CN104278094B - 一种猪fto基因编码区a227g单碱基突变的检测方法及应用 - Google Patents

一种猪fto基因编码区a227g单碱基突变的检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种猪FTO基因A227G碱基突变的检测方法及应用，属基因工程技术领域。根据GenBank数据库猪FTO基因序列设计特异性引物，对待检测猪基因组进行PCR扩增；分离、纯化扩增产物，获得特异核酸；使用限制性内切酶 HhaI，对PCR扩增产物进行RFLP（酶切）分析，根据酶切后PCR产物的琼脂糖电泳条带，判断待检猪是否存在A227G单核苷酸碱基突变。且该突变中的A等位基因可应用于猪育种生产中，为提高猪产仔数的有利等位基因。本发明对提高猪产仔数的分子育种提供依据，同时为猪的早期胚胎丢失机理研究提供基因工程技术帮助。

Description

一种猪FTO基因编码区A227G单碱基突变的检测方法及应用
1所属技术领域
本发明涉及一种猪FTO基因编码区单核苷酸突变(A227G碱基突变)的检测方法及应用，属基因工程技术领域。用此方法，能快速检测到猪FTO基因的单核苷酸碱基突变，为猪产仔数性状的分子育种研究提供帮助。
2背景技术
猪产仔数是一个重要的繁殖性状和经济性状，而影响猪产仔数的一个关键因素是胚胎附植，因为很多的胚胎在这个过程中死亡，而这些胚胎的死亡是导致产仔数下降的一个重要原因。
脂肪肥胖相关基因(fat mass and obesity associated gene,FTO)是2007年发现的与人类肥胖相关的基因，在人类和小鼠上的研究表明该基因在控制食欲和能量消耗方面具有重要作用。
除了影响脂肪代谢以外，FTO还影响机体的繁殖性能。人和大鼠中的研究表明，胎盘组织中的FTO基因在子宫内环境与胎儿生长发育之间发挥了桥梁作用；在小鼠中，原位杂交和Real-time qPCR的结果表明，FTO在胚胎组织中表达量很高；在山羊中，研究发现妊娠第110天时，胎盘组织中的FTO表达与胎儿体重有很强的相关性；在荷斯坦牛中，FTO多态性影响乳脂。本人前期研究发现，FTO在猪的繁殖组织中也有很高的表达量，推测其可能影响猪的繁殖活动，从而进一步影响猪产仔数。
针对猪FTO基因碱基突变的检测技术较多，包括PCR-RFLP、PCR-SSCP、基因组直接测序、实时荧光定量PCR技术等。较常规简易的实施方式为：
1)检索GenBank数据库中猪FTO基因的序列，以该序列为模板，应用Oligo，Primer等生物软件设计引物，进行PCR扩增。
2)对PCR反应体系和条件进行优化，检测产物浓度和质量。
3)应用胶回收试剂盒，对PCR产物进行回收、纯化。
4)对纯化的PCR产物进行测序，然后用DNAMAN等核酸分析软件比对各样本PCR产物序列，寻找单核苷酸碱基突变。
5)利用生物信息学方法分析碱基突变是否引起编码氨基酸和蛋白结构的变化。
目前有关猪FTO基因影响猪产仔数的报道还未有报道。鉴于FTO在动物繁殖活动过程中的生物学功能，本发明根据GenBank数据库猪FTO基因cDNA序列设计引物，扩增出含A227G位点的PCR产物，并寻找到合适的限制性内切酶对192头母猪基因组进行了PCR-RFLP和测序分析，最后将A227G位点基因型与猪产仔数进行了关联分析，利用猪FTO基因碱基突变的检测技术找到了猪高产仔数的有利等位基因。这些结果将为猪产仔数分子育种提供基因工程技术帮助。
3发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供一种猪FTO基因A227G碱基突变的检测及应用方法，有助于研究猪FTO基因的分子结构、功能及应用，为猪高产仔数的分子育种提供依据。
技术方案
一种猪FTO基因编码区A227G单碱基突变的非诊断的检测方法，其特征在于如下步骤：
1)据GenBank数据库猪FTO基因序列设计特异引物：
正义引物5’-TACCCTAAGCTAATTCTCCGA-3’
反义引物5’-GAGATACTGGCGTGAGCAAA-3’
应用上述引物对待检测猪基因组进行PCR扩增，PCR扩增产物长度152bp；
2)使用限制性内切酶HhaI，对PCR扩增产物进行RFLP酶切分析，酶切位点如下，
5'...GCG︱C...3'，
3'...C︱GCG...5'：序列中的“︱”为酶切位置
使用HhaI内切酶对上述PCR产物(152bp)进行RFLP(酶切)分析，根据酶切后PCR产物的琼脂糖电泳条带的条数和大小，判断待检猪FTO基因A227G单核苷酸碱基突变的基因型:只有一条152bp条带的为AA基因型(无突变型)、有两条条带(152bp和78bp)的为AG基因型(突变杂合型)、只有一条78bp的为GG基因型(完全突变型)(图2)。
所述一种猪FTO基因编码区A227G单碱基突变的非诊断的检测方法，其特征在于：
(1)15μLPCR反应体系：10×buffer1.5μL，10mmol/L的dNTPmix0.5μL，10pmoL/μL的上下游引物各0.5μL，10U/μL的Taq酶0.5μL，50ng/μL的模板DNA1.0μL，ddH2O和ddH2O10.5μL。
(2)PCR反应程序：94℃预变性5min；35个循环：94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s；72℃终延伸7min；4℃保存；
检测：取3μlPCR产物，加1μl10×Loadingbuffer于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
其中，扩增片段长度为152bp。
所述一种猪FTO基因编码区A227G单碱基突变的非诊断的检测方法可以在动物育种方面得到应用，尤其在提高产猪仔数的方面应用,其中：FTO基因A227G位点处，A为猪高产仔数的有利等位基因，G为不利等位基因。
有益效果：
目前有关猪FTO基因影响猪产仔数的报道还未有报道。鉴于FTO在动物繁殖活动过程中的生物学功能，本发明根据GenBank数据库猪FTO基因cDNA序列设计引物，扩增出含A227G位点的PCR产物，并寻找到合适的限制性内切酶对192头母猪基因组进行了PCR-RFLP和测序分析，最后将A227G位点基因型与猪产仔数进行了关联分析，利用猪FTO基因碱基突变的检测技术找到了猪高产仔数的有利等位基因。这些结果将为猪产仔数分子育种提供基因工程技术帮助。
本发明根据GenBank数据库猪FTO基因序列设计引物，对中外不同品种猪FTO基因全长编码序列进行特异性PCR扩增，找寻可能存在的单核苷酸碱基突变，并对FTO的A227G位点基因型与猪产仔数进行了关联分析，并寻找到该位点有利等位基因A。本发明针对猪FTO基因编码区的筛查，检测到A227G单核苷酸碱基突变，虽然没有直接引起编码氨基酸的改变，但与其连锁不平衡的分子标记可能会引起氨基酸的改变。
本发明将为猪产仔数性状的分子育种研究提供基因工程技术帮助。
本发明通过研究，确定了检测猪FTO基因编码区A227G碱基突变合适的特异性引物序列，优化的PCR扩增体系及反应条件，明确了猪FTO基因有效的单核苷酸突变碱基及相应的编码氨基酸改变，分析碱基突变异致的编码氨基酸及蛋白活性、基因功能的改变，并找到了FTO A227G突变位点的有利等位基因A，有望使该位点成为猪产仔数育种的分子遗传标记。
4附图说明
图1本发明实施的不同猪血液组织样提取的基因组的琼脂糖凝胶电泳图谱
图2 FTO基因A227G突变位点的PCR扩增产物琼脂电泳结果
图3突变位点测序结果示例
5具体实施方式
本发明一种猪FTO基因编码区A227G单碱基突变的检测方法应用范围广，任何品种猪都可以用来检测。
下面结合实施例进一步阐述本发明。本实施例仅用于解释本发明便不限于本发明范围。实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照分子克隆实验手册和制造厂商建议条件。
实施例1
猪FTO基因组的获取及引物设计
用高盐法提取192头猪(品种为苏钟猪，公知公用)血液中的基因组，紫外分光光度计和琼脂糖电泳技术分别检测其浓度和纯度。
根据GenBank数据库猪FTO基因序列(NM_001112692)，使用Oligo6.0设计特异性引物，进行PCR扩增。引物序列如下：
正义引物5’-TACCCTAAGCTAATTCTCCGA-3’
反义引物5’-GAGATACTGGCGTGAGCAAA-3’
实施例2
PCR扩增及产物纯化
应用上述引物，以猪基因组为模板，进行PCR扩增。
PCR反应体系(15μL)：10×buffer1.5μL，dNTPmix(10mmol/L)0.5μL，上下游引物(10pmoL/μL)各0.5μL，Taq酶(10U/μL)0.5μL，模板DNA(50ng/μL)1.0μL，ddH2O至10.5μL。
PCR反应程序：94℃预变性5min；35个循环(94℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸30s)；72℃终延伸7min；4℃保存。检测：取3μlPCR产物，加1μl10×Loadingbuffer于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
其中，PCR产物长度为152bp(图1)。应用核酸纯化试剂盒，参照说明书对PCR产物进行分离、纯化。
实施例3
利用PCR-RFLP(酶切技术)检测FTO基因编码区A227G碱基突变
根据碱基突变位置寻找到合适的限制性内切酶，如下：HhaI(TAKARA)，它的酶切位点如下
5'...GCG'C...3'(序列中的'为酶切位置)
3'...C'GCG...5'(序列中的'为酶切位置)
使用HhaI内切酶对上述PCR产物(152bp)进行RFLP(酶切)分析，完全酶切后片段成为两段：74bp和78bp。(图2)，根据酶切后PCR产物的琼脂糖电泳条带的条数和大小，判断待检猪FTO基因A227G单核苷酸碱基突变的基因型:只有一条152bp条带的为AA基因型(无突变型)、有两条条带(152bp和78bp)的为AG基因型(突变杂合型)、只有一条78bp的为GG基因型(完全突变型)(图2)。
同时使用直接测序技术对随机挑选的原始PCR产物(152bp)进行测序，以验证RFLP结果(图3)。
RFLP结果发现，在被检测的192头苏钟猪母猪实验样本中，FTO基因cDNA序列第227bp位点碱基突变如下：48头AA基因型(无突变)、109头AG基因型(杂合型)和35头GG基因型(突变型)，且该突变位点的基因型频率和基因频率处于Hardy-Weinberg平衡分布(表1)。
表1苏钟猪群中检测到的FTO基因编码区A227G碱基突变的基因频率和基因型频率
注：χ2(df＝2)0.01＝9.21χ2(df＝2)0.05＝5.99
FTO A227G突变位点基因型与母猪产仔数关联分析结果表明，AG杂合型为优势基因型，GG纯合型为劣势基因型。即A是有利于提高猪产仔数的有益等位基因位点，G是不利于提高猪产仔数的等位基因位点。我们可以通过多留种带有A等位基因的种猪，并且适当保留(5％)G等位基因的种猪，逐步提高猪产仔数(表2)。
表2不同品种猪中FTO A227G位点基因型效应对猪产仔数的影响(最小二乘均值±标准误)
不同的小写字母上标代表显著性差异水平为P<0.05，“*”和“**”分别代表显著性差异水平为P<0.05和P<0.01。
虽然A227G碱基突变没有直接引起编码氨基酸(密码子变化：GCA→GCG；氨基酸变化：Ala→Ala，丙氨酸)的改变，但与其连锁不平衡的分子标记可能会引起氨基酸的改变，为FTO对猪胚胎附植及产仔数性状的影响研究提供技术帮助。
应当明确，在阅读本发明上述讲授内容后，相同领域技术人员可以对本发明作出各种技术修改，其等价形式同样属于本申请所附权利要求书限定范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种猪FTO基因编码区A227G单碱基突变的检测方法及应用
<130> 0
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 1
<220>
<221> 正义引物
<222> (1)..(21)
<223>
<400> 1
taccctaagc taattctccg a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 反义引物
<222> (1)..(20)
<223>
<400> 2
gagatactgg cgtgagcaaa 20

Claims (5)

1.一种猪FTO基因编码区A227G单碱基突变的非诊断的检测方法，其特征在于如下步骤：
1)据GenBank数据库猪FTO基因序列设计特异引物：
正义引物5’-TACCCTAAGCTAATTCTCCGA-3’
反义引物5’-GAGATACTGGCGTGAGCAAA-3’
应用上述引物对待检测猪基因组进行PCR扩增，PCR扩增产物长度152bp；
2)使用限制性内切酶HhaI，对PCR扩增产物进行RFLP酶切分析，酶切位点如下，
5'...G C G︱C...3'，
3'...C︱G C G...5'：序列中的“︱”为酶切位置
使用HhaI内切酶对上述152bp的PCR产物进行RFLP酶切分析，根据酶切后PCR产物的琼脂糖电泳条带的条数和大小，判断待检猪FTO基因A227G单核苷酸碱基突变的基因型:
只有一条152bp条带的为AA基因型,为无突变型；
有152bp和78bp两条条带的为AG基因型,为突变杂合型；
只有一条78bp条带的为GG基因型,为完全突变型。
2.根据权利要求1所述一种猪FTO基因编码区A227G单碱基突变的非诊断的检测方法，其特征在于：
(1)15μL PCR反应体系：10×buffer 1.5μL，10mmol/L的dNTP mix 0.5μL，10pmoL/μL的上下游引物各0.5μL，10U/μL的Taq酶0.5μL，50ng/μL的模板DNA 1.0μL和ddH2O 10.5μL；
(2)PCR反应程序：94℃预变性5min；35个循环：94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s；72℃终延伸7min；4℃保存；
检测：取3μl PCR产物，加1μl 10×Loading buffer于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，其中，扩增片段长度为152bp。
3.权利要求1或2所述一种猪FTO基因编码区A227G单碱基突变的非诊断的检测方法在动物育种方面的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：是指在提高产猪仔数育种方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：FTO基因A227G位点处，A为猪高产仔数的有利等位基因，G为不利等位基因。
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