CN106319063B - 一种利用prss2基因标记检测牛胴体肉质性状的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用PRSS2基因标记检测牛胴体肉质性状的方法,其方法为:第一步:DNA的提取;第二步:扩增牛PRSS2基因片段;第三步:找到多态性的位点;第四步:对单个样品进行测序;第五步:对筛查获得的SNPs进行连锁分析及单倍型分析。有益效果:本发明利用PRSS2基因的单核苷酸多态性及突变型来作为检测肉牛胴体及肉质性状遗传标记的方法,为遗传工作者早期选育优质牛群及改善肉品质奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测牛胴体肉质性状的方法,特别涉及一种利用PRSS2基因标记检测牛胴体肉质性状的方法。
背景技术
当前,SNP技术作为当前应用最广泛的遗传标记技术,在动物遗传育种研究方面发挥着重要作用。SNPs的主要检测方法主要有DNA直接测序以及限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(RFLP-PCR)等。针对此两种方法,DNA直接测序检测SNPs的方法更为简单、准确,适用于大群体动物样本的检测。
中国西门塔尔牛是我国引进后不断改良培育的大型乳肉兼用品种,具有其独特的生产性能和良好的肉用性状,表现出了巨大的优势和发展潜力。随着人类生活水平的不断提高,对高档优质牛肉的要求也越来越高。为提高牛肉品质,从基因角度,利用分子的遗传标记作为研究牛肉品质性状的主要手段,进一步提高牛群的选育。
PRSS2(protease,serine,2)基因是属于胰蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶,编码阴离子胰蛋白酶原,一部分的胰蛋白酶基因位于T细胞受体β链上,这种蛋白是在胰液中发现的,基因上调是胰腺炎的典型特征。该基因在生物有机体中发挥着重要的作用。有研究发现,PRSS2可以激活尿激酶原促进卵巢肿瘤的生长发育,这也暗示了PRSS2可以促进肿瘤细胞的侵袭和转移。最新研究发现,丝氨酸蛋白酶能够消化类风湿性关节滑膜组织中的Ⅱ型三螺旋胶原蛋白,可能促进软骨基质中Ⅱ型胶原蛋白降解。进而,研究PRSS2基因功能与调控作用机制是具有重要意义的。同时,根据本课题组前期的转录组学研究结果,PRSS2基因可能与牛的肉质及胴体性状有关。动物的脂肪过度沉积会严重影响肉品质和人类自身健康。因此,进一步研究PRSS2基因是否对牛的脂代谢有影响是非常重要的。目前对PRSS2基因的研究大多数表现在疾病和免疫方面,对以牛为对象的相关研究还相对较少,对于PRSS2基因与中国西门塔尔牛相关性性状的研究目前还鲜有报道。
肉牛胴体及肉质的相关性状是作为肉品质分析的重要指标,是衡量肉质好坏的重要标准。本发明利用PRSS2基因标记来作为检测肉牛胴体及肉质性状的方法,为遗传工作者的早期选育及改善肉品质奠定基础。
发明内容
本发明的目的是为了利用PRSS2基因与中国西门塔尔牛相关性状的研究问题而提供的一种利用PRSS2基因标记检测牛胴体和肉质性状的方法。
本发明提供的利用PRSS2基因标记检测牛胴体肉质性状的方法,其方法如下所述:
第一步:采取牛的血液进行全基因组DNA的提取,利用琼脂糖凝胶电泳检查DNA的质量;
第二步:以牛全基因组DNA为模板,以引物A为引物进行PCR,扩增牛PRSS2基因片段;
引物A为F:5‘CCACTCTGGGGCTCTCTTTA 3’;
R:5‘GATCTTGTCATCGTCGTCCG 3’;
第三步:用全基因组DNA进行混池PCR,找到多态性的位点,PCR的反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,61℃退火30s,72℃延伸60s,35个循环;延伸72℃6min,最后16℃保存;
第四步:找到多态性位点后,对单个样品进行测序,根据测序结果进行多态性关联分析:
根据PRSS2引物对A的PCR测序结果,找到5个SNP位点分别是PRSS2基因第1内含子SNP 1,即:I1-521G>A突变位点,PRSS2基因第1内含子SNP 2,即:I1-611C>G突变位点,PRSS2基因第1内含子SNP 3,即:I1-668G>A突变位点,PRSS2基因第1内含子SNP 4,即:I1-710G>A突变位点,PRSS2基因第1内含子SNP 5,即:I1-819A>G突变位点。
第五步:对筛查获得的SNPs进行连锁分析及单倍型分析,发现SNP 4,即I1-710G>A处与SNP 5,即I1-819A>G处两个多态性位点间强连锁,即D’=0.979,r2=0.886,同时形成了3种单倍型,分别为GA 0.659、AG 0.315、GG 0.022。
本发明的有益效果:
本发明通过对部分牛的全基因组DNA进行PCR混池扩增,并通过直接测序的方法检测SNPs,发现了5个SNP位点。同时对牛群体的SNPs进行了基因分型和基因频率分析以及与牛胴体和肉质性状的关联分析。提供了一种能够在DNA水平上筛查和检测与牛胴体及肉质性状密切相关基因的分子标记,应用于牛的分子育种及早期选育。同时,本发明也发现,这些SNP位点间也存在着高度的连锁性。本发明利用PRSS2基因的单核苷酸多态性及突变型来作为检测肉牛胴体及肉质性状遗传标记的方法,为遗传工作者早期选育优质牛群及改善肉品质奠定基础。
附图说明
图1为本发明实施例中的中国西门塔尔牛PRSS2基因引物对A的PCR产物1.2%的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为GG型PRSS2基因第1含子SNP 1(I1-521G>A)突变位点测序检测图。
图3为GA型PRSS2基因第1内含子SNP 1(I1-521G>A)突变位点测序检测图。
图4为CC型PRSS2基因第1内含子SNP 2(I1-611C>G)突变位点测序检测图。
图5为CG型PRSS2基因第1内含子SNP 2(I1-611C>G)突变位点测序检测图。
图6为GG型PRSS2基因第1内含子SNP 2(I1-611C>G)突变位点测序检测图。
图7为GG型PRSS2基因第1内含子SNP 3(I1-668G>A)突变位点测序检测图。
图8为GA型PRSS2基因第1内含子SNP 3(I1-668G>A)突变位点测序检测图。
图9为AA型PRSS2基因第1内含子SNP 3(I1-668G>A)突变位点测序检测图。
图10为AA型PRSS2基因第1内含子SNP 4(I1-710G>A)突变位点测序检测图。
图11为GG型PRSS2基因第1内含子SNP 4(I1-710G>A)突变位点测序检测图。
图12为GA型PRSS2基因第1内含子SNP 4(I1-710G>A)突变位点测序检测图。
图13为AA型PRSS2基因第1内含子SNP 5(I1-819A>G)突变位点测序检测图。
图14为GG型PRSS2基因第1内含子SNP 5(I1-819A>G)突变位点测序检测图。
图15为GA型PRSS2基因第1内含子SNP 5(I1-819A>G)突变位点测序检测图。
图16为PRSS2基因的5个SNP位点之间的强连锁效应图。
具体实施方式
试验材料与方法
试验材料
1.1试验动物
以中国西门塔尔牛群体为检测对象,选用内蒙古乌拉盖地区某大型牛场牛群,采用静脉采血的方式进行样本的采集。
1.2试验试剂
琼脂糖(BIOWEST);PCR引物于北京金唯智生物公司合成;基因组血液提取试剂盒、2×Taq PCR Master mix、DNA Marker 2000购自TIANGEN公司。
1.3DNA分析软件:
PCR引物设计软件:Primer Premier 5;
数据分析软件:IBM SPSS statistics 19;
连锁分析软件:HaploView
2.试验方法
本试验采用的TIANGEN公司血液基因组DNA提取试剂盒对中国西门塔尔牛的血液进行的全基因组DNA提取,并进行编号处理。设计引物,以所提取的DNA为模板进行PCR扩增,测序发现SNP位点后,对单个样品的PCR产物进行测序。根据其测序结果进行连锁反应及关联分析。下面是对本发明做的进一步详细描述,所述仅是对本发明的解释而不是限定。
2.1全基因组DNA的提取,按照TIANGEN公司血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作,最后用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量,置于-80℃保存备用。
2.2PRSS2基因PCR扩增的引物设计,根据Ensembl数据库(ENSBTAT00000028731)提供的牛PRSS2基因序列,应用Primer Premier 5.0软件设计引物,并由北京金唯智生物技术有限公司合成。
引物序列为:PRSS2-F:5‘CCACTCTGGGGCTCTCTTTA 3’PRSS2-R:5‘GATCTTGTCATCGTCGTCCG 3’将所设计的引物进行PCR扩增,经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图1所示,扩增的片段大小与目的基因的大小相符,条带清晰,无杂带,表明所设计的引物可用于后续试验。反应体系为40ul体系,见表1;反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,61℃退火30s,72℃延伸60s,35个循环;延伸72℃6min,最后16℃保存。
表1、PCR反应体系:
体系成分 | 体积(μl) |
2xPCR Master Mix | 20 |
上游引物 | 1 |
下游引物 | 1 |
灭菌超纯水(五馏水) | 14 |
DNA模板 | 4 |
总体积 | 40 |
2.3 PCR混池扩增产物测序
将每50个不同模板的PCR扩增产物进行混合,送到北京金唯智测序,然后对其测序结果进行分析,找出SNP位点。根据PRSS2引物对A的PCR测序结果,找到5个SNP位点,分别是PRSS2基因第1内含子SNP 1,即:I1-521G>A突变位点,PRSS2基因第1内含子SNP 2,即:I1-611C>G突变位点,PRSS2基因第1内含子SNP 3,即:I1-668G>A突变位点,PRSS2基因第1内含子SNP 4,即:I1-710G>A突变位点,PRSS2基因第1内含子SNP 5,即:I1-819A>G突变位点。
2.4直接测序检测牛PRSS2基因的单核苷酸多态性,将单个样品都进行PCR扩增,送到北京金唯智测序,反应体系和反应程序与混池扩增相同。对每一个样品及基因型进行分析,结果发现:
对于SNP 1,即:I1-521G>A突变位点,其中GG野生型有102头,纯合突变型AA有0头,GA型有14头,共检测116头中国西门塔尔牛的基因组DNA。GG的基因型频率为0.8793,AA的基因型频率为0,AG的基因型频率为0.1207,G等位基因频率为0.9397,A等位基因频率为0.0603;因此G等位基因占优势,在检测的116头西门塔尔牛中,共有两种基因型,分别为野生型GG和杂合突变型GA,其中以野生型GG为主要的基因型,没有检测到AA纯合突变基因型,这可能是由于在检测的过程中检测样本的个体数不够充足,而导致没有发现AA基因型的存在,也可能是在遗传的过程中,AA基因型没有稳定的遗传下来而逐渐的被淘汰。
对于SNP2,即:I1-611C>G突变位点,其中CC野生型有31头,CG型有62头,GG型有23头,共检测116头中国西门塔尔牛的基因组DNA。CC的基因型频率为0.2672,CG的基因型频率为0.5345,GG的基因型频率为0.1983,C等位基因频率为0.5345,G等位基因频率为0.4655;因此C等位基因占优势,以杂合突变型CG为主要的基因型,且符合哈代温伯格平衡。
对于SNP3,即:I1-668G>A突变位点,其中GG型有70头,AA型有3头,AG型有43头,共检测116头中国西门塔尔牛的基因组DNA。GG的基因型频率为0.6034,AA的基因型频率为0.0259,AG的基因型频率为0.3707,G等位基因频率为0.7888,A等位基因频率为0.2112;因此G等位基因占优势,以野生型GG为主要的基因型,且符合哈代温伯格平衡。
对于SNP 4,即:I1-710G>A突变位点,其中GG野生型有47头,AG型有64头,AA型有5头,共检测116头中国西门塔尔牛的基因组DNA。GG的基因型频率为0.4052,AA的基因型频率为0.0431,AG的基因型频率为0.5517,G等位基因频率为0.6810,C等位基因频率为0.3190;因此G等位基因占优势,以杂合突变型AG为主要的基因型,且符合哈代温伯格平衡。
对于SNP 5,即:I1-819A>G突变位点,其中AA野生型有46头,AG型有62头,GG型有8头,共检测116头中国西门塔尔牛的基因组DNA。AA的基因型频率为0.3966,AG的基因型频率为0.5345,GG的基因型频率为0.0690,A等位基因频率为0.6638,G等位基因频率为0.3362;因此A等位基因占优势,以杂合突变型AG为主要的基因型,且符合哈代温伯格平衡。
3.PRSS2基因5个SNP位点与西门塔尔牛性状之间的相关性分析
通过分析发现PRSS2 SNP 1位点与中国西门塔尔牛的毛重、头重、胴体重、屠宰率、净骨重、前蹄重、后蹄重、皮重、瘤网皱胃、瓣胃、心、肝、肺、肾、肾脏脂肪、牛鞭、脾脏、胴体胸深、后腿围、背膘、大理石花纹、眼肌面积等肉质及胴体相关性状进行分析后无显著相关关系。而其他4个位点分别与相关肉质性状及胴体性状相关,如表2、3、4、5所示。
表2 PRSS2基因SNP 2与中国西门塔尔牛肉质及胴体性状之间的相关性分析
注:同一个性状在平均数±标准误一栏里用不同字母标注表示具有显著性差异(P<0.05),同一个性状平均数±标准误一栏里用相同字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
表3 PRSS2基因SNP 3与中国西门塔尔牛肉质及胴体性状之间的相关性分析
注:同一个性状在平均数±标准误一栏里用不同字母标注表示具有显著性差异(P<0.05),同一个性状平均数±标准误一栏里用相同字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
表4 PRSS2基因SNP 4与中国西门塔尔牛肉质及胴体性状之间的相关性分析
注:同一个性状在平均数±标准误一栏里用不同字母标注表示具有显著性差异(P<0.05),同一个性状平均数±标准误一栏里用相同字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
表5 PRSS2基因SNP 5与中国西门塔尔牛肉质及胴体性状之间的相关性分析
注:同一个性状在平均数±标准误一栏里用不同字母标注表示具有显著性差异(P<0.05),同一个性状平均数±标准误一栏里用相同字母标注表示差异不显著(P>0.05)。
4.PRSS2基因5个SNP位点间连锁反应及单倍型分析
连锁不平衡(LD)又称为等位基因关联,几个常用于度量LD的符号中,最重要的是D’和r2。有专家指出:当D’和r2的值为零时,连锁完全平衡,D’和r2的值为1时,连锁完全不平衡,而D’<1时,D’的数值表征多大程度的连锁不平衡,很难做出准确判断,同时D’的大小也受样品量大小的影响,在统计学上D’值仅仅暗示重组发生率较低,并不适合于度量LD。在连锁不平衡软件中引用tagger,一般以r2>0.8作为两个位点间存在明确的连锁不平衡。更有专家提出:选择D’和r2均>0.8的位点为强连锁位点。以此为依据,通过Haploview软件对PRSS2基因的SNPs位点进行连锁分析,在D’值95%可信区间内构建单倍域(haplotypeblock),如图16所示,结果发现I1-521G>A处与I1-611C>G处两个SNPs位点间连锁(D’=1,r2=0.074),I1-611C>G处与I1-710G>A处两个SNPs位点间连锁(D’=0.905,r2=0.44),I1-611C>G处与I1-819A>G处两个SNPs位点间连锁(D’=0.913,r2=0.485),但连锁程度较弱,I1-710G>A处与I1-819A>G处两个SNPs位点间强连锁(D’=0.979,r2=0.886),并且在此两位点间构建了单倍结构域,共有三个单倍型,分别为GA(0.659)、AG(0.315)GG(0.022),该单倍型可作为分子标记,应用于动物育种的早期筛查。
Claims (1)
1.一种利用PRSS2基因标记检测西门塔尔牛肉质性状的方法,其特征在于:以引物AF:5’CCACTCTGGGGCTCTCTTTA3’;R:5’GATCTTGTCATCGTCGTCCG3’为引物进行PCR扩增牛PRSS2基因片段,对单个样品进行测序,找到PRSS2基因I1-710G>A突变位点和PRSS2基因I1-819A>G突变位点,进行多态性关联分析发现:该突变位点的基因型与牛肉质性状中眼肌面积显著相关;
对上述突变位点进行连锁分析及单倍型分析,发现PRSS2基因I1-710G>A与I1-819A>G两个多态性位点间强连锁,并形成了3种单倍型,分别为GA、AG和GG。
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PB01 | Publication | ||
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C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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