CN101624598A - 牛capn1基因作为背最长肌嫩度分子标记的鉴定方法及应用 - Google Patents
牛capn1基因作为背最长肌嫩度分子标记的鉴定方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于动物基因工程技术领域，是一种牛背最长肌嫩度相关基因CAPN1基因片段的克隆以及其在牛标记辅助选择中的应用。所获得的CAPN1基因片段的核苷酸序列长度为520bp，包括全部第14外显子。在此片段的第166bp处存在有一个A→G的碱基突变，导致PsuI－RFLP酶切多态性的产生。将此突变位点作为一个分子标记，使用限制性内切酶PsuI检测此突变位点，并可将检测结果与牛背最长肌嫩度进行关联分析。分析结果表明，不同基因型个体的背最长肌嫩度有极显著的差异，从而为牛的选种选育提供理论基础。本发明的特点在于获得与中牛背最长肌嫩度相关的CAPN1基因部分片段，并利用PCR－RFLP方法对该片段进行多态性分析，为牛的标记辅助选择提供分子标记及其应用。
Description
技术领域
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及牛背最长肌嫩度相关基因CAPN1基因片段的克隆以及其在牛标记辅助选择中的应用。
背景技术
有实验证明(Wick M等，J Biol Chem，1999，279：1567-1582)，肌原纤维中主要蛋白的降解是肉品嫩度提高的根本原因，特别是Z盘的降解弱化，肌原纤维间联结蛋白(结蛋白和联结蛋白)、肌原纤维内联结蛋白(肌联蛋白、伴肌动蛋白和肌钙蛋白-T)的降解造成肌原纤维片断化，构成肌原纤维结构完整性的这些蛋白质的降解是嫩化成熟的主要原因。也有实验证实(Koomaraie M，MeatSci，1993，32：93-104)，钙蛋白酶体系是导致蛋白质降解、嫩度提高的关键酶。廖洪波等(廖洪波等，钙蛋白酶和肉的成熟嫩化.肉类工业.2003.8：27-29)认为，在宰后成熟的过程中钙蛋白酶(CAPN1)的活性显著下降。CAPN1活性下降，则是其发挥水解作用的体现。
Pringle T.D等(Pringle T D等，Calcium activated tenderization ofstrip loin，top sirtoin，and top sirloin，and top round steaks in diversegenotypes of cattle.J Anim Sci，1999，77：3230-3237)用Angus和Brahman及其杂交牛为对象进行试验，发现CAPN1的活性与嫩度具有相关性。Page等(PageB T等，Evaluation of single-nucleotide polymorphisms in CAPN1 forassociation with meat tenderness in cattle.J Anim Sci，2002，80(12)：3077-3085)利用皮埃蒙特和安格斯牛的杂交后代种群作为研究对象，对CAPN1基因进行SNP分析时发现，此基因中存在38个SNP位点，其中2个位点与肉的嫩度相关性极大，说明CAPN1基因序列的差异可能是产生同一物种相同肌肉间嫩度差异的主要原因。
蔡欣等(蔡欣等，应用Nested和Touch down pcr技术分离牦牛CAPN1大亚基基因EST.西北农林科技大学学报(自然科学版)2005.33(2)14-18)应用Nested和Touch down PCR技术分离牦牛CAPN1大亚基基因EST。分离到的牦牛CAPN1基因EST序列与其他哺乳类对应序列具有较高的同源性，与奶牛、绵羊和猪的同源性分别为98％，96％和93％，与人和食蟹猴的同源性均为89％，该序列与偶蹄目动物对应序列的同源性较灵长类动物的高，可能在进化过程中更为保守。牦牛CAPN1部分编码序列的分离与分析为牦牛CAPN1基因的进一步研究奠定了基础。在今后的工作中，利用已获得的EST序列，可以克隆牦牛CAPN1基因全长序列，进而进行此基因与牛肉嫩度相关性方面的分子遗传标记研究。朱燕等(朱燕等，中国黄牛背最长肌中CAPN1 mRNA表达与嫩度的关系.南京农业大学学报.2006.29(2)：89-93)采用实时荧光定量PCR方法研究了中国黄牛背最长肌中CAPN1 mRNA表达与嫩度的关系。结果表明，CAPN1 mRNA表达量与宰后第3天的牛肉嫩度高度相关(r＝0.1855)。酪蛋白底物酶原分析表明，不同肌肉的CAPN1潜在酶活性存在很大差异。CAPN1 mRNA的表达可能是影响牛肉嫩度的主要因素。实验还发现CAPN1产生的降解条带有一定的差别。表明CAPN1在不同黄牛个体中蛋白水平的表达也存在差异，从另一方面也证实了肉的嫩化主要酶可能是CAPN1。
发明内容
本发明的目的在于克隆牛背最长肌嫩度相关基因CAPN1基因片段，寻找CAPN1基因的突变位点以及作为牛背最长肌嫩度相关基因的多态性检测方法，为牛标记辅助育种提供一种有用的分子标记。
本发明通过以下技术方案实现：
一种牛背最长肌嫩度相关基因CAPN1的一部分DNA序列如表SEQ ID NO：1所示。
PCR扩增CAPN1基因的目的片段全长为520bp，其序列如SEQ ID NO：i所示。
所获得CAPN1基因片段的DNA下列中有如表SEQ ID NO：1所述的A166-G166的碱基突变，导致PsuI-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)多态性的产生。
一种筛选适用与牛背最长肌嫩度的分子标记的方法，按照以下步骤制备：利用NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心)中牛CAPN1基因DNA序列为参照，设计特异性引物一对，正向引物CAPN1E14F：5`-AAGGTGACTTTGTGCTGCGTTTCT-3`和反向引物CAPN1E14R：5`-CTGCTGCGTGACCTTGGGTAAAT-3`。从牛血液中提取基因组DNA，进行PCR扩增、PCR产物的纯化和克隆测序。由于PCR产物片段的DNA序列第166位存在A-G的碱基突变，导致PsuI-RFLP多态性的产生，利用限制性内切酶PsuI可进行此突变位点的检测。
将检测结果所示的不同基因型与牛背最长肌嫩度关联分析，从而为牛的标记辅助选择提供分子标记及其应用。
以下对本发明作详细的描述：
一、牛背最长肌嫩度相关基因CAPN1基因片段的克隆
1.引物设计及PCR反应：
利用NCBI中的牛CAPN1基因DNA序列(登录号：AF252504S2)为模板，利用生物学软件Oligo6.0设计一对特异性引物。建立PCR反应条件，具体情况如下：
CAPN1E14F：5`-AAGGTGACTTTGTGCTGCGTTTCT-3`(正向引物)
CAPN1E14R：5`-CTGCTGCGTGACCTTGGGTAAAT-3`(反向引物)
PCR反应体系为：10×PCR Buffer(购自天根生化科技有限公司)3.0μl，dNTPs(购自北京鼎国生物技术公司，浓度为2.5mM)0.8μl，正向引物与反向引物(浓度为均为10pmol/μl)各0.4μl，Taq酶(购自天根生化科技有限公司，浓度为2.5U/μl)0.4μl，基因组DNA 0.5μl(含10-30ngDNA)，四馏水24.5μl。
PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸40秒，共35个循环，72℃最后延伸5分钟。
2.PCR产物的纯化、克隆和测序：
(1)PCR产物的纯化：在本发明中，为达到高速、高校的回收效果，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(购自AXYGEN公司，操作过程中所需的所有液体均由试剂盒内提供)进行凝胶的纯化和回收，按照该试剂盒说明书操作，步骤如下：在紫外光下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的胶块，放入1.5mlEpendorff管中，并按100mg胶块＝100μl计算出胶块体积；加入已切下的胶块体积的3倍量的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热至胶块完全熔化成液体；加入已切下的胶块体积的0.5倍量的Buffer DE-B，混合均匀；将所有液体转移至已经嵌入2ml离心管的DNA制备管中(2ml离心管和DNA制备管中均由试剂盒内提供)，12000g离心1分钟；弃去滤液，将制备管重新放回2ml离心管中，加入500μlBuffer W1，12000g离心30秒；弃去滤液，将制备管重新放回2ml离心管中，加入700μl Buffer W2，12000g离心30秒；弃去滤液，将制备管重新放回2ml离心管中，加入700μl Buffer W2，12000g离心1分钟；弃去滤液，将制备管重新放回2ml离心管中，12000g离心1分钟；将制备管放入一个新的1.5mlEpendorff管中，在制备膜中央加入25μl Eluent溶液，静置1分钟，12000g离心1分钟洗脱回收PCR产物。
(2)连接：为保证良好的连接效果，本发明将回收的PCR产物与pMD18-T载体(购自Takara公司)进行连接，反应总体系为10μl，其中包括1μlpMD18-T载体，3μlPCR产物，1μl四馏水，5μl Solution I，16℃连接12小时。
(3)转化并测序：在无菌条件下，取150μl感受态细胞于1.5mlEpendorff管中，加入连接产物并混合均匀，在冰水混合物中放置30分钟后放入42℃水浴中90秒，取出后再放入冰水混合物中5分钟，加入400μl无AMP(氨苄青霉素)的LB液体培养基，37℃震荡1小时，取100μl均匀涂布于含AMP的LB固体培养基上，37℃平放1小时带菌液全部被培养基吸收后倒置培养12-16小时。挑取单克隆，经鉴定为阳性的送交测序公司进行测序。
二、RLFP诊断方法的建立
用引物CAPN1E14F和CAPN1E14R扩增牛基因组DNA得到520bp的特异扩增片段(SEQ ID NO：1)。测序结果发现，在该520bp片段中，由于第166bp处存在A→G的突变，从而导致PsuI酶切位点(R*GATCY)的产生，其中，164-165bp间为PsuI酶的多态性切点。PCR扩增产物经PsuI酶切产生三种基因型，经2％琼脂糖凝胶电泳可明显判别不同带型。其中AA型只有520bp一条带，AG型含有520bp，165bp，355bp三条带，GG型有165bp和355bp两条带(图2)。
三、标记性状关联分析
利用申请人与吉林省长春市皓月清真肉业集团股份有限公司合作的实验群体为实验对象进行性状关联分析，利用SPSS12.0软件，建立如下模型进行性状关联分析：
统计分析模型为：Yi＝μ+Gj+ei。其中，Yi为被观测个体的生产性能表型值，μ为生产性能的最小二乘均值，Gj为基因型对生产性能的效应值，ei为对应于观察值的随机残差。
本发明的效果是如下：
1、牛CAPN1基因部分DNA序列的克隆
PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示为特异性PCR产物，如图1所示。将PCR产物回收测序，结果显示产物长度为520bp。测序结果显示该片段166bp处存在A、G两个等位基因，部分测序峰图如图3所示。
2、针对牛CAPN1基因部分DNA片段PCR-RFLP诊断方法的建立
用本发明设计的特异性引物扩增牛基因组DNA得到的520bp特异扩增片段。测序的结果发现在该520bp片段存在PsuI酶切位点(R*GATCY)，其中第164-165bp处为酶切位点。扩增产物经过限制性内切酶PsuI酶切可产生三种基因型，即AA型、AG型和GG型，具体图片如图2所示。
3、对标记性状进行关联分析
本发明中牛CAPN1基因的扩增序列PsuI-RFLP多态位点与牛背最长肌嫩度的关联分析，基因型检测结果表明，在138个体中，AA型个体有44个，AG型个体有64个，GG型个体有30个。不同基因型个体的背最长肌剪切力(通过测量剪切力，可评价肉的嫩度。剪切力值高，嫩度低；剪切力值低，嫩度高)之间显著差异分析结果(最小二乘值和标准误)见表1。
表1不同基因型个体剪切力之间显著差异分析结果
| 基因型 | 个体数 | 最小二乘均值±标准误 |
| AA | 44 | 4.1764548±0.08242402A |
| AG | 64 | 4.7370381±0.11381620B |
| GG | 30 | 5.5096146±0.24605115C |
注：表中最小二乘均值±标准误肩标带有不同字母表示差异极显著(P＜0.01)
分析结果表明，此酶切位点不同基因型所对应的个体的背最长肌剪切力存在极显著的差异，AA型个体的剪切力极显著低于AG型和GG型(P＜0.01)，AG型个体极显著低于GG型(P＜0.01)，A等位基因是有利于牛背最长肌嫩度的有利标记。
附图说明
图1是CAPN1基因扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，1-9泳道为被检测的9个PCR产物。
图2是2％琼脂糖凝胶电泳检测CAPN1基因扩增产物的PsuI酶切结果。其中M泳道为标准分子量Marker。
图3是本发明扩增的CAPN1基因部分DNA序列中突变位置的克隆测序峰图。
图4是实施例1中PCR扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1-6为被检测的PCR产物。
图5是实施例1中酶切反应产物的2％琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1-6为被检测的酶切产物。
图6是实施例2中PCR扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1-10为被检测的PCR产物。
图7是实施例2中酶切反应产物的2％琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1-10为被检测的酶切产物。
图8是实施例3中PCR扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1-9为被检测的PCR产物。
图9是实施例3中酶切反应产物的2％琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1-9为被检测的酶切产物。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，用具体实施方式详细描述具体内容。
本发明利用已公布的CAPN1基因序列和提取的牛基因组DNA，设计特异性引物一对，克隆包括全部第14外显子的部分DNA序列，利用PCR-RFLP方法，使用限制性内切酶PsuI对PCR扩增反应产物进行酶切。将酶切结果分型并将不同基因型与背最长肌剪切力关联，为牛的标记辅助选择提供分子标记。
一、牛CAPN1基因部分DNA片段的克隆
1引物设计
以牛CAPN1基因DNA序列为参照，NCBI(National Center for BiotechnologyInformation，美国国家生物技术信息中心)收录号为AF252504S2，利用Oligo6.0软件设计特异性引物1对，为保证良好的引物质量，在本发明中，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，扩增产物长度为520bp，引物序列如下所示：
CAPN1E14F：5`-AAGGTGACTTTGTGCTGCGTTTCT-3`(正向引物)
CAPN1E14R：5`-CTGCTGCGTGACCTTGGGTAAAT-3`(反向引物)
PCR反应体系为：10×PCR Buffer(购自天根生化科技有限公司)3.0μl，dNTPs(购自北京鼎国生物技术公司，浓度为2.5mM)0.8μl，正向引物与反向引物(浓度为均为10pmol/μl)各0.4μl，Taq酶(购自天根生化科技有限公司，浓度为2.5U/μl)0.4μl，基因组DNA 0.5μl(含10-30ngDNA)，四馏水24.5μl。
PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸40秒，共35个循环，72℃最后延伸5分钟。
2.PCR产物的纯化、克隆和测序：
(1)PCR产物的纯化：在本发明中，为达到高速、高校的回收效果，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(购自AXYGEN公司，操作过程中所需的所有液体均由试剂盒内提供)进行凝胶的纯化和回收，按照该试剂盒说明书操作，具体步骤如下：
在紫外光下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的胶块，并称取胶块质量，然后放入1.5mlEpendorff管中，按100mg胶块＝100μl计算出胶块体积；
加入已切下的胶块体积的3倍量的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热至胶块完全熔化成液体；
加入已切下的胶块体积的0.5倍量的Buffer DE-B，混合均匀；
将所有液体转移至已经嵌入2ml离心管的DNA制备管中(2ml离心管和DNA制备管由试剂盒内提供)，12000g离心1分钟；
弃去滤液，将制备管重新放回2ml离心管中，加入500μl Buffer W1，12000g离心30秒；
弃去滤液，将制备管重新放回2ml离心管中，加入700μl Buffer W2，12000g离心30秒；
弃去滤液，将制备管重新放回2ml离心管中，加入700μl Buffer W2，12000g离心1分钟；
弃去滤液，将制备管重新放回2ml离心管中，12000g离心1分钟；
将制备管放入一个新的1.5mlEpendorff管中，在制备膜中央加入25μlEluent溶液，静置1分钟，12000g离心1分钟洗脱回收PCR产物。
(2)连接：为保证良好的连接效果，本发明将回收的PCR产物用pMD18-T载体试剂盒(购自Takara公司)进行连接，反应总体系为10μl，其中包括1.0μlpMD18-T载体，3.0μlPCR产物，1.0μl四馏水，5.0μl Solution I，16℃连接12小时。
(3)转化：在无菌条件下，取150μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，加入已连接12小时的连接产物并混合均匀，在冰水混合物中放置30分钟后放入42℃水浴中90秒，取出后再放入冰水混合物中5分钟，加入400μl无AMP(氨苄青霉素)的LB液体培养基，37℃震荡1小时，取100μl均匀涂布于含AMP的LB固体培养基上，37℃平放1小时后，待菌液全部被培养基吸收后倒置培养12-16小时。培养结束后挑取单克隆，经鉴定为阳性的送交上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。
二、PCR-RFLP方法的建立
1、PCR产物的检测
用本发明设计的引物CAPN1E14F和CAPN1R14R对牛基因组DNA扩增得到520bp的特异性扩增产物，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示为特异性PCR产物，见图1，其中M泳道为标准分子量Marker，1-9泳道为被检测的9个PCR产物。
2、针对牛CAPN1基因部分DNA片段PCR-RFLP诊断方法的建立
用本发明设计的特异性引物扩增牛基因组DNA得到的520bp特异扩增片段。测序的结果发现在该520bp片段存在PsuI酶切位点(R*GATCY)，其中第164-165bp处为酶切位点。扩增产物经过限制性内切酶PsuI酶切可产生三种基因型，即AA型、AG型和GG型，具体图片如图2所示。
限制性内切酶PsuI可自行选择。本发明中为达到高效、高速的效果，选用Bio Basic Inc.(BBI公司)的PsuI内切酶。PCR产物酶切反应体系为15μl，其中10×Buffer W[由内切酶包装盒中提供，含10mM Tris-HCl(PH8.0)，10mMMgCl2，100mM NaCl，1mM DTT]1.5μl，PCR产物5μl，限制性内切酶PsuI 1.0μl(总量10U)，四馏水7.5μl，将样品混合均匀后37℃恒温水浴5小时。恒温水浴结束后，取8μl酶切产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型检测结果。
由于PCR产物片段的DNA序列中存在A-G的碱基突变，导致PsuI-RFLP多态性的产生，利用限制性内切酶PsuI可进行此突变位点的检测。
用引物CAPN1E14F和CAPN1E14R扩增牛基因组DNA得到520bp的特异扩增片段(图1)。164-165bp间为PsuI酶的多态性切点(R*GATCY)。PCR扩增产物经PsuI酶切产生三种基因型，经2％琼脂糖凝胶电泳可明显判别不同带型。其中AA型只有520bp一条带，AG型含有520bp，165bp，355bp三条带，GG型有165bp和355bp两条带(图2)。
三、标记性状关联分析
利用申请人与吉林省长春市皓月清真肉业集团股份有限公司合作的实验群体为实验对象进行性状关联分析，利用SPSS12.0软件，建立如下模型进行性状关联分析：
统计分析模型为：Yi＝μ+Gj+ei。其中，Yi为被观测个体的生产性能表型值，μ为生产性能的最小二乘均值，Gj为基因型对生产性能的效应值，ei为对应于观察值的随机残差。
本发明中牛CAPN1基因的扩增序列PsuI-RFLP多态位点与牛背最长肌嫩度的关联分析，基因型检测结果表明，在138个体中，AA型个体有44个，AG型个体有64个，GG型个体有30个。不同基因型与剪切力之间显著差异分析结果(最小二乘值和标准误)见表2。
分析结果表明，此酶切位点不同基因型所对应的个体，其背最长肌剪切力存在极显著的差异，AA型个体的剪切力极显著低于AG型和GG型(P＜0.01)，AG型个体极显著低于GG型(P＜0.01)，A等位基因是有利于牛背最长肌嫩度的有利标记。
表2不同基因型个体剪切力之间显著差异分析结果
| 基因型 | 个体数 | 最小二乘均值±标准误 |
| AA | 44 | 4.1764548±0.08242402A |
| AG | 64 | 4.7370381±0.11381620B |
| GG | 30 | 5.5096146±0.24605115C |
注：表中最小二乘均值±标准误肩标带有不同字母表示差异极显著(P＜0.01)
实施例1
在中国吉林省长春市皓月清真肉业集团股份有限公司的肉牛群体中随机选定六个待屠宰个体，在屠宰时采集血液进行基因组DNA的提取并测定其背最长肌的剪切力。提取的基因组DNA经分光光度仪测定，浓度为36.54ug/ml，OD260/OD280Ratio为1.824。利用本发明设计的引物、PCR反应体系和条件进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×PCR Buffer(购自天根生化科技有限公司)3.0μl，dNTPs(购自北京鼎国生物技术公司，浓度为2.5mM)0.8μl，正向引物与反向引物(浓度为均为10pmol/μl)各0.4μl，Taq酶(购自天根生化科技有限公司，浓度为2.5U/μl)0.4μl，基因组DNA 0.5μl(含18.27ng DNA)，四馏水24.5μl。
PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸40秒，共35个循环，72℃最后延伸5分钟。
扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示为特异性PCR产物。如图4所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1-6为被检测的PCR产物。将PCR产物按本发明设计的RFLP方法进行酶切反应。PCR产物酶切反应体系为15μl，其中10×Buffer 1.5μl，PCR产物5μl，限制性内切酶PsuI 1.0μl(10U/μl)，四馏水7.5μl。将样品混合均匀后，37℃恒温水浴5小时。为提高酶切反应效率，可每隔1小时将反应管取出，将部分蒸发的液体轻甩到管底部。酶切反应结束后，取5μl酶切产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，具体基因型如图5所示。如图5所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1-6为被检测的酶切产物。经鉴定，个体1、4属于AG型，个体2、3属于GG型，个体5-6属于AA型。此六个个体的背最长肌剪切力见表3。
表3实施例1中抽取的个体性状测量值
| 屠宰个体编号 | 品种 | 基因型 | 背最长肌剪切力 |
| 1 | 西门塔尔 | AG | 5.111 |
| 2 | 西门塔尔 | GG | 5.773 |
| 3 | 利木赞 | GG | 5.690 |
| 4 | 利木赞 | AG | 5.065 |
| 5 | 夏洛莱 | AA | 4.295 |
| 6 | 夏洛莱 | AA | 4.414 |
以此六个屠宰个体为实验对象进行性状关联分析，利用SPSS12.0软件，建立如下模型进行性状关联分析：
统计分析模型为：Yi＝μ+Gj+ei。其中，Yi为被观测个体的生产性能表型值，μ为生产性能的最小二乘均值，Gj为基因型对生产性能的效应值，ei为对应于观察值的随机残差。
基因型检测结果表明，在此六头个体中，AA型个体有2个，AG型个体有2个，GG型个体有2个。不同基因型与剪切力之间显著差异分析结果(最小二乘值和标准误)见表4。
分析结果表明，此酶切位点不同基因型所对应的个体，其背最长肌剪切力存在极显著的差异，AA型个体的剪切力极显著低于AG型和GG型(P＜0.01)，AG型个体极显著低于GG型(P＜0.01)。
表4不同基因型个体剪切力之间显著差异分析结果
| 基因型 | 个体数 | 最小二乘均值±标准误 |
| AA | 2 | 4.3545±0.05950A |
| AG | 2 | 5.0880±0.02300B |
| GG | 2 | 5.7315±0.04150C |
注：表中最小二乘均值±标准误肩标带有不同字母表示差异极显著(P＜0.01)
实施例2
在中国吉林省长春市皓月清真肉业集团股份有限公司的肉牛群体中随机选定十个待屠宰个体，在屠宰时采集血液进行基因组DNA的提取并测定其背最长肌的剪切力。提取的基因组DNA经分光光度仪测定，浓度为34.54ug/ml，OD260/OD280Ratio为1.794。利用本发明设计的引物、PCR反应体系和条件进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×PCR Buffer(购自天根生化科技有限公司)3.0μl，dNTPs(购自北京鼎国生物技术公司，浓度为2.5mM)0.8μl，正向引物与反向引物(浓度为均为10pmol/μl)各0.4μl，Taq酶(购自天根生化科技有限公司，浓度为2.5U/μl)0.4μl，基因组DNA 0.5μl(含17.27ng DNA)，四馏水24.5μl。
PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸40秒，共35个循环，72℃最后延伸5分钟。
扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示为特异性PCR产物。如图6所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1为被检测的PCR产物。将PCR产物按本发明设计的RFLP方法进行酶切反应。PCR产物酶切反应体系为15μl，其中10×Buffer1.5μl，PCR产物5μl，限制性内切酶PsuI 1.0μl(10U/μl)，四馏水7.5μl。将样品混合均匀后，37℃恒温水浴5小时。为提高酶切反应效率，可每隔1小时将反应管取出，将部分蒸发的液体轻甩到管底部。酶切反应结束后，取5μl酶切产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，具体基因型如图7所示。如图7所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1-10为被检测的酶切产物。经鉴定，个体1、4属于GG型，个体2、3、6、10属于AA型，个体5、7、8、9属于AG型。此十个个体的背最长肌剪切力见表5。
表5实施例2中抽取的个体性状测量值
| 屠宰个体编号 | 品种 | 基因型 | 背最长肌剪切力 |
| 1 | 西门塔尔 | GG | 5.269 |
| 2 | 利木赞 | AA | 4.357 |
| 3 | 利木赞 | AA | 3.914 |
| 4 | 夏洛莱 | GG | 5.933 |
| 5 | 中国草原红牛 | AG | 5.066 |
| 6 | 西门塔尔 | AA | 4.500 |
| 7 | 中国草原红牛 | AG | 4.669 |
| 8 | 中国草原红牛 | AG | 4.716 |
| 9 | 本地黄牛 | AG | 4.594 |
| 10 | 中国草原红牛 | AA | 4.211 |
以此十个屠宰个体为实验对象进行性状关联分析，利用SPSS12.0软件，建立如下模型进行性状关联分析：
统计分析模型为：Yi＝μ+Gj+ei。其中，Yi为被观测个体的生产性能表型值，μ为生产性能的最小二乘均值，Gj为基因型对生产性能的效应值，ei为对应于观察值的随机残差。
基因型检测结果表明，在此十头个体中，AA型个体有4个，AG型个体有4个，GG型个体有2个。不同基因型与剪切力之间显著差异分析结果(最小二乘值和标准误)见表6。
分析结果表明，此酶切位点不同基因型所对应的个体，其背最长肌剪切力存在极显著的差异，AA型个体的剪切力极显著低于AG型和GG型(P＜0.01)，AG型个体极显著低于GG型(P＜0.01)。
表6不同基因型个体剪切力之间显著差异分析结果
| 基因型 | 个体数 | 最小二乘均值±标准误 |
| AA | 4 | 4.2455±0.12526A |
| AG | 4 | 4.7613±0.10464B |
| GG | 2 | 5.6010±0.33200C |
注：表中最小二乘均值±标准误肩标带有不同字母表示差异极显著(P＜0.01)
实施例3
在中国吉林省长春市皓月清真肉业集团股份有限公司的肉牛群体中随机选定九个待屠宰个体，在屠宰时采集血液进行基因组DNA的提取并测定其背最长肌的剪切力。提取的基因组DNA经分光光度仪测定，浓度为37.34ug/ml，OD26O/OD280 Ratio为1.803。利用本发明设计的引物、PCR反应体系和条件进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×PCR Buffer(购自天根生化科技有限公司)3.0μl，dNTPs(购自北京鼎国生物技术公司，浓度为2.5mM)0.8μl，正向引物与反向引物(浓度为均为10pmol/μl)各0.4μl，Taq酶(购自天根生化科技有限公司，浓度为2.5U/μl)0.4μl，基因组DNA 0.5μl(含18.67ng DNA)，四馏水24.5μl。
PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸40秒，共35个循环，72℃最后延伸5分钟。
扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示为特异性PCR产物。如图8所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1为被检测的PCR产物。将PCR产物按本发明设计的RFLP方法进行酶切反应。PCR产物酶切反应体系为15μl，其中10×Buffer1.5μl，PCR产物5μl，限制性内切酶PsuI 1.0μl(10U/μl)，四馏水7.5μl。将样品混合均匀后，37℃恒温水浴5小时。为提高酶切反应效率，可每隔1小时将反应管取出，将部分蒸发的液体轻甩到管底部。酶切反应结束后，取5μl酶切产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，具体基因型如图9所示。如图9所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1-10为被检测的酶切产物。经鉴定，个体1、2、3属于GG型，个体8、9属于AA型，个体4、5、6、7属于AG型。此九个个体的背最长肌剪切力见表5。
表7实施例2中抽取的个体性状测量值
| 屠宰个体编号 | 品种 | 基因型 | 背最长肌剪切力 |
| 1 | 利木赞 | GG | 5.683 |
| 2 | 利木赞 | GG | 5.812 |
| 3 | 西门塔尔 | GG | 5.834 |
| 4 | 西门塔尔 | AG | 5.038 |
| 5 | 中国草原红牛 | AG | 4.711 |
| 6 | 夏洛莱 | AG | 5.033 |
| 7 | 夏洛莱 | AG | 4.766 |
| 8 | 中国草原红牛 | AA | 3.815 |
| 9 | 利木赞 | AA | 4.336 |
以此九个屠宰个体为实验对象进行性状关联分析，利用SPSS12.0软件，建立如下模型进行性状关联分析：
统计分析模型为：Yi＝μ+Gj+ei。其中，Yi为被观测个体的生产性能表型值，μ.为生产性能的最小二乘均值，Gj为基因型对生产性能的效应值，ei为对应于观察值的随机残差。
基因型检测结果表明，在此十一头个体中，AA型个体有2个，AG型个体有4个，GG型个体有3个。不同基因型与剪切力之间显著差异分析结果(最小二乘值和标准误)见表6。
分析结果表明，此酶切位点不同基因型所对应的个体，其背最长肌剪切力存在极显著的差异，AA型个体的剪切力极显著低于AG型和GG型(P＜0.01)，AG型个体极显著低于GG型(P＜0.01)。
表8不同基因型个体剪切力之间显著差异分析结果
| 基因型 | 个体数 | 最小二乘均值±标准误 |
| AA | 2 | 4.0755±0.26050A |
| AG | 4 | 4.8870±0.04710B |
| GG | 3 | 5.7763±0.08647C |
注：表中最小二乘均值±标准误肩标带有不同字母表示差异极显著(P＜0.01)
序列表
<110>吉林大学
<120>牛CAPN1基因作为背最长肌嫩度分子标记的鉴定方法及应用
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>520
<212>DNA
<213>Bos taurus
<220>
<221>mutation
<222>(166)..(166)
<400>1
aaggtgactt tgtgctgcgt ttcttctcag agaagagcgc agggacccag tgagtagaaa 60
gccctcccct gtctccccct ttcctcccac cacacccttg ctgccccaac ccccgttgac 120
tggcccctct ctctccccac cctctgcaga gagctggatg accaggtcca ggccaatctc 180
cccgacgagg tacgtgccct gcccccaccc tgggtgcacg acggggaccc gggtgtcctg 240
tgtcttggtc tctagccagc aaggcagagc ccctcctggc aggagccata cacatccctc 300
acttgccaag cactttacag tttgcaaagg actttgcgat cgatagtaat ggcgcagggc 360
ccctgggttc ttgctctctg cagggtctgt gctgagctgt ttacctggat cacccggttt 420
cctccataac aaccgtgtca gggtgctgtc accgtctctc ctctcagagg gaaactcagg 480
ttcagagagg ttaaggaatt tacccaaggt cacgcagcag 520
Claims (5)
1、一种牛背最长肌嫩度相关的CAPN1基因片段，它的DNA序列如SEQ ID NO：1所述。
2、根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于：序列表SEQ ID NO：1的第166bp处有一个A-G的碱基突变，导致PsuI酶切多态性的产生。
3、根据权利要求1所述的牛肉肉质嫩度相关基因CAPN1基因片段，所选用的特异性引物如下所示：
CAPN1E14F：5`-AAGGTGACTTTGTGCTGCGTTTCT-3`(正向引物)
CAPN1E14R：5`-CTGCTGCGTGACCTTGGGTAAAT-3`(反向引物)
4、权利要求1、2所述的牛背最长肌嫩度相关基因CAPN1基因片段在牛分子标记辅助选择中的应用。
5、权利要求3所述的引物在牛分子标记辅助选择中的应用。
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