5’端起第671位碱基为A时，其纯合体的基因型为AA；如果鸡的GHSR基因complete cds序列自5’端起第671位碱基为G时，其纯合体的基因型为GG；它们的杂合体基因型为AG。

上述基因型中，GG基因型鸡的饲残差采食量比AA和AG基因型鸡分别低39.13g和27.75g，且差异达到极显著水平（P < 0.01）。而其他肉鸡重要经济性状，包括肉质性状（如胸肌肌内脂肪含量等）及胴体性状（如胸肌率、腿肌率等）在不同的基因型间没有显著差异（P > 0.05）。

所述检测方法为PCR法和DNA测序。

其中，PCR扩增待测鸡的包含GHSR基因complete cds 序列自5’端起第671位碱基的核苷酸序列所用的引物可为序列表中的SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。

所述检测方法中的PCR反应体系可为：鸡基因组DNA 0.6μL（50 ng/μL），2×Taq PCR Master Mix 5μL，上下游引物各0.3μL（10 pmol/μL），加去离子水至10μL。所述PCR反应条件为：先94℃预变性3min；然后94℃变性30s，59.1℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；最后72℃延伸7 min。

本发明提供了一种利用鸡GHSR基因的单核苷酸多态性标记检测鸡残差采食量性状的方法。试验证明可以利用GHSR基因complete cds序列自5’端起第671位碱基的多态性，并根据基因型对鸡的残差采食量性状进行选择，删除不利等位基因（A）。用本发明的方法对鸡的残差采食量进行选择，能够提高肉鸡的生产效率，并且具有早期筛选、节省时间、操作简单、节约成本、准确性高等优点。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1 为 1%琼脂糖凝胶电泳检测鸡基因组DNA结果。

图2 为1%琼脂糖凝胶电泳检测使用序列表中的SEQ ID No.2和SEQ ID No.3进行PCR扩增鸡的包含GHSR基因complete cds序列自5’端起第671位碱基的核苷酸序列的结果。

图3 为对包含鸡GHSR基因的扩增产物多态位点（complete cds序列自5’端起第671位碱基）杂合子个体（基因型为AG）测序结果，图中方框部分表示发生碱基替代的位置。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未经特别说明的方法均参照 [美] J. 萨姆布鲁克和D. W. 拉塞尔（J. 萨姆布鲁克和D. W. 拉塞尔著，黄培堂等译。分子克隆实验指南（第三版），北京：科学出版社，2002年）。

实施例1：鸡GHSR基因多态位点的获得

1、PCR扩增

选取297只北京油鸡公鸡为实验材料，17周龄时对每个个体进行翅下静脉采血1mL，用ACD抗凝，血样于-20℃冷冻保存。采用酚-氯仿抽提法从上述的鸡血液中提取基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果发现DNA条带清晰、明亮、无杂带（图1），可以用于后续的PCR扩增试验。

从GenBank上获取红色原鸡GHSR基因的complete cds序列（Gene ID：AB095994.1），针对该基因的外显子1设计引物, 序列如下：F(正向引物)：5’-TGAGGACCACCACCAACT-3’（序列表中SEQ ID No.2），R(反向引物)：5’-:AGCACCGTGAGGCAGAAT-3’（序列表中SEQ ID No.3）

用上述引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系（10 μL）如下：鸡基因组DNA 0.6μL（50 ng/μL），2×Taq PCR MasterMix 5 μL，上下游引物各0.3 μL（10 pmol/μL），加去离子水至10 μL。PCR反应条件如下：先94℃预变性3 min；然后94℃变性30s，59.1℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；最后72℃延伸7 min。PCR扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图2所示。

2、DNA测序分析

将上述扩增产物送至北京天一辉远生物科技有限公司进行测序，采用DNAStar对所测序列进行分析，确定SNP位点。297只北京油鸡GHSR基因扩增片段多态性位点的基因分型采用sequnome进行质谱SNP分型，在北京毅新兴业科技有限公司进行。结果发现6个单核苷酸突变位点，分别为自鸡GHSR基因complete cds 序列5’端起938位的G/A碱基突变；自鸡GHSR基因complete cds 序列5’端起893位的C/T碱基突变；自鸡GHSR基因complete cds 序列5’端起842位的C/T碱基突变；自鸡GHSR基因complete cds 序列5’端起824位的C/T碱基突变；自鸡GHSR基因complete cds 序列5’端起764位的C/T碱基突变；自鸡GHSR基因complete cds 序列5’端起671位的A/G碱基突变。其中自鸡GHSR基因complete cds序列5’端起671位的A/G碱基突变为本发明所涉及的分子标记（图3）。

结果显示，在所检测的297只北京油鸡中，AA基因型个体有158个，GG基因型个体有25个，AG基因型个体有114个（表1）。在北京油鸡中A等位基因的基因频率为0.72，G等位基因的基因频率为0.28。卡方适合性检验分析结果表明在该北京油鸡群体中的基因型分布情况处于平衡状态（P > 0.05）。所得结果真实可信。

实施例2：GHSR基因A671G单突变位点与黄羽肉鸡的残差采食量性状及其他重要经济性状的相关性分析

为确定鸡GHSR基因complete cds序列自5’端起671位碱基（A671G）的G/A多态性与肉鸡重要表型性状差异是否相关，以297至北京油鸡为试验材料，在9-17周龄饲养期间：9周龄时空腹称重，记录每个个体总采食量；17周龄将个体屠宰，称量屠体重、全净膛重、腿肌重、胸肌重、腹脂重、胸、腿肌肌内脂肪含量；计算平均日采食量、平均日增重、残差采食量、胸肌率、腿肌率、腹脂率等重要性状。

采用SAS8.0 GLM程序分析了鸡GHSR基因A671G位点不同基因型与生产效率、胴体性状间的相关关系。分析构建模型如下：

Y_ij=μ+ L_i +G_j + e_ij

其中，Y_ij为个体单个待分析性状；μ为待分析性状的群体均值；L_i为第i个品系效应（i =1、2、3）；G_j为基因型效应（j代表基因型）；e_ij为随机残差效应。

不同基因型与各性状间的关联分析结果如表1所示，A671G位点与鸡残差采食量以及平均日采食量性状的相关性达到显著水平（GG基因型个体的残差采食量以及平均日采食量显著低于AA基因型个体（P < 0.01）。而在其他重要经济性状包括胴体性状和脂肪性状上，不同基因型间不存在显著差异（P > 0.05）。因此GG基因型是高生产效率，即低采食量和低残差采食量的优势基因型。

表1 鸡GHSR基因G671A位点基因型与生产效率、胴体性状的相关性分析

注：1. 以上数值为最小二乘均值±标准误；2. 3种基因型间相同字母表示差异不显著（P > 0.05），不同字母表示差异显著（P < 0.01）。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种检测鸡残差采食量性状的分子生物学方法

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 919

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(4121)

<220>

<221> misc_feature

<222> (671)..(671)

<223> n=a或g

<400> 1

aagaacgcac gccatcgccc tttcaccgcc tcgacggcgg caagcggaaa gcaagctcgt 60

ggggacggag ctcagcgggc agccccgcac cgcggccggg gggtgggggc gtgcggggac 120

cgcccggccc cggaggagac gtcccgcgag agggagcaga gggagaggac gagcggagcg 180

cacacgtcgg actaaactcg ccgcagagcg cggggccgct ccgcgcccgc ggaggcagcg 240

cttacgcccg ccgtgacgcg cggagggacc ggcccccggc cgggagggga ggggggggcg 300

gagcggggcc gcgtccctcc ccgcctcccg cacctgcccc agccccggca cggagcggct 360

ccgcgcgggg atgcgcagcc cgcggcggca cgatgcggga ggggagctcg gagaacagga 420

cgggcggcga gtccccgctg cgcctcttcc ccgcgcccgt gctcaccggc atcaccgtcg 480

cctgcgtcct cctcttcgtc gtcggggtcc tcggcaacct gatgaccatg ctggtggtgt 540

cgcggttccg ggacatgagg accaccacca acttctacct gtccagcatg gccttctccg 600

acctgctcat cttcctctgc atgcccctgg acctcttccg cctttggcag taccggccct 660

ggaacttcgg agatctcctc tgcaagctct tccagttcat cagcgagagc tgcacctact 720

ccaccatcct caacatcacc gcgctcagcg tggagcggta cgtcgccatc tgcttccctc 780

tgcgagcgaa ggtgatcatc accaagagga aggtcaagct ggtcatcctc atcctctggg 840

ccgtctcctt cattagtgct ggccccatct tcgtcctggt gggcgtcgag catgagaatg 900

gcaccaaccc actgagcacc aacgagtgcc gtgccacgga gtacgccatc cgctcggggc 960

tgctcaccat catggtgtgg atctccagca tcttcttttt cctgcccgta ttctgcctca 1020

cggtgctgta cagcctcatc gggaggaagc tgtggaggag gaagaggaag aacatcggtc 1080

cgagcaccat tatcagggac aagaacaaca agcagactgt gaagatgcta ggtatggctc 1140

cccgggctct gtgtttgcaa gtgcgtgtgc ttgtgtgtgc aagagagggg ggctgagcag 1200

tgccagatca ctgtcgttgc ttctaaagga aagcattgtt ttaaaacctt tcctacaaag 1260

ggctccactt taaggtattt gcagaacaac tctccccttt ccttagattt atttctaacc 1320

ggttggtgct ggggactcta aaacagttaa ggagatttta ataacaacct ctgacgaaga 1380

cgaataccac cgttacaatt agctcttgcc ctggagattt ttagaacatc tttggctgtg 1440

gataccgaca ttatttacag agaacagttt atctgatttt caaactaacc tcttctaaac 1500

ccacaaagtt agctgcagac taagcaagca gggtgtgatg tgcactgact ttcaaatgaa 1560

aaggcatttt tagcaaattg gggtaattta gccagcgtga ctgtttaaga tcatggaaag 1620

tgatcttatt ctctgcatta gcaaagcatc agcctttgct gaacagtgac cattttgtct 1680

ccctcagggt ctataatccc ctaaattccc accgacttca gggtaacagg atggagacga 1740

cagacgctgt cagtcctgac agtgtattta cacagccgca tggtttaaac aacagacact 1800

gctggcacac agaagagcac gttcagcaca gggatgctgg cagctcctga caagcgtgtg 1860

ccaggagctg gctgcacagg acccaaagtt gctgcacaga tccatgcctg gtcactgagc 1920

accgctgcat gcttttgcac tgacagatcc cagcatgagc tcccatggat gggatgcttc 1980

acacaggtgt cacggcaagg cagaggtgaa gggctaatga gccagatgga gaggtggcag 2040

tgcaccctaa ggggcttcat tactgtatag gagcctacct gatcttttgt gagtgccctg 2100

ctttagtact actaccacca agcagcaaga attatacaac ctgaggcatt ctttgagcca 2160

tttcagccac gttttacagt cagtagaatt agttcaggtg ggtaaagtgt gaccttggaa 2220

gtaattcttc actcacactg ctagagcttc aggattatgg atctctattt acaagaagta 2280

aattgccagc acgtactact gccatgttta tctatctgca tgtttaaccg taaggaattt 2340

caaaacagta agtgcttatt tctgccccca agtattgctg ccagcactat ggtatttcag 2400

acaccttttc ttcttctgca agggctggga acagcatggc aggagtgagc ccttcctctg 2460

gcaaagccag cattctgcag atgaaaacag cccagtgctg ggcagaaagg aaagaagtga 2520

gtaagggctc aatagcagca gatgcacaat gcaatctgct cccactgctt ttacttttct 2580

gcctgaaatc tagaaggcgc ttcctaagac ttcagcaagt catggaacat tgattaaatg 2640

ggattagcat cgcttctttt aaactgtaga aagattgtat gcctctagga tagtaattaa 2700

acacccgaac acatagcctg actgtgaaag gagctatcat aacccattcc tcttgaaatc 2760

aatgggattc tgcatgagtg aggatcaaac tgcatcctca aaaccccagt taggagggat 2820

acgcacgctt acctgtaaac acattggctg tgctcgatac tctgtgtatg atgaccgcag 2880

tggtagtaat caacatatgg attaaactcc agagcacgct cttgagccat ggaaacttta 2940

tctgaatttc ccaggtggaa aaactgcaaa aagatatcaa agtgttgggc tcaggaagat 3000

gcagagcagg aaaacagata ctctgaattt cagctgtgtg ctgcagagta cgccataagt 3060

tgcatgtggc tttcctgttc ttggagtaat catgtgccaa tgcacgggca gacaggcagg 3120

gtgcaacgct gcctgttgtt accctgctgg atgtacccta cagatccagg tggtggttct 3180

tattgtcttt tggcctttgt cttgagccag tttgcttccc agggattaaa tacctcacta 3240

taaagcacag cgttgagtct atcacgttat atataatttg cttttgtagg tgcagacggt 3300

agattatgtt atgatttctg tcactgttct ttaattcggt tcttttatgg aaatgatgac 3360

ttgatagctc aggtgtgtgc tgtgcagtat ataggcaggc tgcccaggta caatcaattt 3420

aagtattgct aatctatcct gccagaaaac gtacctgaga gagacctgaa aagttatggg 3480

gtgccttttc ccacttggag atacattggt tgaaaagaga gaatgctatt tcatctgaat 3540

caaccttttt ttttttctcc ctactcacag ttaacacact ttcttctgct gttttttgtt 3600

ttagtcgtgg tggtatttgc tttcatactc tgctggttgc cttttcacgt aggacgatat 3660

ttattttcca aatccttcga agccggatcc ttggagatag cagtgatcag ccagtactgc 3720

aacttggtgt cctttgtcct cttctacctg agcgcagcca tcaaccccat cctctacaac 3780

atcatgtcca agaagtaccg cgttgccgca tgccggctct tcggactcaa agccctgcca 3840

aagaaaagac tctccagcac caagcaggac agctcacgtg tatggacaga acccaccgtc 3900

gccacatgac acggggtcca gtgccagagc atcacacacc ggtgttaccg gagagccatc 3960

acggagggga cgtggggcaa ggcacaaatc ggcaaggaaa gctctacttg tgtcgtcacc 4020

tggatttgct gggagatgtc acgtaggcag tgaaagatct ctaaaaatta cctacacctt 4080

gagaatataa aaggagacgt gtggttacag catttggcaa c 4121

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus)

<220>

<221> 上游引物

<222> (1)..(18)

<400> 2

tgaggaccac caccaact 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus)

<220>

<221> 下游引物

<222> (1)..(18)

<400> 3 18

agcaccgtga ggcagaat

Claims

1. 一种检测鸡残差采食量性状的分子生物学方法，是检测鸡GHSR基因complete cds 序列（序列表中的SEQ ID No.1）自5’端起第671位碱基为A还是G。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鸡的GHSR基因complete cds序列自5’端起第671位碱基为A时，其纯合体的基因型为AA；所述鸡的GHSR基因complete cds序列自5’端起第671位碱基为G时，其纯合体的基因型为GG；它们的杂合体基因型为AG；所述GG基因型鸡的残差采食量低于AA和AG基因型鸡，残差采食量比AA和AG基因型鸡分别低39.13g和27.75g；GG基因型是高生产效率（低采食量和低残差采食量）的优势基因型。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测方法为PCR法和DNA测序。

4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增待测鸡的包含GHSR基因complete cds序列自5’端起第671位碱基的核苷酸序列所用的引物对为序列表中的SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。

5. 根据权利要求3或者4所述的方法，其特征在于：所述PCR反应体系为：鸡基因组DNA 0.6 μL（50 ng/μL），2×Taq PCR Master Mix 5μL，上下游引物各0.3 μL（10 pmol/μL），加去离子水至10 μL。

6. 根据权利要求3或者4所述的方法，其特征在于：所述PCR反应条件为：先94℃预变性3min；然后94℃变性30s，59.1℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环; 最后72℃延伸7 min。