CN112760401B - 与玉米穗行数相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

与玉米穗行数相关的SNP分子标记及其应用属于作物遗传育种分子标记技术领域,本发明具体涉及玉米第7号染色体上两个穗行数性状相关的SNP分子标记及应用,即chr7:179016330位点和Chr7:27572145位点。该SNP分子标记是从玉米自交系群体的全基因组关联分析中得到,其核苷酸序列分别如:SEQ ID N01和SEQ ID N02所示,本发明的SNP分子标记可用于分子育种过程中玉米穗行数性状的辅助选择,能提高选择的准确性、加快育种的进程。

Description

与玉米穗行数相关的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明属于作物遗传育种分子标记技术领域,具体涉及与玉米穗行数相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
玉米的产量高、用途广是我国重要的粮食、饲用、能源及经济作物。穗行数是玉米产量的主要构成因子,与玉米的产量高低关系密切。先玉335穗行数16-18行,郑单958穗行数14-16行,所以优良的玉米品种都需要较多的穗行数作为籽粒产量的保障。穗行数是一个比较典型的多基因控制的数量性状,同时它的广义和狭义遗传力都比较高,说明其中有对性状贡献较大的主效基因在发挥作用。目前通过QTL定位和候选基因法已经确定了一些与穗行数相关的QTL区域及候选基因。例如,转录调节因子silky3的异位表达导致玉米花序分生组织的多效性和性别决定缺陷,半显性突变体silky3在花序发育过程中表现出多效性缺陷,包括分生组织和花器官的确定性和同一性的丧失,以及雄穗小花的性转化。KRN1(kernel rownumber 1)是一种与小麦关键驯化基因Q的产物同源的AP2结构域蛋白,增加KRN1在两个玉米突变体中的表达,可以增加小穗对的分生组织数目,导致籽粒行数的增加。KRN4可以增加穗行数进而提高玉米籽粒的产量,KRN4是位于SBP-box基因(Unbranched3,UB3)下游60Kb基因间区的一段约3Kb的序列,它可以调节UB3的表达。
但是QTL定位的区域一般跨度很大,通常会有几个厘摩(centimorgan,cM),定位的区域中包括大量的候选基因,基因的精细定位较困难。候选基因法是根据已有的生命科学背景知识,直接从已知或潜在的基因库中挑选出可能对该性状有影响的基因,但它的缺点是不能识别新的基因。近年来,随着高通量测序技术的不断发展,测序速度的提高与测序成本的降低,使得基于SNP的全基因组关联分析(Genome-wide Association Study,GWAS)广泛应用于作物重要农艺性状遗传位点的检测,单核苷多态性(SNP)在玉米基因组中广泛存在,可以满足GWAS对于大样本、高密度标记的要求。与传统的QTL相比,GWAS具有更高的分辩率,可以更准确的识别和定位新的基因。
囊泡运输是细胞内物质运输的一种重要形式,Exocyst复合体(Exocyst complexcomponent)介导了分泌囊泡与靶标质膜的识别过程。植物细胞和组织依赖靶向胞吐,这也意味Exocyst复合体参与了细胞的极性生长和形态建成等多种重要的细胞生物学过程,包括胞质分裂、质膜蛋白质循环、细胞壁的形成、受精、胁迫和生物相互作用(包括防御病原体)。SEC8是构成Exocyst复合体的一个亚基,拟南芥中SEC8基因突变导致花粉管极性生长缺陷,形成粗短的花粉管,进而导致雄性不育。纤维素是植物细胞壁的主要成分,纤维素是由质膜上的纤维素合酶复合体(cellulose synthase complex,CSC)催化葡萄糖的β-1,4-糖苷键的连接而形成的一种线性多聚葡聚糖大分子。CSC至少由18个纤维素合成酶亚基(cellulose synthase,CS)构成,这些亚基由CS基因家族编码。但是各个亚基是如何组装成纤维素合酶复合体的,其机制与质量调控不清楚,我们对于纤维素的合成也知之甚少。
至今为至,在植物中我们对Exocyst complex component SEC8和Cellulosesynthase-8基因的作用与功能了解仍然是非常有限的,通过GWAS研究群体中突变位点多态性与性状的关联,进而研究未知基因的功能是一个非常有效的技术手段。申请人运用全基因组关联分析首次发现Exocyst complex component SEC8基因Zm0000ld022502和Cellulose synthase-8基因Zm00001d019317的序列多态性与玉米穗行数性状存在极显著的关联,即该基因中存在与穗行数性状相关的SNP分子标记。
发明内容
本发明在于克服现有技术的缺陷,提供两个与玉米重要产量因子穗行数极显著相关的SNP分子标记及其应用。
本发明通过431份不同亲缘关系的玉米自交系构建GWAS分析的群体,群体种植于大田后取玉米的幼苗作为提取基因组DNA的样本,玉米果穗收获晾干后调查穗行数性状作为GWAS分析的表型数据。基因组DNA经酶切后与适当的接头连接构建基因组测序文库,采用Illumina Nova Seq 6000测序平台对文库进行双末端测序(PE150),读长(Reads)为2×150bp。对产出测序数据的进行质控与过虑,将质控合格的数据比对B73参考基因组序列,获得群体基因组中SNP信息。
本发明对获得的SNP数据进行质控,质控标准为MAF<0.05,缺失率>0.8,Hw(哈迪-温伯格指数)>0.0001,利用软件Snp Eff(版本4.3t)的基因组结构注释数据(GTF文件)对VCF文件中的SNP/InDel信息进行注释,即是否能够对基因编码蛋白造成影响,包括SNP的突变类型和突变位置,氨基酸的变异类型和效应等。使用软件GAPIT(3.1.0)中的CMLM模型(compressed mixed linear model)对行粒数性状进行关联分析。关联分析时基于贝叶斯信息准则(Bayesian information criterion,BIC)的模型选择,找到GWAS模型中最优的PCs数量,用以拟合最优的性状因子。
本发明获得了549211个合格的SNP用于全基因组关联分析,当检出的SNP的P值小于10-4时,我们认为这个SNP达到了基因组水平的显著。Zm00001d022502基因的内含子区域检出1个SNP位点符合上述条件,该SNP位于玉米第7号染色体179016330位,Zm00001d019317基因编码区检出1个SNP位点,该变异为氨基酸的同义突变,位于玉米的第7号染色体的27572145位,生物信息学功能注释表明它们分别是(Exocyst complex component SEC8)和(Cellulose synthase-8)基因。SEC8是构成Exocyst复合体的一个亚基,Exocyst复合体参与了细胞的极性生长和形态建成等多种重要的细胞生物学过程,Cellulose synthase-8编码纤维素合酶复合体的一个亚基,参与纤维素的合成。
本发明对检出的显著位点不同基因型样本进行组间比较,Zm00001d022502基因Chr7:179016330位点组间均值差为0.981行(P<0.0001),基因型G/G是穗行数更多的极显著分子标记;基因型A/A和A/G是穗行数更少的极显著分子标记。Zm00001d019317基因Chr7:27572145位点组间均值差为1.132行(P=0.0007),基因型C/C是穗行数更少的极显著分子标记,基因型T/T及C/T是穗行数更多的极显著分子标记。
本发明的与玉米穗行数相关的SNP分子标记,其特征在于位于玉米第7号染色体Zm00001d022502基因的内含子区,其核苷酸序列如SEQ ID N01所示,序列130位的碱基R为A或G。
本发明的与玉米穗行数相关的SNP分子标记能在玉米穗行数性状辅助选择中应用,其基因型G/G为穗行数多的极显著分子标记;基因型A/A和A/G为穗行数少的极显著分子标记。
本发明的与玉米穗行数相关的SNP分子标记,其特征在于位于玉米第7号染色体Zm00001d019317基因的编码区,其核苷酸序列如SEQ ID N02所示,序列146位的碱基Y为C或T。
本发明的与玉米穗行数相关的SNP分子标记能在玉米果穗行粒数性状辅助选择中应用,其基因型C/C为穗行数少的极显著分子标记,基因型T/T及C/T为穗行数多的极显著分子标记。
本发明运用全基因组关联分析的方法得到了穗行数相关的SNP分子标记,以此作为玉米育种过程中穗行数性状的辅助选择标记,能提高选择的准确性、加快品种培育的进程。
附图说明
图1为供试玉米群体穗行数性状次数分布的方柱形图
其中:横坐标代表穗行数;纵坐标代表玉米穗位高性状样本。
图2为玉米基因组DNA检测电泳图(部分)
图3为玉米穗行数性状全基因组关联分析的曼哈顿图
其中:横坐标代表每个SNP所在的基因组位置;纵坐标代表CMLM模型下每个SNP位点P值的以10为底的负对数。
图4为玉米穗行数性状的全基因组关联分析的QQ图
其中:横坐标代表假设P值服从均匀[0,1]分布,所预期观察的P值以10为底的负对数;纵坐标代表观察到P值以10为底的负对数。
图5为Zm00001d022502基因chr7:179016330位点不同基因型样本的穗行数次数分布的箱形图
图6为Zm00001d019317基因Chr7:27572145位点不同基因型样本的穗行数次数分布的箱形图
具体实施方式
实施例1
1.1GWAS群体的构建
玉米全基因组关联分析群体包括431份不同血缘关系的自交系。所有的自交系都由吉林大学植物科学学院提供,种植于吉林大学植物科学学院教学与科研实验基地(吉林省长春市绿园区)。小区排列遵循随机区组设计,区组3次重复,单行小区,行长3m,行距65厘米,株距20厘米,田间管理措施与大田相同。
1.2样品的采集和表型数据的调查
小区玉米幼苗出苗后的5-6叶期,采集3株幼苗,清洗干净后置于-20℃冰箱冻存。玉米果穗成熟后,每个小区调查有代表性的5个果穗的穗行数(Kernel Row Number,KRN),以区组三次重复的平均值作为GWAS分析的表型数据,调查数据采用Excel2013软件进行整理。
1.3玉米基因组DNA的提取与检测
(1)取50-100mg玉米幼苗用液氮研磨成粉末,转移至1.5ml离心管中,加入400ulBuffer PCL,8ul β-巯基乙醇,震荡混匀。65℃水浴45min至样品完全裂解。
(2)加入200ul Buffer PP,充分颠倒混匀,-20℃冰箱放置5min,室温10000rpm离心5min,将上清液(500-550ul)转移到新的1.5ml离心管中。若上清液混浊,可再加入等体积氯仿混匀,12000rpm离心取上清。
(3)加入等体积的异丙醇,颠倒5-8次使之充分混匀,室温放置2-3min。室温10000rpm离心5min,弃上清。
(4)加入1ml 75%乙醇,颠倒漂洗1-3min,10000rpm离心2min,弃上清。重复上述操作一次,开盖室温倒置5-10min至残留的乙醇完全挥发。
(5)得到的DNA用50-100ul TE Buffer溶解。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
(6)1%琼脂糖凝胶(200V电泳30min)检测DNA完整性,Qubit2.0定量检测DNA样本浓度。
1.4研究结果
自交系群体玉米穗位高性状样本均值14.91行,中位数为14.88行,平均偏差1.58行,极差12.44行,标准差2.04行,变异系数0.137,95%置信区间为14.73-15.11行,穗位高性状次数分布情况见图1。
玉米幼苗基因组DNA采用Rapid Plant Genomic DNA Isolation Kit提取后,在裂解液作用下裂解消化RNA,经有机相洗脱蛋白等杂质,得到纯净DNA,DNA样本经电泳检测合格后(>10ng/u1),可用于基因组文库构建,电泳检测结果见图2。
实施例2
2.1测序文库的构建
(1)200ng基因组DNA用限制性内切酶EcoRI酶切,酶切消化完全后磁珠纯化回收。
(2)酶切后纯化的DNA用T4 DNA Ligase连接Barcode adapters PI,连接产物磁珠纯化回收,记录合格的P1引物标签。
(3)所有样本按要求等比例混合为一个总DNA mix,使用covaris220将DNA片段化,打断后的DNA的碎片长度约为200-500bp。
(4)End Repair&dA-tailing后,连接Adaptor P2,连接产物磁珠纯化回收。
(5)利用KAPA 2G Robust PCR Kit扩增并富集接头连接产物,利用磁珠对PCR反应产物进行纯化分选,通过2%琼脂糖凝胶电泳检测构建完成的文库PCR纯化产物质量,合格的PCR产物进行二代测序。
2.2简化基因组测序(restriction site-associated DNA sequencing,RAD)
(1)采用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行双末端测序(PE150),读长(Reads)为2×150bp。
(2)产出数据的质控与过虑:对碱基检出的错误发生几率进行预测,如果质量分值(Q-score)为低质量(Q≤5(E))的碱基数占整条read的一半以上,则去掉该read,同时还去除用于样品识别的标签序列。
(3)利用STACKS-1.08(http://creskolab.uoregon.edu/stacks/)分别对所有样品进行stack聚类分析,检测获得各样本Tag序列,以及SNP信息。
(4)数据比对以及SNP-Callling:采用BWA软件(版本0.7.17-r1188)进行基因组比对,将质控合格的数据比对B73参考基因组序列。
2.3基因型检测与GWAS
(1)变异检测和筛选:使用PiCard软件标记重复,SamTools(1.9)对bam进行排序,BcfTools(1.9)进行call SNP。
(2)SNP质控:质控软件为Vcf Tools(0.1.16)对SNP,质控标准为MAF<0.05,缺失率>0.8,Hw(哈迪-温伯格指数)>0.0001。
(3)SNP注释:软件Snp Eff(版本4.3t)利用基因组结构注释数据(GTF文件)对VCF文件中的SNP/InDel信息进行注释,即是否能够对基因编码蛋白造成影响,包括SNP的突变类型和突变位置,氨基酸的变异类型和效应等。
(4)、GWAS:使用软件GAPIT(3.1.0)中的CMLM模型(compressed mixed linearmodel)对性状进行关联分析。
2.4研究结果
SNP质控后,获得549211个合格的SNP用于全基因组关联分析,关联分析时基于贝叶斯信息准则(Bayesian information criterion,BIC)的模型选择,找到GWAS模型中最优的PCs数量,用以拟合最优的性状因子。玉米穗行数性状的GWAS分析结果的见图3和图4,图3是关联分析结果的曼哈顿图,X轴是每个SNP所在的基因组上的位置,Y轴为CMLM模型下每个SNP位点P值的以10为底的负对数。图4是关联分析的QQ图,Y轴是观察到P值以10为底的负对数,X轴是假设P值服从均匀[0,1]分布,所预期观察的P值以10为底的负对数。
当检出的SNP的P值小于10-4时,我们认为这个SNP达到了基因组水平的显著,Zm00001d022502基因的内含子区域检出1个SNP位点符合上述条件,该SNP位于玉米第7号染色体179016330位置,Zm00001d019317基因编码区检出1个SNP位点,该变异为氨基酸的同义突变,位于玉米的第7号染色体的27572145位,生物信息学功能注释表明它们分别是(Exocyst complex component SEC8)和(Cellulose synthase-8)基因。SEC8是构成Exocyst复合体的一个亚基,Exocyst复合体参与了细胞的极性生长和形态建成等多种重要的细胞生物学过程,Cellulose synthase-8编码纤维素合酶复合体的一个亚基,参与纤维素的合成,结果详见表1。
Figure BDA0002890995360000061
实施例3
检出显著位点不同基因型的组间比较
3.1 Zm00001d022502基因Chr7:179016330位点组间比较
该位点包括三种基因型即G/G、A/A、A/G,不同基因型样本的穗行数分布的箱形图见图5。G/G组中位数为14.88行、下四分位数Q1为13.68行、上四分位数Q3为16.29行;A/A组中位数为14.15行、下四分位数Q1为13.14行、上四分位数Q3为14.37行;A/G组中位数为14.22行、下四分位数Q1为13.25行、上四分位数Q3为15.00行。
不同基因型组间表型均值差异的t测验结果见表2,由表2可知G/G与A/A组间差异极显著(P=0.0007),组间均值差为1.163行;G/G与A/G之间差异极显著(P<0.0001),组间均值差为0.954行;G/G与A/A+A/G之间差异极显著(P<0.0001),组间均值差为0.981行。因此,基因型G/G是穗行数更多的极显著分子标记;基因型A/A和A/G是穗行数更少的极显著分子标记。
表2 Zm00001d022502基因Chr 7:179016330位点穗行数的组间均值比较
Figure BDA0002890995360000071
3.2 Zm00001d019317基因Chr7:27572145位点组间比较
该位点包括三种基因型即C/C、T/T、C/T,不同基因型样本的穗行数分布的箱形图见图6。C/c组中位数为14.66行、下四分位数Q1为13.55行、上四分位数Q3为16.00行;T/T组中位数为16.00行、下四分位数Q1为14.44行、上四分位数Q3为16.88行;C/T组中位数为15.88行、下四分位数Q1为15.11行、上四分位数Q3为15.88行。
不同基因型组间表型均值差异的t测验结果见表3,由表3可知C/C与T/T组间差异极显著(P=0.0015),组间均值差为1.147行;C/C与T/T+C/T组间差异极显著(P=0.0008),组间均值差为1.132行;因此,基因型C/C是穗行数更少的极显著分子标记,基因型T/T及C/T是穗行数到更多的极显著分子标记。
表3 Zm00001d019317基因Chr7:27572145位点穗行数的组间均值比较
Figure BDA0002890995360000081
序列1:
Zea mays cultivar B73 Chr 7:179016200-179016500,B73 RefGen_v4,
Figure BDA0002890995360000082
上述序列中130位的碱基R是A或G,导致供试玉米自交系群体基因多态性及穗行数性状极显著差异。
序列2:
Zea mays cultivar B73 Chr7:27572000-27572300 B73 RefGen_v4,
Figure BDA0002890995360000083
上述序列中146位的碱基Y是C或T,导致供试玉米自交系群体基因多态性及穗行数性状极显著差异。
                      序列表
申 请 人:吉林大学
发明名称:与玉米穗行数相关的SNP分子标记及其应用
SEQ ID NO.1的序列
   (i)序列特征:(A)长度:301bp, Chr7:179016200-179016500;(B)类型:核苷酸;(C)链性:单链。
   (ii)分子类型:核苷酸
   (iii)序列描述:SEQ ID NO.1
1 GAGCTTCAGG TGGATGATGA GCTGGACGGT GTGACGGCGC CGTTGTCGGA TGCGGTGCCC
61 AGAACAACCC GAGAGTCGCC GGCGTTGGCG ACGACCATGA GGTCCCCTAT TTGAAGATGG
121 ACAGCGCGGT RCAGCCGCTC TGGACCGCGT CCAAGCGACG GCTGCGCCGG AGCTTGCCGA
181 ACACAGCGAC GCATGCGGTC ACGTAGTACT GCTTCCAGAG GTCGAACTGG CAGTCGCCAA
241 GCTTCTTTTC ATCGTCGATG AGCAACGTCA ACACGAGCGC CTCCTGTCAG TGGTGTTTGT
301 T
SEQ ID NO.2的序列
   (i)序列特征:(A)长度:301bp,Chr7:27572000-27572300;(B)类型:核苷酸;(C)链性:单链。
   (ii)分子类型:核苷酸
   (iii)序列描述:SEQ ID NO.2
1 TGATCGTCCA CCTGTACCCG TTCCTCAAGG GTCTGGTGGG GAGGCAGAAC AGGACGCCGA
61 CGATCGTCAT CGTCTGGTCC ATCCTGCTGG CCTCGATCTT CTCGCTCCTG TGGGTCCGCG
121 TCGACCCGTT CCTCGCCAAG AGCAAYGGCC CGCTCCTGGA GGAGTGTGGC CTGGACTGCA
181 ACTGAAGTGG GGGCCCCCTG TCACTCGAAG TTCTGTCACG GGCGAATTAC GCCTGATTTT
241 TTGTTGTTGT TGTTGTTGGA ATTCTTTGCT GTAGATAGAA ACCACATGTC CACGGCATCT
301 C

Claims (2)

1.与玉米穗行数相关的SNP分子标记在玉米穗行数性状辅助选择中的应用,所述与玉米穗行数相关的SNP分子标记,位于玉米第7号染色体Zm00001d022502基因的内含子区,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,序列131位的碱基R为A或G,其中基因型G/G为穗行数多的极显著分子标记;基因型A/A和A/G为穗行数少的极显著分子标记。
2.与玉米穗行数相关的SNP分子标记在玉米果穗行粒数性状辅助选择中的应用,所述与玉米穗行数相关的SNP分子标记,位于玉米第7号染色体Zm00001d019317基因的编码区,其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,序列146位的碱基Y为C或T,其中基因型C/C为穗行数少的极显著分子标记,基因型T/T及C/T为穗行数多的极显著分子标记。
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