CN106577517B - 以肉质为目标导向的肉牛育肥方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以肉质为目标导向的肉牛育肥方法，属于肉牛生产技术领域。采用基于眼肌面积和基因标记检测的“肉质目标+眼肌面积+基因标记+公阉区分+预期出栏+持续育肥+分段调控”产肉力早期预测和肉质导向育肥技术体系。可根据客户要求，选择不同育肥模式，生产不同档次的牛肉产品（高档雪花肉、西餐红肉或大理石肉），按需生产，达到了育肥效率和效益最佳化，解决了盲目育肥和群体资源利用不充分的实践问题。实用性强。

Description

以肉质为目标导向的肉牛育肥方法

技术领域

本发明涉及肉牛生产技术领域，特别涉及一种以肉质为目标导向的肉牛育肥方法，是一种适合于指导肉牛生产的育肥新方法，具体涉及眼肌面积超声波检测、基因标记检测、分段营养调控等技术手。

背景技术

育肥牛是肉类市场中牛肉的主要供应来源。牛犊断奶后就算在肥育牛之列，我国肉用牛的肥育多为成年牛的肥育，不少地方多为老龄牛的肥育。幼年牛一面生长，一面囤肥。即在长骨架肌肉的同时也积累一定的脂肪；而成年牛肥育，主要长体宽，向宽深发展。囤积脂肪的能力很强。这是幼年、成年牛肥育的不同特点，因此不同的牛有不同的肥育技术。传统的育肥牛选择一般为体重在250kg以上、年龄在1～2周龄的未去势杂种公牛。育肥方法主要有持续育肥法与架子牛育肥法。(1)持续育肥法，在第1年即性成熟前生长最快，以后生长速度随年龄的增加而减慢，第2年增重仅为第1年增重的70％左右，第3年增重为第2年的50％左右。(2)后期集中育肥法(架子牛育肥法)，前期青贮饲料为主进行“吊架子”，故增重速度较慢，进入育肥阶段，在营养水平的影响下，生长速度较快。因此，年龄较大的牛增重快于青年牛。青年牛增重主要是增长肌肉、器官和骨骼，而老年牛的增重主要是脂肪。

在国外一般肉牛多在1.5岁体重达500kg以上屠宰为宜，但不超过2岁。我国地方品种牛成熟较晚，1.5～2岁之间增重较快，故一般在2岁左右屠宰为宜，过大造成肉的品质下降，饲料转化率低，成本提高。如果有条件，可在周岁时体重350kg左右出栏屠宰。我国肉牛业起步较晚，且无专用肉牛品种，使用肉用品种牛杂交改良地方优良品种，不但可以生产高档牛肉，而且可获得很好的经济效益。

随着不同层次的消费需求，对育肥牛的生产带来了一些问题。目前牛肉供应主要趋向于三种层次：(1)高档雪花肉。所谓“雪花”，是脂肪沉积到肌肉纤维之间，形成明显的红、白相间，状似大理石花纹的牛肉。雪花牛肉源于日本和牛，我国已涌现出一批“雪花牛肉”自主品牌，如大连的雪龙黑牛、陕西的秦宝、延边的犇福、北京的御香苑等品牌，为高档消费品。(2)西餐红肉。西餐红肉的特点是肌肉纤维粗硬、脂肪含量较高，主要供应于西餐消费者。(3)大理石肉。主要是含有大量肌间脂肪的肉类，纹理很像大理石，故得名。大理石肉肉质细嫩，含有大量人体所需的脂肪酸，肉价格适中，适合大众消费。

根据不同消费需要选择性生产，可产生雪花牛肉、西餐红肉、大理石肉；但是不是所有的牛都适合生产各种档次的牛肉。如果盲目的生产，不仅不能满足各目标需求，而且会增加饲养成本，进而造成生产中的浪费；而且，传统的肉牛育肥方法不能形成一种针对性的生产模式，很难满足现有需求，因此，迫切需要结合生产需求与生产实际，来制定一种具有目标导向的育肥技术体系，节约饲养成本，根据肉牛的实际特点进行导向生产，达到肉牛生产的效益最大化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以肉质为目标导向的肉牛育肥方法，解决了现有技术存在的盲目育肥和群体资源利用不充分等问题。本发明是一种实用性较高的肉质导向育肥技术体系，根据客户要求，选择育肥模式，达到育肥效率和效益最佳化。基于肉牛(延黄牛、草原红牛)的眼肌面积遗传力分别为0.63和0.65；6月龄眼肌面积与不同月龄的体重、眼肌面积和净肉量均呈较强的遗传相关(0.657-0.715)，进而证明了眼肌面积可以作为肉用性状早期选择的典型指标。同时根据实验发现，CAPN1+CAST复合基因型(AA/AA)、H-FABP的基因型(BB)对肌内脂肪沉积具有正效应；含GH+GHR的复合基因型(BB/AA)的个体生长发育较快。因此，本发明以眼肌面积与基因标记效应为主选性状，综合考虑公阉区分、预期出栏、持续育肥、分段调控等因素，创立了基于眼肌面积和基因标记检测的“肉质目标+眼肌面积+基因标记+公阉区分+预期出栏+持续育肥+分段调控”产肉力早期预测和肉质导向育肥技术体系。根据客户要求，选择育肥模式，达到育肥效率和效益最佳化，解决了盲目育肥和群体资源利用不充分的实践问题。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

以肉质为目标导向的肉牛育肥方法，包括如下步骤：

(1)眼肌面积检测及分类；

(2)待选基因的检测与分型；

(3)根据眼肌面积与基因分型结果，确定育肥模式；

(4)公、阉牛区分：选择对象为公牛，正常育肥；选择对象为阉牛，阉割后育肥；

(5)出栏时间：出栏时间分为：26-30月龄、16-20月龄、20-22月龄、22-24月龄4种；

(6)分段式营养调控：三段式育肥或两段式育肥。

步骤(1)所述的眼肌面积检测及分类，通过超声波技术对待测犊牛进行眼肌面积检测，计算眼肌面积数值，具体是：

(1.1)对犊牛进行保定，以确保其自然站立；

(1.2)测量时探头放上耦合剂，剪掉测量部位毛，探头直接放在体表；腰肌面积在横断面第十二、十三肋间测量，腰肌面积是一个圆周测量；在识别超声影像时首先确定皮肤界面、脂间结缔组织和背最长肌肌膜所产生的3～4条强回声影带，然后确定眼肌四周肌膜的强回声影像，以确定眼肌面积周界；观察并调节屏幕影像，调节灰度、对比度、增益度，使近场增大，远场减小，获得理想影像时即冻结影像，并加注说明资料影像打印或存贮处理；图像读取时先确定上下界即椭圆短轴，然后确定两端界点即为椭圆长轴；此时屏幕上显示的平方厘米值就是近似椭圆形的眼肌的面积；

(1.3)眼肌面积的大小范围，分为“偏大、中等偏上、其它”3个档次，对群体待测数据进行测定，计算平均值P1，选出最大值Max，进而计算最大值与平均值的平均数P2；大于等于P2的个体，归类为“偏大”；大于等于P1，小于P2的个体归类为“中等偏上”；小于P1的个体归类为“其它”。

步骤(2)所述的待选基因的检测与分型，通过PCR-SSCP技术进行3组基因，CAPN1+CAST、H-FABP、GH+GHR的检测及分型，具体是：

(2.1)引物设计：设计以下引物序列

CAPN1基因Intron14上游引物序列：GACAGGAATACAGTAGGGAC

CAPN1基因Intron14下游引物序列：GAGAACAGCTACCCAGGGAC

CAST基因Intron3上游引物序列：CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC

CAST基因Intron3下游引物序列：TACACCCTGCTTTGTCCTCCA

H-FABP基因5‘UTR上游引物序列：5’-TCTG CGTCTTTCCCAACCTA-3’

H-FABP基因5‘UTR下游引物序列：5’-GGCTCCCCAACCT GAC-3’

GH基因3‘UTR上游引物序列：5’-CACTCCCACTGTCCTTTCCTA-3’

GH基因3‘UTR下游引物序列：5’-ACTTCCTCACATGTTGGAGGC-3’

GHR基因Exon10上游引物序列：5’-TAACTTCATCGTGGACAA-3’

GHR基因Exon10下游引物序列：5’-GGAGGTATAATCTGGGAC3-3’

(2.2)根据已设计的引物，按照以下PCR反应体系和条件进行扩增

PCR反应体系：10×Ex Taq Buffer 2.5μl，dNTP Mixture(各2.5mM)2.0μl，模板DNA1.0μl，F(10pmol/μl)1.0μl，R(10pmol/μl)1.0μl，Ex Taq(5U/μl)0.25μl，ddH₂O 17.25μl，总体积25.0μl；其中，10×Ex Taq Buffer表示10倍ExTaq酶缓冲液；dNTP Mixture(各2.5mM)表示dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液，每种的浓度均为2.5mM，mM表示毫摩尔每升；F、R分别代表上下游的PCR引物；Ex Taq表示Ex Taq DNA聚合酶；ddH₂O表示双蒸水；

反应条件：95℃预变性5min后进入如下循环：94℃变性30s，60－65℃退火30-45s，72℃延伸30-45min，30-35个循环，然后72℃延伸10min，4℃保存；

(2.3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳：所有凝胶电泳均用浓度为1％琼脂糖/EB凝胶，在1×TAE Buffer下进行；10μl PCR扩增产物与1/6体积6×Loading Buffer混匀，加样至点样孔中，以7～10V/cm的电压电泳，当溴酚蓝电泳至2～4cm，在紫外灯下观察结果并用凝胶成像仪观察，照相；PCR产物条带清晰，大小符合预期设计结果，进行下一步分析；其中1×TAE缓冲液的配置：先配置50×TAE缓冲液:Tris 242g，冰乙酸57.1m1,0.5M EDTA(pH8.0)100m1，加水至1000ml，然后稀释50倍以后即可得到1×TAE缓冲液；

(2.4)扩增产物的PCR-SSCP分析：体积为40ml的非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳根据不同的扩增片段，采用浓度为30％的丙烯酰胺配成浓度为8％～12％的聚丙烯酰胺凝胶；清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干后，用大号铁夹固定，并用0.8％琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙；在100ml烧杯内加入浓度为30％丙烯酰胺12.0ml，5.0ml的浓度为50％甘油，5×TBE缓冲液10.0ml，浓度为10％过硫酸铵350μl，TEMED 8μl，加入双蒸水13.0ml，混合后迅速灌胶；当胶灌至离玻璃板上沿1.0cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚合30min，多余的丙烯酰胺4℃保存；随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺；凝胶聚合好后，拔掉梳子，向电泳槽加入1×TBE，用注射器冲洗加样孔；预电泳10min，同时准备点样；取1μlPCR产物置于PCR管中，加5μl变性Buffer，离心混匀，98℃变性10min；迅速冰浴10min，用微量注射器点样；4℃，140～180V，电泳14～16h；电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶，置于400～600ml浓度为70％的乙醇中，水浴震荡器缓慢摇匀固定10～15min；去离子水洗胶2遍，每次2min，洗去乙醇；用200ml染色液染色30min；去离子水洗胶3遍，每次2min，洗去多余的染色液；用200ml显色液显色，10～30min，当DNA条带清晰时，倒掉显色液；去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相或保存，然后进行基因分型(如图2-6所示，根据电泳速度来进行分型，条带在下面的为BB型，上面的为AA型，上下均有的为AB型)；其中，浓度为30％的丙烯酰胺的配置是29克丙烯酰胺和1克双丙烯酰胺，用蒸馏水定容100ml，过滤后使用；5×TBE缓冲液：Tris碱54g，硼酸27.5g，0.5M EDTA(pH 8.0)20ml，加水至1000ml所得；0.5M EDTA配置方法为：EDTA 186.1g溶于800m1双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌后可使用；1×TBE即5×TBE缓冲液稀释5倍后所得溶液。

步骤(3)所述的根据眼肌面积与基因分型结果，确定育肥模式，具体是：

(3.1)眼肌面积中等偏上，或检测到CAPN1+CAST(BB/AA基因型)或H-FABP(BB基因型)目标基因型的个体，用于生产高档雪花肉，育肥阉牛至26-30月龄，采取“生长发育期+营养平衡期+肉质改良期”三段式模式；

(3.2)眼肌面积偏大，或检测到GH+GHR(BB/AA基因型)目标基因型的个体，生产西餐红肉，育肥公牛至16-20月龄，采取“生长发育期+肉质改良期”两段式模式；

(3.3)其它牛生产大理石肉。

本发明的有益效果在于：与现有的传统技术相比，本发明以肉质为目标导向，发明采用一种基于眼肌面积和基因标记检测的“肉质目标+眼肌面积+基因标记+公阉区分+预期出栏+持续育肥+分段调控”产肉力早期预测和肉质导向育肥技术体系。可根据客户要求，选择不同育肥模式，生产不同档次的牛肉产品(高档雪花肉、西餐红肉或大理石肉)，按需生产，达到了育肥效率和效益最佳化，解决了盲目育肥和群体资源利用不充分的实践问题。实用性强。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明的眼肌面积检测示意图；

图2为本发明的CAPN1基因检测分型结果(BB型为目标基因型)；

图3为本发明的CAST基因检测分型结果(AA型为目标基因型)；

图4为本发明的H-FABP基因检测分型结果(BB型为目标基因型)；

图5为本发明的GH基因检测分型结果(BB型为目标基因型)；

图6为本发明的GHR基因检测分型结果(AA型为目标基因型)。

具体实施方式

下面结合附图进一步说明本发明的详细内容及其具体实施方式。

参见图1至图6所示，本发明的以肉质为目标导向的肉牛育肥方法，包括如下步骤：

(1)眼肌面积检测及分类，通过超声波技术对待测犊牛进行眼肌面积检测，计算眼肌面积数值，具体是：

(1.1)对犊牛进行保定，以确保其自然站立；在将动物移至保定架或保定栏的过程中，要尽量减少产生应激反应。

(1.2)测量时探头放上耦合剂，剪掉测量部位毛，探头直接放在体表；腰肌面积在横断面第十二、十三肋间测量，腰肌面积是一个圆周测量；在识别超声影像时首先确定皮肤界面、脂间结缔组织和背最长肌肌膜所产生的3～4条强回声影带，然后确定眼肌四周肌膜的强回声影像，以确定眼肌面积周界；观察并调节屏幕影像，适当调节灰度、对比度、增益度，尽量使近场增大，远场减小，获得理想影像时即冻结影像，并加注说明资料影像打印或存贮处理；图像读取时先确定上下界即椭圆短轴，然后确定两端界点即为椭圆长轴；此时屏幕上显示的平方厘米值就是近似椭圆形的眼肌的面积；如图1所示。

(1.3)眼肌面积的大小范围，分为“偏大、中等偏上、其它”3个档次，对群体待测数据进行测定，计算平均值P1，选出最大值Max，进而计算最大值与平均值的平均数P2；大于等于P2的个体，归类为“偏大”；大于等于P1，小于P2的个体归类为“中等偏上”；小于P1的个体归类为“其它”。

(2)待选基因的检测与分型，通过PCR-SSCP技术进行3组基因，CAPN1+CAST、H-FABP、GH+GHR的检测及分型，具体是：

(2.1)引物设计：设计以下引物序列

CAPN1基因Intron14上游引物序列：GACAGGAATACAGTAGGGAC

CAPN1基因Intron14下游引物序列：GAGAACAGCTACCCAGGGAC

CAST基因Intron3上游引物序列：CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC

CAST基因Intron3下游引物序列：TACACCCTGCTTTGTCCTCCA

H-FABP基因5‘UTR上游引物序列：5’-TCTG CGTCTTTCCCAACCTA-3’

H-FABP基因5‘UTR下游引物序列：5’-GGCTCCCCAACCT GAC-3’

GH基因3‘UTR上游引物序列：5’-CACTCCCACTGTCCTTTCCTA-3’

GH基因3‘UTR下游引物序列：5’-ACTTCCTCACATGTTGGAGGC-3’

GHR基因Exon10上游引物序列：5’-TAACTTCATCGTGGACAA-3’

GHR基因Exon10下游引物序列：5’-GGAGGTATAATCTGGGAC3-3’

(2.2)根据已设计的引物，按照以下PCR反应体系和条件进行扩增

PCR反应体系：10×Ex Taq Buffer 2.5μl，dNTP Mixture(各2.5mM)2.0μl，模板DNA1.0μl，F(10pmol/μl)1.0μl，R(10pmol/μl)1.0μl，Ex Taq(5U/μl)0.25μl，ddH₂O 17.25μl，总体积25.0μl；其中，10×Ex Taq Buffer表示10倍ExTaq酶缓冲液；dNTP Mixture(各2.5mM)表示dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液，每种的浓度均为2.5mM，mM表示毫摩尔每升；F、R分别代表上下游的PCR引物；Ex Taq表示Ex Taq DNA聚合酶；ddH₂O表示双蒸水；

反应条件：95℃预变性5min后进入如下循环：94℃变性30s，60－65℃退火30-45s，72℃延伸30-45min，30-35个循环，然后72℃延伸10min，4℃保存；

(2.3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳：所有凝胶电泳均用浓度为1％琼脂糖/EB凝胶，在1×TAE Buffer下进行；10μl PCR扩增产物与1/6体积6×Loading Buffer混匀，加样至点样孔中，以7～10V/cm的电压电泳，当溴酚蓝电泳至2～4cm，在紫外灯下观察结果并用凝胶成像仪观察，照相，PCR产物条带清晰，大小符合预期设计结果，进行下一步分析；其中1×TAE缓冲液的配置：先配置50×TAE缓冲液:Tris 242g，冰乙酸57.1m1,0.5M EDTA(pH8.0)100m1，加水至1000ml，然后稀释50倍以后即可得到1×TAE缓冲液；

(2.4)扩增产物的PCR-SSCP分析：体积为40ml的非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳根据不同的扩增片段，采用浓度为30％的丙烯酰胺配成浓度为8％～12％的聚丙烯酰胺凝胶；清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干后，用大号铁夹固定，并用0.8％琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙；在100ml烧杯内加入浓度为30％丙烯酰胺12.0ml，5.0ml的浓度为50％甘油，5×TBE缓冲液10.0ml，浓度为10％过硫酸铵350μl，TEMED 8μl，加入双蒸水13.0ml，混合后迅速灌胶；当胶灌至离玻璃板上沿1.0cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚合30min，多余的丙烯酰胺4℃保存；随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺；凝胶聚合好后，拔掉梳子，向电泳槽加入1×TBE，用注射器冲洗加样孔；预电泳10min，同时准备点样；取1μlPCR产物置于PCR管中，加5μl变性Buffer，离心混匀，98℃变性10min；迅速冰浴10min，用微量注射器点样；4℃，140～180V，电泳14～16h；电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶，置于400～600ml浓度为70％的乙醇中，水浴震荡器缓慢摇匀固定10～15min；去离子水洗胶2遍，每次2min，洗去乙醇；用200ml染色液染色30min；去离子水洗胶3遍，每次2min，洗去多余的染色液；用200ml显色液显色，10～30min，当DNA条带清晰时，倒掉显色液；去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相或保存，然后进行基因分型(如图2-6所示，根据电泳速度来进行分型，条带在下面的为BB型，上面的为AA型，上下均有的为AB型)；其中，浓度为30％的丙烯酰胺的配置是29克丙烯酰胺和1克双丙烯酰胺，用蒸馏水定容100ml，过滤后使用；5×TBE缓冲液：Tris碱54g，硼酸27.5g，0.5M EDTA(pH 8.0)20ml，加水至1000ml所得；0.5M EDTA配置方法为：EDTA 186.1g溶于800m1双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌后可使用；1×TBE即5×TBE缓冲液稀释5倍后所得溶液。

(3)根据眼肌面积与基因分型结果，可安排不同的育肥模式(表1)：

(3.1)眼肌面积中等偏上，或检测到CAPN1+CAST(BB/AA基因型)或H-FABP(BB基因型)目标基因型的个体，用于生产高档雪花肉，育肥阉牛至26-30月龄，采取“生长发育期+营养平衡期+肉质改良期”三段式模式；

(3.2)眼肌面积偏大，或检测到GH+GHR(BB/AA基因型)目标基因型的个体，生产西餐红肉，育肥公牛至16-20月龄，采取“生长发育期+肉质改良期”两段式模式；

(3.3)其它牛生产大理石肉。

表1以肉质为目标导向的育肥模式

(4)公、阉牛区分：选择对象为公牛，正常育肥；选择对象为阉牛，阉割后育肥。

(5)出栏时间：出栏时间分为：26-30月龄、16-20月龄、20-22月龄、22-24月龄4种。

(6)分段式营养调控：三段式育肥或两段式育肥。

三段式育肥：营养方案见表2。

表2三段式调控生产日粮结构与营养水平

注：①生长发育期日粮精粗比为40:60；日粮干物质含量为63.1％，采食量为15.2kg/d·头，干物质采食量为9.6kg/d·头。

②营养平衡期日粮精粗比为30:70；日粮干物质含量为72.6％，采食量为11.4kg/d·头，干物质采食量为8.3kg/d·头。

③肉质改良期日粮精粗比为50:50；日粮干物质含量为55.2％，采食量为18.0kg/d·头，干物质采食量为9.9kg/d·头。

两段式育肥：营养方案见表3。

表3两段式调控生产日粮结构与营养水平

注：①生长发育期日粮精粗比为30:70；日粮干物质含量为69.1％，采食量为12.4kg/d·头，干物质采食量为8.6kg/d·头。

②营养平衡期日粮精粗比为40:60；日粮干物质含量为61.8％，采食量为16.0kg/d·头，干物质采食量为9.9kg/d·头。

实施例：

拟对一群小公牛体进行育肥生产，来满足市场对牛肉的不同需求，策略如下：

检测阶段：

(1)按上述方法测定不同小牛的眼肌面积，按前述方法进行归类；

(2)按上述方法检测CAPN1+CAST、GH+GHR、H-FABP基因的基因型，符合要求的画“√”。

检测结果如下：

表2待育肥群体眼肌面积及基因型检测结果

(3)根据可生产的目标，设计育肥策略，按需求进行生产分配；育肥策略(延续前检测结果表2)见表3，具体方法参见前述实施方案。

表3待育肥群体的育肥策略

说明：

(1)CAPN1+CAST(BB/AA)检测时，CAPN1的BB基因型与CAST的AA基因型同时被检出，标记“√”；GH+GHR(BB/AA)、H-FABP(BB)检测规则一致。

(2)上述需求可以根据用户需求进行调整，但需遵循以下规则：

生产雪花肉个体，也可以生产西餐红肉或大理石肉，按生产目标进行公/阉牛区分、预期出栏、分段调控即可；生产西餐红肉个体，也可以用来生产大理石肉，按生产目标进行公/阉牛区分、预期出栏、分段调控即可；反之不可。

以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种以肉质为目标导向的肉牛育肥方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（1）眼肌面积检测及分类，通过超声波技术对待测犊牛进行眼肌面积检测，计算眼肌面积数值，具体是：

（1.1）对犊牛进行保定，以确保其自然站立；

（1.2）测量时探头放上耦合剂，剪掉测量部位毛，探头直接放在体表；腰肌面积在横断面第十二、十三肋间测量，腰肌面积是一个圆周测量；在识别超声影像时首先确定皮肤界面、脂间结缔组织和背最长肌肌膜所产生的 3~4 条强回声影带，然后确定眼肌四周肌膜的强回声影像，以确定眼肌面积周界；观察并调节屏幕影像，调节灰度、对比度、增益度，使近场增大，远场减小，获得理想影像时即冻结影像，并加注说明资料影像打印或存贮处理；图像读取时先确定上下界即椭圆短轴，然后确定两端界点即为椭圆长轴；此时屏幕上显示的平方厘米值就是近似椭圆形的眼肌的面积；

（1.3）眼肌面积的大小范围，分为“偏大、中等偏上、其它”3个档次，对群体待测数据进行测定，计算平均值P1，选出最大值Max，进而计算最大值与平均值的平均数P2；大于等于P2的个体，归类为“偏大”；大于等于P1，小于P2的个体归类为“中等偏上”；小于P1的个体归类为“其它”；

步骤（2）待选基因的检测与分型，通过PCR-SSCP技术进行2组基因，CAPN1+CAST、GH+GHR的检测及分型，具体是：

（2.1）引物设计：设计以下引物序列

CAPN1基因Intron14上游引物序列：5’-GACAGGAATACAGTAGGGAC-3’

CAPN1基因Intron14下游引物序列：5’-GAGAACAGCTACCCAGGGAC-3’

CAST基因Intron3上游引物序列：5’-CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC-3’

CAST基因Intron3下游引物序列：5’-TACACCCTGCTTTGTCCTCCA-3’

GH基因3‘UTR上游引物序列：5’-CACTCCCACTGTCCTTTCCTA-3’

GH基因3‘UTR下游引物序列：5’-ACTTCCTCACATGTTGGAGGC-3’

GHR基因Exon10上游引物序列：5’-TAACTTCATCGTGGACAA-3’

GHR基因Exon10下游引物序列：5’-GGAGGTATAATCTGGGAC-3’

（2.2）根据已设计的引物，按照以下PCR 反应体系和条件进行扩增

PCR反应体系：10×Ex Taq Buffer 2.5μl；dNTP Mixture2.0μl；模板 DNA1.0μl；上游引物F、下游引物R各1.0μl，浓度均为10pmol/μl；浓度为5U/μl的Ex Taq 0.25μl，ddH₂O17.25μl，总体积 25.0μl；其中，10×Ex Taq Buffer 表示10倍ExTaq酶缓冲液；dNTPMixture表示dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液，每种的浓度均为2.5mM，mM表示毫摩尔每升；Ex Taq表示Ex Taq DNA聚合酶；ddH₂O表示双蒸水；

反应条件：95℃预变性 5min 后进入如下循环：94℃变性 30s，60－65℃退火30-45s，72℃延伸 30-45min，30-35 个循环，然后 72℃延伸 10min，4℃保存；

（2.3）PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳：所有凝胶电泳均用浓度为 1％琼脂糖/EB 凝胶，在1×TAE 缓冲液下进行；10μlPCR扩增产物与 1/6 体积6×Loading Buffer混匀，加样至点样孔中，以 7～10V/cm的电压电泳，当溴酚蓝电泳至2~4cm，在紫外灯下观察结果并用凝胶成像仪观察，照相，PCR产物条带清晰，大小符合预期设计结果，进行下一步分析；其中1×TAE 缓冲液的配置：先配置50×TAE缓冲液:Tris 242g，冰乙酸57.1m1，pH 值为8.0、浓度为0.5M 的EDTA 100m1，加水至1000ml，然后稀释50倍以后即可得到1×TAE 缓冲液；

（2.4）扩增产物的 PCR-SSCP 分析：体积为40ml的非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳根据不同的扩增片段，采用浓度为30%的丙烯酰胺配成浓度为8%～12%的聚丙烯酰胺凝胶；清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干后，用大号铁夹固定，并用 0.8%琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙；在 100 ml 烧杯内加入浓度为30%丙烯酰胺 12.0 ml，5.0 ml的浓度为50%甘油，5×TBE缓冲液10.0 ml，浓度为10%过硫酸铵 350μl，TEMED 8 μl，加入双蒸水 13.0ml，混合后迅速灌胶；当胶灌至离玻璃板上沿 1.0 cm 时停止灌胶，插入梳子，室温聚合 30 min，多余的丙烯酰胺 4℃保存；随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺；凝胶聚合好后，拔掉梳子，向电泳槽加入 1×TBE，用注射器冲洗加样孔；预电泳 10 min，同时准备点样；取 1 μl PCR 产物置于 PCR 管中，加 5 μl 变性Buffer，离心混匀，98℃变性 10min；迅速冰浴 10 min，用微量注射器点样；4℃，140～180V，电泳 14～16 h；电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶，置于400~600ml浓度为70%的乙醇中，水浴震荡器缓慢摇匀固定 10~15 min；去离子水洗胶 2 遍，每次 2 min，洗去乙醇；用 200 ml 染色液染色 30 min；去离子水洗胶 3 遍，每次 2 min，洗去多余的染色液；用 200 ml 显色液显色，10～30 min，当 DNA条带清晰时，倒掉显色液；去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相或保存，然后进行基因分型；其中，浓度为30%的丙烯酰胺的配置是29克丙烯酰胺和1克双丙烯酰胺，用蒸馏水定容100ml，过滤后使用；5×TBE缓冲液：Tris碱54g，硼酸27.5g，pH值为8.0、浓度为0.5M 的EDTA 20ml，加水至1000ml所得；0.5M EDTA配置方法为：EDTA186.1g溶于800m1双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌后使用；1×TBE即5×TBE缓冲液稀释5倍后所得溶液；

步骤（3）根据眼肌面积与基因分型结果，确定育肥模式，具体是：

（3.1）眼肌面积中等偏上，或检测到CAPN1_BB基因型+CAST_AA基因型的个体，用于生产高档雪花肉，育肥阉牛至26-30月龄，采取“生长发育期+营养平衡期+肉质改良期”三段式育肥模式；

（3.2）眼肌面积偏大，或检测到GH_BB基因型+GHR_AA基因型的个体，生产西餐红肉，育肥公牛至16-20月龄，采取“生长发育期+肉质改良期”两段式育肥模式；

（3.3）其它牛生产大理石肉；

步骤（4）公、阉牛区分：选择对象为公牛，正常育肥；选择对象为阉牛，阉割后育肥；

步骤（5）出栏时间：分为26-30月龄、16-20月龄、20-22月龄、22-24月龄4种；

步骤（6）分段式营养调控：三段式育肥或两段式育肥；三段式育肥中生长发育期日粮精粗比为40:60；日粮干物质含量为63.1％，采食量为15.2kg/d·头，干物质采食量为9.6kg/d·头。

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