CN105063021A - 与猪脂肪沉积相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与猪脂肪沉积相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于猪FNDC5基因5’侧翼区起始密码子上游第931bp处，记为A-931G。本发明将FNDC5基因作为影响猪脂肪沉积性状的候选基因，采用PCR测序技术获得不同类型猪群体间差异的SNP位点，建立了快速检测方法，在品种间和品种内鉴定SNP位点与猪脂肪沉积能力的相关性，获得了影响猪脂肪沉积性状的SNP位点及基因型。

Description

与猪脂肪沉积相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种基因型检测方法，具体的，涉及一种与猪脂肪沉积相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

脂肪是动物肌体的主要成分之一，是维持正常生命活动所必须的物质，也是影响猪胴体品质和肉质风味的重要因素。中国地方猪种多为高脂肪，称为脂肪型猪；引入猪种的瘦肉率高，称为瘦肉型猪。猪种胴体脂肪组成的遗传差异涉及基因繁多，基因调控复杂，一直是遗传育种领域研究的难题之一。人体内脂肪组织过多沉积带来的2型糖尿病、肥胖症、脂肪性肝病、高血压、血脂紊乱、动脉粥样硬化等代谢性疾病正威胁着人类的健康。因此，脂肪代谢调控已成为人类医学的研究新热点。

脂肪代谢包括脂肪合成代谢和脂肪分解代谢，二者的平衡决定脂肪沉积。目前在猪脂肪沉积和肉质性状的遗传机制方面，能够明确的主效基因有氟烷基因(Hal)和酸肉基因(RN)。人们采用候选基因法筛查了一些与猪胴体性状相关的脂肪代谢过程中的酶基因、激素及受体基因、细胞因子和结合蛋白基因等，但随着效应显著性检测的基因型和QTLs的增多，主效基因的实际鉴别、调控途径及其应用愈显复杂，实质性进展甚微。但目前，在猪分子育种实践中仍然缺少功能明确、效应显著的主效基因和分子标记。

近年来发现的一种肌肉因子Ⅲ型纤连蛋白结构域5(FNDC5)具有诱导白色脂肪组织向类褐色脂肪发育的功能，增加能量消耗，改善肥胖和胰岛素抗性，是影响脂肪沉积的重要候选基因。目前，对FNDC5基因的研究仅见人和小鼠，发现其对细胞分化、能量代谢等方面具有重要的调节作用，可以降低高脂日粮小鼠的肥胖。

因此有必要对FNDC5进行深入的研究，获得不同类型猪群体间FNDC5基因差异的SNP位点，为进一步研究和了解猪脂肪沉积性状提供帮助。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与猪脂肪沉积相关的SNP分子标记及其应用。

本发明的另一目的在于提供检测所述SNP分子标记的引物和试剂盒。

本发明的第三个目的在于提供鉴定猪脂肪沉积性状的方法。

本发明通过对不同类型猪群体基因型进行研究，提供了一种与猪脂肪沉积相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于猪FNDC5基因5’侧翼区起始密码子上游第931bp处，记为A-931G。

本发明提供了上述SNP分子标记在鉴定猪脂肪沉积基因型中的应用。

其中，当猪FNDC5基因5’侧翼区起始密码子上游第931bp处为GG基因型时，表明个体具有高脂肪沉积性状；为AG型时具有中等脂肪沉积性状；为AA型时具有低脂肪沉积性状。

进一步的，提供了所述SNP分子标记在猪育种中的应用。

本发明提供了用于检测本发明所述SNP分子标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列为：

正向引物F：5'-ACCTGACCTCCAGCTCTCAAAG-3'

反向引物R：5'-GCAGTGATGGGGATGATGG-3'。

本发明还提供了含有上述引物对的试剂盒。

本发明提供了一种检测所述SNP分子标记的方法，所述方法包括：以猪基因组DNA为模板利用本发明所述的引物对进行PCR扩增获得PCR产物；对所述PCR产物进行测序。

其中，PCR反应体系为：2×PCRMix用量为PCR扩增反应体系体积的一半即10μl，100ng待检测猪基因组DNA，10μmol/L正向、反向引物量各0.5μl，最后用ddH₂O补充至20μl。

PCR反应条件为：94-95℃预变性5min；进行如下循环36个：94-95℃预变性30s,60℃退火30s，72℃延伸40s；72℃延伸7min,即得到PCR产物。

本发明提供了一种鉴定猪脂肪沉积性状的方法，包括以下步骤：

步骤一：以猪基因组DNA为模板利用权利要求5所述的引物对进行PCR扩增获得PCR产物；

步骤二：对PCR产物进行测序，当所述PCR产物606bp处为GG基因型时，为高脂肪沉积性状；为AG基因型时为中等脂肪沉积性状；为AA基因型时为低脂肪沉积性状。

其中，PCR反应体系为：2×PCRMix用量为PCR扩增反应体系体积的一半即10μl，100ng待检测猪基因组DNA，10μmol/L正向、反向引物量各0.5μl，最后用ddH2O补充至20μl。

PCR反应条件为：94-95℃预变性5min；进行如下循环36个：94-95℃预变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s；72℃延伸7min,即得到PCR产物。

所述PCR产物具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，所述PCR产物的606bp处为猪FNDC5基因5’侧翼区起始密码子上游第931bp处。

本发明将FNDC5基因作为影响猪脂肪沉积性状的候选基因，采用PCR测序技术获得不同类型猪群体间差异的SNP位点，建立了快速检测方法，在品种间和品种内鉴定SNP位点与猪脂肪沉积能力的相关性，获得了影响猪脂肪沉积性状的SNP位点及基因型。

附图说明

图1为猪FNDC5基因5’侧翼区A-931G位点的测序峰图。

图2为猪FNDC5基因5’侧翼区A-931G位点扩增结果；琼脂糖胶浓度为1.2％；图中Marker为DM2000；图中各泳道片段大小均为732bp。

图3为猪FNDC5基因A-931G位点个体测序图。图中A为AA型，B为AG型，C为GG型。

具体实施方式

下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本分发明进行各种修改和替换。

以下实施例中：

若未特别指明，实施例中所使用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

试剂：PCRMix购自北京京汇欣公司；引物由北京六合华大公司合成。

实施例1

选择中国地方品种“滇南小耳猪”(采自云南省西双版纳州滇南小耳猪资源保护场)和引进品种“大约克猪”(采自安徽科鑫养猪育种有限公司)的耳组织样，采用苯酚/氯仿法提取组织基因组DNA。

设计以下引物(如序列表SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示)：

正向引物F：5'-ACCTGACCTCCAGCTCTCAAAG-3'

反向引物R：5'-GCAGTGATGGGGATGATGG-3'

用上述引物在滇南小耳猪、大约克基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增使用20μl反应体系：2×PCRMix用量为PCR扩增反应体系体积的一半即10μl，100ng所述待检测猪基因组DNA，10μmol/L正向、反向引物量各0.5μl，最后用ddH₂O补充至20μl，混匀，即得PCR扩增反应体系。将PCR扩增反应体系在94-95℃预变性5min；进行如下循环36个：94-95℃预变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s；72℃延伸7min,即得到PCR产物。

对上述4个猪种的PCR产物经GelExtractionKit试剂盒(购自上海生物工程技术有限公司，按照试剂盒说明书操作)纯化。每个猪种分别选10个个体进行PCR扩增，每个个体的PCR产物各取10μL，混池成一个样本进行测序(华大基因)。扩增产物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。

两个猪种的测序结果经ChromasPro软件比对，在如序列表SEQIDNO.1所示的序列中第606bp处存在一个A碱基到G碱基的突变(见图1)，该位点位于FNDC5基因5’侧翼区起始密码子上游第931bp处，记为A-931G。

实施例2

猪FNDC5基因A-931G位点基因型检测测序方法建立。

为了快速方便的检测猪FNDC5基因A-931G位点基因型，用实施例1中的引物序列对猪的基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为20μl体系：2×PCRMix用量为PCR扩增反应体系体积的一半即10μl，100ng所述待检测猪基因组DNA，10μmol/L正向、反向引物量各0.5μl，最后用ddH₂O补充至20μl，混匀，即得PCR扩增反应体系。将PCR扩增反应体系在94-95℃预变性5min；进行如下循环36个：94-95℃预变性30s,60℃退火30s，72℃延伸40s；72℃延伸7min,即得到PCR产物。

PCR扩增产物用浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中观察PCR扩增效果，可见到片段大小为732bp的清晰条带(见图2，图2中泳道1、2为藏猪，3、4为滇南，5、6为大约克，7、8为长白猪。)。对PCR产物进行测序，通过测序峰图来判断基因型(见图3)。

实施例3

本发明的SNP位点在不同猪群中的基因型分布检测。

采集藏猪(西藏林芝工布江达县)、滇南小耳猪(云南西双版纳)、大约克猪(安徽科鑫养猪育种有限公司)和长白猪(北京中顺景盛养殖有限公司)耳组织样品，采用苯酚/氯仿法提取猪个体基因组DNA样品。

采用扩增PCR产物测序技术，测定四个品种个体FNDC5基因A-931G位点的基因型，检测结果如表1所示。

表1猪FNDC5基因A-931G位点基因型分布

藏猪和滇南小耳猪均属生长速度慢的中国地方猪品种，脂肪沉积能力强于引进品种猪，属于脂肪型猪。表1中可见中国地方猪种FNDC5基因A-931G位点GG的基因型频率明显高于大约克和长白猪，优势基因型为GG，优势等位基因为G。而脂肪沉积较慢的猪种(大约克、长白)在该位点的优势基因型均为AA，优势等位基因为A。由此初步判断5’侧翼区A-931G位点GG型为脂肪沉积能力强的基因型，AA型为脂肪沉积慢的基因型。结果表明该基因位点的基因型和等位基因分布在不同脂肪沉积能力的猪群间差异明显，与脂肪沉积性状相关。

表1中，χ²和P为基因型在群体内哈迪-温伯格平衡检验的卡方值和显著性水平，P值均大于0.05，结果说明个基因位点的基因型在各品种群体中分布均符合哈迪-温伯格平衡。

实施例4

淮猪新品系群体中FNDC5基因型与猪背膘厚相关分析。

淮猪新品系是由中国地方品种淮猪和引进的长白和大约克为亲本，进行杂交育种和世代选育而成，其脂肪沉积能力处于淮猪和引进品种(长白和大约克)之间。采集100头淮猪新品系(采自安徽科鑫养猪育种有限公司，为该新品系的1世代群体)耳组织样品，所有个体在测定90kg体重日龄时，同时测定90kg体重活体背膘厚。采用B超扫描测定倒数第3～4肋间处的背膘厚，以毫米为单位。用校正背膘厚的公式(式1)对其进行校正，得到校正后的背膘厚。

(式1)：

达90kg体重背膘＝实测背膘厚×[A÷{A+[B×(实测体重–90)]}]

其中A和B值：

公猪A＝12.402,B＝0.106530；

母猪A＝13.706，B＝0.119624。

采用线性模型(式2)，应用SAS(9.0)软件对淮猪新品系群体中FNDC5基因5’侧翼区A-931G位点的基因型与背膘厚进行相关性分析。

y＝μ+G+bW+e………………………..(式2)

y为背膘厚，μ为均值，G为基因型效应，W为体重协变量，b为回归系数，e为残留效应。

表2淮猪新品系1世代脂肪沉积性状指标

基因型	个数	基因型频率	90kg的背膘厚(mm)
				AA	36	0.36	12.06±0.43a
AG	35	0.35	12.99±0.13a
				GG	29	0.29	13.35±0.57b

采用实施例2中建立的PCR产物个体测序法判定100头淮猪新品系的FNDC5基因A-931G位点的基因型，结果见表2。淮猪新品系群体中该位点出现的3种基因型中AA型频率36％，AG型频率35％，GG型频率为29％。对淮猪新品系群体中该位点的基因型与背膘厚进行的相关性分析结果显示，GG型猪的背膘最厚，AG型次之，AA型最薄，且GG型的背膘厚比AA型个体高1.29mm，差异达显著水平。可见等位基因G是脂肪沉积快的分子标记，可以用于猪分子标记辅助育种。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种与猪脂肪沉积相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记位于猪FNDC5基因5’侧翼区起始密码子上游第931bp处，记为A-931G。

2.权利要求1所述的SNP分子标记在鉴定猪脂肪沉积基因型中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，当猪FNDC5基因5’侧翼区起始密码子上游第931bp处为GG基因型时，表明个体具有高脂肪沉积性状；为AG型时具有中等脂肪沉积性状；为AA型时具有低脂肪沉积性状。

4.权利要求1所述SNP分子标记在猪育种中的应用。

5.用于检测权利要求1所述SNP分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列为：

正向引物F：5'-ACCTGACCTCCAGCTCTCAAAG-3'

反向引物R：5'-GCAGTGATGGGGATGATGG-3'。

6.含有权利要求5所述引物对的试剂盒。

7.一种检测权利要求1所述的SNP分子标记的方法，其特征在于，所述方法包括：以猪基因组DNA为模板利用权利要求5所述的引物对进行PCR扩增获得PCR产物；对所述PCR产物进行测序。

8.一种鉴定猪脂肪沉积性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：以猪基因组DNA为模板利用权利要求5所述的引物对进行PCR扩增获得PCR产物；

步骤二：对PCR产物进行测序，当所述PCR产物606bp处为GG基因型时，为高脂肪沉积性状；为AG基因型时为中等脂肪沉积性状；为AA基因型时为低脂肪沉积性状。