CN110157809B - 一种鸡CEL基因启动子99bp indel多态性标记检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种鸡CEL基因启动子99bp indel多态性标记检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鸡CEL基因启动子99bp indel多态性标记检测试剂盒及其应用，属于分子遗传学育种技术领域。本发明发现了CEL基因启动子99bp indel多态性标记，可用于鸡的辅助选择和分子育种；具体的，依据如SEQ ID NO.1所示的序列设计扩增查无包含该序列5‘端起的第183‑281位的引物，根据扩增产物的大小判断第183‑281位缺失/不缺失，进而判断检测样本为DD、II或ID基因型，通过加强对DD基因型个体的选育，来提高地方鸡的屠宰性能。本发明建立的应用方法无需酶切，分辨率高、判型准确、操作简单、成本低、周期短，不需要特殊的仪器，易推广普及。

Description

一种鸡CEL基因启动子99bp indel多态性标记检测试剂盒及 其应用
技术领域
本发明涉及一种鸡CEL基因启动子99bp indel多态性标记检测试剂盒及其应用，属于 生物育种技术领域。
背景技术
生长性能与屠体性状作为畜禽主要的经济性状，如何在种质特性不改变的情况下提高 地方畜禽品种的经济性状，维护地方畜禽的可持续发展，借助现代分子标记就显得尤为重 要。
羧基酯脂肪酶(CEL)，是胰腺腺泡外分泌的一种脂肪酶，它们是无活性的酶原，但分 泌到十二指肠后，经胆盐激活后参与水解各种脂酯(胆固醇酯、甘油三酯、磷酯、脂溶性维生素等)。研究表明CEL基因可变数目串联重复序列突变后，水解的功能减退或丧生， 可以导致MODY-胰外分泌综合征、胰岛素依赖型糖尿病(1型糖尿病)或非胰岛素依赖型 糖尿病(2型糖尿病)及酒精性胰腺炎等胰腺外分泌疾病。
因此，CEL基因与家禽的生长性状及屠宰性状可能有较大的联系，但是该基因的突变 及其对于家禽生长及屠宰相关性状的影响还未有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡CEL基因启动子99bp indel多态性标记，该标记与鸡的生 长性能及屠体性状相关性高。
本发明还提供了上述多态性标记的应用。
本发明还提供了上述CEL基因启动子99bp indel多态性标记的检测引物及检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种鸡CEL基因启动子99bp indel多态性标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， 5‘端起第183-281位插入或缺失。
上述的多态性标记位于CEL基因的启动子部位，99bp缺失发生在CEL基因上游4309与4310位点之间，鸡基因序列的NCBI GenBank登录号NC_006104。本发明首次检测了CEL基因启动子99bp indel多态性标记在不同品种中的分布，并通过分析其在不同品种鸡 的基因型分布及等位基因频率，及其与F2资源群体经济性状进行关联分析发现该多态性标 记与鸡生长性状密切相关，为筛选出纯合高品质的地方鸡群体奠定基础。该多态性标记可 以作为分子探针，用于分子杂交，以判断待测样品的基因型。
上述的多态性标记在鸡生长性状和/或屠宰性状选育中的应用。具体的，在鸡体重、胫 长、胫围、胸宽、胸骨长、全净膛、半净膛、皮脂、胸肌重、腿重、腿肌重、皮脂率、头 率、头重、心脏率、肌胃率、胸肌重率和/或腿失水率性状选育中的应用。优选的，在鸡胫 长、胫围、胸宽、胸骨长等生长性状及全净膛、皮脂、胸肌重、腿重、肌胃率、胸肌重率、 腿失水率、心脏率等屠宰性状选育中的应用。
本发明的新发现的多态性标记可用于鸡的辅助选择和分子育种，有助于节省生产成本 并加快遗传选育进展，具有很大的经济应用价值和科研价值。
上述的多态性标记的应用是通过检测如SEQ ID NO.1所示序列5‘端起第183-281位插 入或缺失，选择该片段缺失纯合型的鸡个体，弃去该片段不缺失或者单染色体缺失基因型 的鸡个体。本发明中发现如SEQ ID NO.1所示序列5‘端起第183-281位缺失纯合型的鸡体 重及屠宰性状明显优于该片段不缺失或者单染色体缺失基因型的鸡个体。
具体的，通过PCR扩增检测第183-281位插入或缺失，所述PCR扩增时使用的引物如下所示：上游引物P-F：5‘-GTCACTCAGAGGCTCCCTTT-3’；
下游引物P-R：5‘-TGGCTAGGAACCCACGATAC-3’。
所述扩增的反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 5.00μL，ddH2O 3.00μL，P-F 0.5μL， P-R 0.5μL，DNA模板1.0μL。所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变 性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
在PCR扩增后，可通过琼脂糖凝胶电泳检测所述PCR扩增的产物的条带大小，以判断所述第183-281位是否缺失。具体的，当在启动子区包含99bp插入时，扩增产物为一条带，条带大小为345bp，命名为II基因型；当在启动子区发生99bp缺失时，扩增产物为一 条带，条带大小为246bp，命名为DD基因型；当该位点为杂合的个体时，扩增产物为两 条带，条带大小分别为345bp和246bp，命名为ID基因型。
CEL基因99bp indel多态性与F2资源群的经济性状的关联性分析表明多态性与鸡的部 分重要生产性状有显著关联，D等位基因即99bp的缺失利于鸡的生长，I等位基因即99bp 的插入不利于鸡的生长发育，DD基因型为优势基因型。
本发明采用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物的结果，是一种在DNA水平上筛查和检测与鸡生长性状密切相关的分子遗传标记。所述琼脂糖凝胶电泳检测所用的琼脂的质量分数为2.5％。所述琼脂糖凝胶电泳的电压为120V，电泳时间为40min。
本发明建立的分子生物学方法不需要酶切，分辨率高、判型准确、操作简单、成本低、 周期短，大大提高了该位点基因型判定的准确性，不需要特殊的仪器，易推广普及。试验 表明本发明的方法能有效地判定鸡CEL基因99bp indel多态性的基因型，可以用于鸡的经 济性状位点的分子标记辅助选择，进而建立一个纯合高产的地方鸡种群。
一种鸡CEL基因启动子99bp indel多态性的检测引物，依据如SEQ ID NO.1所示的序 列设计，所述检测引物的扩增片段覆盖该序列5‘端起的第182-282位。该引物采用现有技 术中常用的设计方法，也可以根据检测方法的不同进行设计。
具体的，所述引物序列如下所示：
上游引物P-F：5‘-GTCACTCAGAGGCTCCCTTT-3’；
下游引物P-R：5‘-TGGCTAGGAACCCACGATAC-3’。
包含上述检测引物的检测试剂盒。具体的，还包括dNTPs、PCR反应缓冲液、DNA 聚合酶中的一种或几种。
本发明的检测引物及试剂盒，检测结果准确可靠，可操作性强，不需要特殊的仪器， 易推广普及，可以用于鸡的辅助选择和分子育种。
附图说明
图1为本发明实施例4的技术流程示意图；
图2为提取的鸡基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；
图3为鸡CEL基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为鸡CEL基因插入、缺失基因型测序图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例中 所用的设备和试剂均常规市售可得。
实施例1
本实施例中鸡CEL基因启动子99bp indel多态性标记，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1 所示，5‘端起第183-281位插入或缺失。
该多态性标记中99bp缺失发生在CEL基因上游4309与4310位点之间，该基因序列的NCBI GenBank登录号为NC_006104。
实施例2
本实施例中鸡CEL基因启动子99bp indel多态性标记的检测引物如下所示：
上游引物P-F：5’-GTCACTCAGAGGCTCCCTTT-3’；
下游引物P-R：5’-TGGCTAGGAACCCACGATAC-3’。
实施例3
本实施例中用于鸡CEL基因启动子99bp indel多态性标记的检测试剂盒包括如实施例 2所示的引物，还包括dNTPs、PCR反应缓冲液、DNA聚合酶。
实施例4
本实施例中鸡CEL基因启动子99bp indel多态性标记的应用，其实验思路如图1所示： 通过PCR鉴定待测样本99bp indel多态性标记的基因型，最终根据基因型结果，纯合育种 需要选留优势基因型个体。包括如下步骤：
(1)试样的制备与保存
动物材料：淅川乌骨鸡、卢氏鸡、长顺鸡、固始鸡、东乡鸡、罗曼鸡、海兰鸡、AA 肉鸡的血液DNA均由河南农业大学家禽种质资源创新工程研究中心提供。DNA样品均保 存于-20℃冰箱保存备用，随机挑选12个AA肉鸡的血液DNA进行质量检测，基因组的检 测结果如图2所示。从图中可以看出，这些鸡基因组的质量非常高。
(2)引物设计
以CEL基因序列(GenBank Accession NC_006104)为模板设计引物对P，
上游引物P-F：5’-GTCACTCAGAGGCTCCCTTT-3’；
下游引物P-R：5’-TGGCTAGGAACCCACGATAC-3’。
(3)PCR扩增
以引物对P为引物，建立了10.0μL扩增体系：2×Taq PCR MasterMix(购自北京康为公司)5.00μL，ddH2O 3.00μL，P-F 0.5μL，P-R 0.5μL，DNA模板1.0μL。
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30 个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
(4)琼脂糖凝胶电泳
称取2.5g的琼脂糖，转入三角瓶中，加入1×TBE100ml，微微震荡使其悬浮，微波炉中火加热，待沸腾拿出冷却至65℃后向其中加入6ul的DNA核酸染料，充分混匀后快速 将琼脂糖溶液倒入已制备好的胶板里，注意防止出现气泡。经过20min待琼脂糖凝胶完全 冷却凝固后，拔掉梳子，将凝胶移入电泳槽中。取5ul的PCR扩增产物，上样至琼脂糖凝 胶的梳孔中，120V电压电泳40min。
(5)凝胶成像系统成像
结果如图3所示，泳道7、11、13为扩增产物，其片段大小为246bp，从图中可以看 出其与理论设计的大小一致，因此可以证明已成功扩增出鸡CEL基因启动子区的片段。其 中，泳道1：DNA Marker(2000，1500，1000，750，500，250和100bp)；泳道2、3、6、 8泳道为一条带，条带大小为345bp，命名为基因型II。泳道7、11、13扩增产物为一条带， 条带大小为246bp，命名为基因型DD；泳道4、5、9、10、12泳道为两条带，条带大小为 345bp和246bp，命名为基因型ID基因型。
(6)扩增产物测序
选取不同基因型个体的PCR扩增产物进行测序，发现鸡CEL基因启动子区中存在99bp indel位点，结果见图4。插入时为II基因型如图4(a)，缺失时为DD基因型如图4(b)，该位点为杂合个体时，为ID基因型。其中(a)图虚线框内为99bp的插入序列，b图箭头 处为99bp插入位点。测序结果与琼脂糖凝胶电泳判别的基因型完全相同，证实了本检测 方法的有效性和准确性。
(7)鸡CEL基因99bp indel位点在不同鸡品种中基因型分布及等位基因频率统计
等位基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率，取值在0～1之间。 CEL基因99bp indel在不同品种鸡中基因型及等位基因频率分布如下表1。
表1CEL基因99bp indel在不同品种鸡中基因型及等位基因频率分布
Figure BDA0001578041020000051
(8)鸡CEL基因99bp indel多态性与F2资源群体经济性状的关联分析
F2资源群体中有794个个体具有完整经济性状记录用于该多态位点的关联分析。经济 性状测定方法如下：每2周测定体重、每4周测量体尺指标，饲喂至12周龄时屠宰。宰前停料12小时(不停水)后称重。测定的生长、屠宰指标及肉质指标共57项指标(参考 Han RL,Li Z J,Li M J,et al.Novel 9-bp indel in visfatin gene and its associationswith chicken growth.Br Poult Sci,2011,52(1):52-57.)。
(9)关联分析模型
利用SPSS(20.00)软件分析基因位点与经济性状的相关性。确保每个性状数据呈正 态分布，再利用最小二乘法分析对数据校正根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型 效应和benferroni多重比较法比较各基因型间的差异，结果见表2、3。
表2 F2资源群体中CEL基因99bp多态性与鸡生长性状的关联分析
Figure BDA0001578041020000061
表3 F2资源群体中CEL基因99bp多态性与鸡屠宰性状的关联分析
Figure BDA0001578041020000062
Figure BDA0001578041020000071
注：同一行字母相同为差异不显著，不同字母为差异显著。
表2、3关联分析结果显示：该突变99bp多态性与8周的胫长、胫围、胸宽生长性状极显著相关(P<0.01)，与4周胸骨长显著相关(P<0.05)。另外与全净膛、皮脂、胸肌重、 腿重、肌胃率、胸肌重率、腿失水率、心脏率等屠宰性状显著相关(P<0.05)。我们发现， DD基因型个体的体重以及体尺指标数值都高于II基因型，显示DD基因型为优势基因型， 我们可以加强对DD基因型个体的选育，来提高地方鸡的屠宰性能。
<110> 河南农业大学
<120> 一种鸡CEL基因启动子99bp indel多态性标记检测试剂盒及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<211> 345
<212> DNA
<213> 鸡
<221> 含99bp插入的CEL基因启动子特异分子标记
<400> 1
gtcactcaga ggctcccttt atggcacgta acatatatat atgaataaat atacacacac 60
agtgtgatcc agctcctcct aaagtatgca tctaaaatag gactgagaag tcatgtcctt 120
aatgcacctt gttctcccac cgatcagaaa gggagcctag cacatacaga tatctaaagt 180
tacgtgggat gagtcgcact cttgtggtct ctgcactgct ctcaggctac gtttctcaca 240
gctggttctg ttccagtcca cagcctccag ctctcctcct gctctccatg cagagaggtt 300
gctcatggcc atttaatttc tctgtgtatc gtgggttcct agcca 345
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 上游引物P-F
<400> 2
gtcactcaga ggctcccttt 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 下游引物P-R
<400> 3
tggctaggaa cccacgatac 20

Claims (3)

1.一种鸡CEL基因启动子99bp indel多态性标记在鸡生长性状和/或屠宰性状选育中的应用，其特征在于：所述多态性标记核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，5‘端起第183-281位插入或缺失，所述应用为检测如SEQ ID NO. 1 所示序列5 '端起第183-281 位插入或缺失，选择该片段缺失纯合型的鸡个体，弃去该片段不缺失或者单染色体缺失基因型的鸡个体；所述鸡生长性状是指鸡的胫长、胫围、胸宽以及胸骨长；所述鸡屠宰性状是指鸡的全净膛、皮脂、胸肌重、 腿重、头率、心脏率、肌胃率、胸肌重率、腿失水率。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：通过PCR扩增检测第183-281位插入或缺失，所述PCR扩增时使用的引物如下所示：
上游引物P-F：5‘- GTCACTCAGAGGCTCCCTTT -3’；
下游引物P-R：5‘- TGGCTAGGAACCCACGATAC -3’。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：通过琼脂糖凝胶电泳检测所述PCR扩增的产物的条带大小，以判断所述第183-281位是否缺失。
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