CN103911375A - 与肉牛肉质性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

与肉牛肉质性状相关的分子标记及其应用。本发明提供一种动物分子标记，具体涉及牛DNMT3a基因片段的克隆及作为分子标记的应用。所述的分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，在第278位有1个A278-G278碱基突变，导致肉质性状出现多态性。

Description

与肉牛肉质性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及动物分子标记领域，具体地说，涉及一种与肉牛肉质性状相关的DNMT3a基因作为分子标记的应用。

背景技术

肉牛业作为我国畜牧业的重要组成部分，近年来发展迅速，对于促进生态农业的发展及国民膳食结构的改善等方面发挥了积极作用。肉牛的肉质性状是重要的经济性状，随着人们生活水平的提高，对肉质的要求越来越高，对优质牛肉的需求也越来越大，因此优质牛肉带来的可观经济效益决定了肉牛育种中肉质性状选择的重要性。肉质性状作为一种重要的经济性状，由于无法活体测定受到传统育种方法的限制，因此许多研究从分子标记入手对肉质性状进行探索。根据发达国家经济发展的一般规律，当国民经济收入达到人均1000美元的水平时，牛肉消费将趋于旺盛。随着我国人均国民收入的稳步提升，牛肉消费已经在我国大城市呈风靡之势，国产高档牛肉消费市场也不断升温，并进入到五星级餐饮企业。

表观遗传学(Epigenetics)的概念最初由著名生物学家ConradH.Waddington在1942年提出。表观遗传是指DNA序列不发生变化的情况下，基因表达在细胞增殖和发育过程中发生了能稳定传递的可遗传的改变。传统育种中的表型可以剖分为遗传和环境两部分，说明表型是由基因和环境共同控制的，而表观遗传正如在基因和环境之间搭了一座桥梁，补充了“中心法则”的内容，说明核酸并不是存储遗传信息的唯一载体，表观遗传信息可通过调控基因的表达时间、空间位置和表达方式等方面影响生物机体的各种生理反应。因此，许多用DNA序列变异不能解释的现象可能通过表观遗传学的研究找到答案。

目前，表观遗传学已经成为生命科学研究的前沿和热点，其研究涉及到了多个领域，在疾病和肿瘤方面，通过表观遗传学研究其致病机理等有了更为成熟的认识。随着研究的进一步深入，发现表观遗传学在其他方面，比如环境因子中的营养状况，年龄及生长性能等都有一定的影响。但研究主要是表观相关基因的表达量的变化引起的相关基因的表观的改变，而对于表观遗传学相关基因本身的多态性研究还不多见。肉质性状作为一种重要的经济性状，从遗传学水平上对肉质性状的研究已经有很多了，控制肉质性状的主效基因也研究地比较清楚，然而从表观遗传的水平上研究肉质的报道还非常少。肉质性状是受遗传、营养、屠宰后处理等多因素共同控制的，尤其是在营养方面，可以通过改变一些饲料成分调节，比如说饲料中添加叶酸，可以影响甲基化的程度，从而调控主效基因的表达；在牛育肥的过程中，通过增加能量饲料，可能会影响到基因表达的变化，从而对肉质产生一定的影响，因此肉牛肉质性状很有可能受表观遗传的调控。

DNA甲基化是表观遗传调控中最重要的形式之一。本发明选择一个在催化DNA甲基化过程中起重要作用的基因—DNA甲基化转移酶3a（DNMT3a）作为对象，牛DNMT3a基因定位在11号染色体上（NCBI序列登陆号AC_000168.1），DNMT3a基因大约有40kb长，包含20个外显子，19内含子，编码909个氨基酸。针对该基因的SNP位点，在13个肉牛群体（西门塔尔、蒙贝利亚、挪威红牛、安格斯牛、夏洛莱牛、利木赞牛、和牛、复州牛、鲁西牛、渤海黑牛、新疆褐牛、三河牛以及和牛与复州牛杂交一代商品名雪龙黑牛）中进行多态性分析，同时，利用收集到的肉质性状记录进行SNP关联分析，探索表观遗传学相关基因与肉质性状的关系，以期利用遗传学手段对肉牛肉质性状的不断改良与提高提供准确的科学方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与肉牛肉质性状相关的分子标记及其应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种与肉牛肉质性状相关的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，在第278位有1个A278-G278碱基突变，导致肉质性状出现多态性；

所述肉质性状为排酸前/后胴体重、牛腩厚、三角牛腩厚以及上脑盖厚。

进一步地，所述碱基突变的位点为Intron11-A27G位点，位于DNMT3a基因第11内含子第27bp处。

本发明还提供了一种前述分子标记的制备方法，其是以牛基因组DNA为模板，设计引物，进行PCR扩增，目的在于扩增包含Intron11-A27G位点的DNA序列。

本发明还提供了用于扩增前述分子标记的引物对，其核苷酸序列如下：

正向引物：5’-agcactggattgaggtcctg-3’；

反向引物：5’-gccaagtctgtcctttgagg-3’。

本发明还提供了前述分子标记在肉牛标记辅助选择中的应用。

进一步地，所述应用具体为利用前述分子标记对肉牛进行基因分型，选择基因型为AA的肉牛进行育种。作为优选，所述肉牛为雪龙黑牛。

本领域的技术人员都清楚，有很多分析方法可用于检测基因序列中是否存在该单核苷酸多态性。这些技术包括但并不限于：DNA测序、杂交测序、DNA芯片、PCR-RFLP、PCR-SSCP、变性梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱（DHPLC）、飞行质谱法等。

作为一个实施例，所述对肉牛进行基因分型的方法如下：

（1）提取待测肉牛的基因组DNA；

（2）以基因组DNA为模板，运用飞行质谱法对所述分子标记进行基因分型，确定待测肉牛的基因型为AA或AG或GG。

本发明的有益效果在于：

本发明首次发现雪龙黑牛群体中DNMT3a基因内含子11中存在一个SNP分子标记（A/G），在雪龙黑牛群体共141头个体中经过关联分析得出该SNP对排酸前/后胴体重、牛腩厚、三角牛腩厚以及上脑盖影响显著（p<0.05），AA型表现为优势基因型。本发明提供的标记可靠，可用于对肉牛群体肉质性状的筛选。本发明为优质肉牛分子育种提供理论依据和遗传基础，有助于进一步加快肉牛育种进程，具有极其重大的应用价值和社会效益。

附图说明

图1为DNMT3a内含子11基因池的PCR扩增胶图；由左至右分别为：样品池1至样品池5的DNMT3a内含子11的PCR扩增条带、Marker；其中，Marker:由上到下600，500，400，300，200，100bp。

图2为DNMT3a内含子11基因池的测序峰图（↑处为突变位点）。

图3为部分基因组DNA提取琼脂糖检测电泳结果；由左至右分别为：雪龙黑牛样品1至样品9的基因组DNA电泳条带。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1SNP的发现和分型

采用DNA池筛查SNPs，随机选取雪龙黑牛10个样品进行DNA混池，提取冻精基因组DNA，将其浓度配成大约100ng/μl，用紫外分光光度计检测其浓度并达到均一，每个个体取10μl共100μl的DNA混合构建成DNA池。

对混池DNA中DNMT3a内含子11的一段序列进行PCR扩增。

PCR扩增的引物对如下：

正向引物F：5’-agcactggattgaggtcctg-3’；

反向引物R：5’-gccaagtctgtcctttgagg-3’。

上述引物对针对的靶序列如下所示：SEQ ID No.1

PCR反应体系见表1。

表1PCR反应体系

试剂	用量（μl）
		ddH20	17.375
l0×Buffer扩增缓冲液	2.5
		dNTP混合物（每种2.5mM）	2.0
正向引物F(10pmol/μ1)	1.0
		反向引物R(10pmol/μ1)	1.0
Taq DNA聚合酶(5U/μl)	0.125
		模板DNA(100ng/μl)	1.0
总体积	25

PCR反应条件：95℃5min预变性；95℃30s、60℃30s、72℃30s、35个循环；72℃延伸10min。

反应完成后，将3μl PCR反应液在2%的琼脂糖凝胶上电泳检测，结果得到一条543bp的特异性条带（见图1）。

经过测序发现，此PCR产物的DNA序列内存在一个A/G突变，应用飞行时间质谱技术，即可将基因在群体中进行分型。

实施例2SNP位点与肉质性状的关联分析

本实施例中的实验样本为13个不同国内外肉牛品种共366头肉牛个体组成的群体，分别为三河牛30头、新疆褐牛30头、渤海黑牛3头、鲁西牛30头、复州牛7头、利木赞牛24头、和牛11头、夏洛莱牛29头、安格斯牛9头、挪威红牛4头、蒙贝利亚14头、西门塔尔28头以及雪龙黑牛141头。所选样品为大多数为冻精样本，和牛中有6个为耳组织样，雪龙黑牛141头均为肌肉样本。

一、基因分型

1、提取基因组DNA

冻精样本采取传统酚仿法进行基因组DNA的提取，对于组织样本采用试剂盒DP304（Tiangen Biotech Co.,Ltd,Beijing,China）提取基因组DNA。基因组DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳，以验证提取效果，并应用NANODROP2000进行DNA质量的检测，268/280值控制在1.8－2.2之间，260/230控制在1.7－2.2之间。部分样本基因组DNA的电泳图见图3。

2、飞行时间质谱技术进行基因分型

飞行时间质谱技术（Matrix-Assisted Laser Desorption/IonizationTime of Flight，MALDI-TOF）是一种快速、准确、高通量的SNP检测技术。该技术利用样品分子在电场中的飞行时间与分子的电荷质量比成正比的原理，实现区分、鉴别不同SNP基因型。采用飞行时间质谱技术检测雪龙黑牛在此SNP座位的基因型，根据飞行时间质谱结果，可将检测样品的SNP基因型分为AA型、AG型和GG型（表2）。

二、性状测定和关联分析

检测本141头雪龙黑牛的14个肉质性状，包括眼肉长、眼肉宽、牛腩厚、上脑盖、理石花纹、三角牛腩厚、三角牛腩等级、脂肪厚、眼肌面积、脂色等级、肉色等级、屠宰率、排酸前胴体重以及排酸后胴体重。将肉质性状与DNMT3a内含子11的G/A突变进行关联分析，关联分析采用SAS9.0的GLM过程，模型如下：

Y=μ+G+S+M+D+e

其中：

Y：每个个体14个性状的表型值；

μ：各性状均值；

G：基因型的效应；

S：性别效应；

M：月龄效应；

D：屠宰日效应；

e：随机误差。

结果见表2。

表2DNMT3b A76198537G SNP对各性状的效应

（p值和最小二乘均值±标准误）

备注：P值被命名为相伴概率，当P值小于显著性水平α时（通常为0.05或0.01），将否认零假设，同意备择假设，即检验统计量之间的差异是显著或极显著的；a,b意味着同列中没有相同上标的值间差异显著（P<0.05）；A,B意味着同列中没有相同上标的值间差异极显著（P<0.01）。

本发明的SNP位点突变对排酸前胴体重、牛腩厚、三角牛腩厚等3性状有极显著的影响（P<0.01）,而对排酸后胴体重、三角牛腩等级以及上脑盖等到个性状有显著的影响（P<0.05），对其它性状虽然没有达到显著水平，但是AA为优势基因型是十分明显的。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种与肉牛肉质性状相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，在第278位有1个A278-G278碱基突变，导致肉质性状出现多态性；

所述肉质性状为排酸前/后胴体重、牛腩厚、三角牛腩厚以及上脑盖厚。

2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述碱基突变的位点为Intron11-A27G位点，位于DNMT3a基因第11内含子第27bp处。

3.权利要求1所述的分子标记的制备方法，其特征在于，以牛基因组DNA为模板，设计引物，进行PCR扩增，目的在于扩增包含Intron11-A27G位点的DNA序列。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-agcactggattgaggtcctg-3’；

反向引物：5’-gccaagtctgtcctttgagg-3’。

5.一种用于扩增权利要求1所述分子标记的引物对，其核苷酸序列如下：

正向引物：5’-agcactggattgaggtcctg-3’；

反向引物：5’-gccaagtctgtcctttgagg-3’。

6.权利要求1所述的分子标记在肉牛标记辅助选择中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，具体为利用权利要求1所述的分子标记对肉牛进行基因分型，选择基因型为AA的肉牛进行育种。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肉牛为雪龙黑牛。